专利名称：用于免疫分析的免疫抑制剂药物提取试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断性免疫分析，来测定患者血液样品中的免疫抑制剂药物的浓度水 平，特别地，涉及改进的免疫抑制剂药物提取试剂组合物的用途。背景临床上感兴趣的许多被分析物被细胞摄取，或变为与测试样品的一种或更多种其 他成分一起复合。因而，为了获得样品中存在的被分析物数量的精确测量，优选的是在一定 条件下处理样品和/或进行分析，从而所述被分析物从所述细胞或其他成分上释放用于在 分析中检测。例如，免疫抑制剂药物，如西罗莫司(也称为雷帕霉素)、他克莫司、依维莫司、 temsorolimus和环孢霉素对于人类中移植手术后的器官或组织排斥、移植物抗宿主疾病和 自体免疫疾病的治疗是有效的。在免疫抑制剂药物治疗期间，监测免疫抑制剂的血液浓度 水平是临床护理的重要方面，因为不足的药物水平导致移植物(器官或组织)排斥，过多的 水平导致非期望的副作用和毒性。因而，测量免疫抑制剂的血液水平，从而药物剂量可以被 调节，以将药物水平维持在合适的浓度。用于免疫抑制剂血液水平的测定的诊断性分析因 而具有广泛的临床应用。首先，免疫抑制剂必需从患者样品的其他成分中提取和分离。患者样品中的免疫 抑制剂药物的主体，以与各种“载体”分子例如结合蛋白的复合物存在。西罗莫司、他克莫 司和环孢霉素主要在患者样本的红血细胞中发现，并与特定的结合蛋白缔合，他克莫司和 西罗莫司为FKBP，环孢霉素为亲环素(cyclophilin)。为了确保样本中总药物浓度的精确 测量，结合到结合蛋白的药物优选地在定量之前释放。在从结合蛋白提取之后，药物可以按 许多不同的方式测量，包括，利用吸光度的免疫分析或色谱，或质谱检测。西罗莫司从血液中它的结合蛋白的提取通常通过用有机溶剂，例如，乙腈、甲醇或 二乙醚处理来实现。这些溶剂使结合蛋白变性并释放所述药物。然而当随后使用免疫分析 来检测释放的药物时，有机溶剂的使用可能是有问题的，因为，将使结合蛋白快速和完全地 变性的大多数有机溶剂与免疫分析不是相容的。它们要么太苛刻，要么它们产生双相的样 品。甲醇一般被用于在免疫分析之前从血液样本提取西罗莫司、他克莫司或环孢霉素。然 而，必需实现小心的平衡，从而甲醇浓度足以从结合蛋白释放药物，但是又不过大而干扰随 后的免疫分析。甲醇和其他一般使用的有机溶剂的利用产生了另外的难题，因为这些溶剂 具有比水更高的蒸气压。结果，含有免疫抑制剂药物的提取上清液快速地蒸发，这导致药物 浓度的测量方面的不精确。广泛使用的甲醇或乙腈溶剂还产生了实验室的操作和处理问 题。免疫抑制剂药物的免疫分析是以多种形式可获得的，但是都利用了抗体或结合蛋 白(例如，FKBP)与免疫抑制剂药物的结合。通常使用的免疫分析是如下分析，其涉及第一 抗体与免疫抑制剂的结合，以及标记的免疫抑制剂(例如，吖啶错-西罗莫司)与其余自由 的抗体结合位点的结合，随后通过标记物的检测来定量。这些免疫分析的有效性受到对所 使用的免疫抑制剂的特定提取和变性溶剂的影响。
