专利名称：：预测中药有效成分静脉注射剂成药性的方法
技术领域：
：本发明涉及预测中药有效成分静脉注射剂成药性的方法，属于生物医药领域。技术背景中药静脉注射剂是指中药注射剂是指以中医药理论为指导，采用现代科学技术和方法，从中药或天然药物的单方或复方中提取的有效物质制成的无菌溶液、混悬液或临用前配成溶体的灭菌粉末供注入体内的制剂(摘自《中