本发明的目的是提供与免疫分析一起使用的改进的免疫抑制剂药物提取试剂组 合物，其具有低蒸气压、与水可混合、足够的免疫抑制剂变性能力和与免疫分析试剂的相容 性。这样的提取试剂组合物对非免疫分析方法(例如，色谱测定)也将是有益的，因为低蒸 气压、足够的变性能力和水混溶性将使得这些方法容易使用。概述本发明提供了用于从血液样品提取免疫抑制剂药物，同时产生具有低蒸气压和与 免疫分析成分相容的测试样品提取物的改进的提取试剂组合物和方法，所述免疫抑制剂药 物例如，西罗莫司、他克莫司、依维莫司、temsolorimus、zotarolimus、环孢霉素或其类似 物。本发明的试剂组合物包含二甲亚砜(DMSO)，至少一种二价金属盐和水。本发明的优选 的试剂组合物包含DMS0，以及硫酸锌、醋酸锌、硝酸锌、氯化锌、硫酸镉、硫酸铜，以及这些金 属盐的两种或更多种的混合物中的至少一种。一种更优选的试剂组合物包含DMS0、金属盐 和具有两个到六个碳原子的至少一种二醇，其优选的是乙二醇(EG)、丙二醇(PG)，或EG和 PG的混合物中的至少一种。虽然DMS0、EG和PG是在水中可混溶的以及是常规实验室使用 的低蒸气压溶剂，它们没有被用作蛋白质变性剂，反而常常作为稳定剂添加到蛋白质和细 胞混合物。相比之下，我们发现，在存在二价金属阳离子的情况下，更高浓度下的DMSO可以 充当有效的蛋白质变性剂来释放免疫抑制剂药物。此外，在存在二价阳离子的情况下，当与 EG或PG混合时的较低浓度的DMSO也可以充当有效的蛋白质变性剂，虽然在独立使用时该 溶剂的浓度不是致变性的。这些组合的每一种的使用所产生的测试样品提取物具有低蒸气 压，并且是与免疫化学分析相容的。本发明还包括检测测试样品中免疫抑制剂药物的浓度水平的方法，包括步骤(a) 将包含DMS0、二价金属盐和水的提取试剂组合物与所述测试样品组合来形成测试样品提取 物；(b)将所述测试样品提取物与至少一种抗体或蛋白质组合来形成分析混合物，所述抗 体或蛋白质对免疫抑制剂药物是免疫反应性的；(c)在适合于所述抗体和如果有的话、存 在于样品中的所述免疫抑制剂药物之间形成复合物的条件下孵育所述分析混合物；和(d) 检测形成的任何复合物的存在。步骤(d)中复合物的存在的检测可以利用其上附着了信号 产生化合物的免疫抑制剂以结合到被分析物上的其余自由的抗体结合位点来进行。进一步 的实施方式提供了步骤(d)中复合物的存在的检测利用可检测的抗体来进行，所述可检测 的抗体结合步骤(c)中形成的复合物。本发明还包括用于分析免疫抑制剂药物的血液水平的试剂盒，其包含含有所述提 取试剂组合物的容器，所述提取试剂组合物包含DMS0、至少一种二价金属盐和水，更优选的 还包含乙二醇、丙二醇、或任何适合的二醇类似物，或其混合物。优选的，所述试剂盒进一步 包含第二容器，其具有特异于所述免疫抑制剂药物的至少一种抗体或蛋白质。更优选的，所 述试剂盒含有第三容器，所述第三容器含有包含免疫抑制剂药物的对照组合物，所述免疫 抑制剂药物例如，选自由西罗莫司、他克莫司、依维莫司、zotarolimus、环孢霉素和其类似 物构成的组的免疫抑制剂。本发明具有显著的能力来提供更高敏感性的免疫分析，用于测定西罗莫司、他克 莫司、依维莫司、temsorolimus、zotarolimus和环孢霉素的血液浓度水平。本发明的提取 试剂浓度容许药物水平的更精确的测量，同时为临床实验室提供了更容易的使用。附图的简要描述
附
图1显示了利用DMSO和硫酸锌对来自血液样品的西罗莫司的提取的实验结果。附图2显示了利用DMSO和变化数量的硫酸锌对来自血液样品的西罗莫司的提取 的实验结果。附图3显示了利用DMS0、EG和硫酸锌对来自血液样品的西罗莫司的提取的实验结果。附图4显示了加热来自血液样品和本发明的提取试剂组合物的提取混合物的实
验结果。附图5显示了来自现有技术的甲醇变性剂的使用和来自本发明的使用的样品提 取物蒸发速率的比较。详细说明I.概述本发明包括提取试剂组合物，其对于来自血液样品的免疫抑制剂药物例如西罗莫 司的提取和变性是有用的；利用本发明的提取试剂组合物定量免疫抑制剂药物水平的方 法；以及包含本发明的提取试剂组合物的诊断试剂盒。本发明的优选的方法包括免疫分 析，其利用免疫反应性特异性结合成分，例如，单克隆或多克隆抗体，或结合蛋白(例如， FKBP)，用于与免疫抑制剂药物被分析物的复合物的形成。定义除非另作说明，在权利要求和说明书中使用的术语按如下阐述的定义。如在此使用的，“免疫抑制剂药物”或“免疫抑制剂”是指基于小分子或抗体的治 疗化合物，其与雷帕霉素(西罗莫司)或环孢霉素、也称为环孢霉素A具有相同的或相似的 化学结构。任何已知的或以后开发的雷帕霉素或环孢霉素的类似物被认为是此处的免疫抑 制剂。优选的免疫抑制剂包括西罗莫司、他克莫司、依维莫司、temsorolimuLzotarolimus 和环孢霉素。他克莫司和环孢霉素是calcineurin抑制物，其抑制免疫系统的T淋巴细胞 通过细胞因子如白细胞介素2的抑制作用的早期活化。相比之下，西罗莫司、依维莫司和 zotarolimus的主要靶点是雷帕霉素(mTOR)，一种特定的细胞周期调节蛋白，的哺乳动物 靴点。mTOR的抑制作用导致细胞因子驱动的T-淋巴细胞增殖的抑制。环孢霉素的化学式在式A中。西罗莫司(雷帕霉素)的化学式在式B中。依维莫 司(RAD)与西罗莫司的结构差异的化学式在式C中。
权利要求
一种用于人类血液样品中免疫抑制剂药物的浓度的评估的方法，包括用包含二甲亚砜、至少一种二价金属盐和水的提取试剂组合物接触人类血液样品。
2.权利要求1的方法，其中所述提取试剂组合物进一步包含乙二醇、丙二醇、二醇类似 物或其混合物。
3.权利要求1的方法，进一步包含从任何产生的上清液相中分离产自所述人类血液样 品与所述提取试剂组合物的接触的任何固相，并分析所述上清液相的免疫抑制剂药物。
4.权利要求1的方法，其中所述免疫抑制剂药物选自由西罗莫司、他克莫司、依维莫 司、zotarolimus、环孢霉素或其类似物构成的组。
5.权利要求2的方法，其中在所述提取试剂组合物中二甲亚砜的浓度按照体积是变性 试剂组合物的至少约50%。
6.权利要求2的方法，其中在所述提取试剂组合物中二甲亚砜的浓度按照体积是变性 试剂组合物的至少约30%。
7.权利要求1到6的任一项的方法，其中所述二价金属盐包含硫酸锌、醋酸锌、硝酸锌、 氯化锌、硫酸镉、硫酸铜或两种或更多种这些金属盐的混合物。
8.权利要求1到6的任一项的方法，其中所述提取试剂组合物具有在20摄氏度和标准 大气压下低于水蒸气压的蒸气压。
9.权利要求1到6的任一项的方法，其中所述提取试剂组合物在至少约30摄氏度的温 度下与血液样品接触。
10.一种用于从血液样品提取免疫抑制剂药物的提取试剂组合物，包含二甲亚砜、至少 一种二价金属盐和水。
11.权利要求10的提取试剂组合物，进一步包含乙二醇、丙二醇、二醇类似物或其混合物。
12.权利要求10的提取试剂组合物，其中在所述提取试剂组合物中二甲亚砜的浓度按 照体积是所述提取试剂组合物的至少约50%。
13.权利要求11的提取试剂组合物，其中在所述提取试剂组合物中二甲亚砜的浓度按 照体积是所述提取试剂组合物的至少约50%。
14.权利要求11的提取试剂组合物，其中在所述提取试剂组合物中二甲亚砜的浓度按 照体积是所述提取试剂组合物的至少约30%。
15.权利要求10到14的任一项的提取试剂组合物，其中所述提取试剂组合物包含选自 由硫酸锌、醋酸锌、硝酸锌、氯化锌、硫酸镉、硫酸铜或两种或更多种这些金属盐的混合物构 成的组的二价金属盐。
16.权利要求10到14的任一项的提取试剂组合物，其中所述提取试剂组合物包含硫酸锌。
17.权利要求10到14的任一项的提取试剂组合物，其中所述提取试剂组合物包含醋酸锌。
18.一种用于人类血液样品中免疫抑制剂药物的浓度的评估的方法，包括用包含二甲 亚砜、至少一种二价金属盐和水的提取试剂组合物接触人类血液样品，来产生固相和上清 液相，分离所述上清液相，以及通过免疫分析来分析所述上清液相以确定免疫抑制剂药物 的浓度。
19.权利要求18的方法，其中所述提取试剂组合物进一步包含乙二醇、丙二醇或其混 合物。
20.权利要求18的方法，其中所述免疫抑制剂药物选自由西罗莫司、他克莫司、依维莫 司、zotarolimus、环孢霉素或其类似物构成的组。
21.权利要求18的方法，其中在所述提取试剂组合物中二甲亚砜的浓度按照体积是变 性试剂组合物的至少50%。
22.权利要求18的方法，其中在所述提取试剂组合物中二甲亚砜的浓度按照体积是变 性试剂组合物的至少约30%。
23.权利要求18到22的任一项的方法，其中所述二价金属盐包含硫酸锌、醋酸锌、硝酸 锌、氯化锌、硫酸镉、硫酸铜或两种或更多种这些金属盐的混合物。
24.权利要求18到22的任一项的方法，其中所述提取试剂组合物在至少30摄氏度的 温度下与血液样品接触。
25.一种包含独立的容器的测试试剂盒，所述容器各自含有成分，所述成分选自(a)能 够特异性结合至少一种免疫抑制剂药物的至少一种抗体或蛋白质，所述免疫抑制剂药物选 自由西罗莫司、他克莫司、依维莫司、zotarolimus和环孢霉素构成的组；和(b)包含二甲亚 砜、至少一种二价金属盐和水的提取试剂组合物。
26.权利要求25的测试试剂盒，进一步包含含有对照组合物的容器，所述对照组合物 包含选自由西罗莫司、他克莫司、依维莫司、zotarolimus和环孢霉素构成的组的至少一种 免疫抑制剂药物。
27.权利要求25或26的测试试剂盒，其中所述二价金属盐包含硫酸锌、醋酸锌、硝酸 锌、氯化锌、硫酸镉或硫酸铜。
28.权利要求25或26的测试试剂盒，其中所述提取试剂组合物进一步包含乙二醇、丙 二醇、二醇类似物或其混合物。
29.一种包含独立的容器的测试试剂盒，所述容器各自含有成分，所述成分选自(a)能 够特异性结合至少一种免疫抑制剂药物的至少一种抗体或蛋白质，所述免疫抑制剂药物选 自由西罗莫司、他克莫司、依维莫司和环孢霉素构成的组；和(b)提取试剂组合物，其包含 按照体积的所述提取试剂组合物的约50%的二甲亚砜，按照体积的所述提取试剂组合物的 约30% -33%的乙二醇、丙二醇或其混合物，水，和至少5mM的浓度的硫酸锌；和包含至少一 种免疫抑制剂药物的对照组合物，所述免疫抑制剂药物选自由西罗莫司、他克莫司、依维莫 司、zotarolimus和环孢霉素构成的组。
30.权利要求29的测试试剂盒，其中所述测试试剂盒包含西罗莫司。
全文摘要
一种用于从血液样品提取免疫抑制剂药物，例如西罗莫司、他克莫司或环孢霉素，而产生具有低蒸气压和与免疫分析成分相容的测试样品提取物，的改进的提取试剂组合物和方法。本发明的试剂组合物包含二甲亚砜(DMSO)，至少一种二价金属盐和水。这些组合的每一种的使用所产生的样品提取物具有低蒸气压，并且与免疫化学分析是相容的。
文档编号G01N33/53GK101946179SQ200780102326
公开日2011年1月12日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者F·C·格勒尼耶, H·N·赛德, R·F·沃克曼, S·阿利 申请人:雅培制药有限公司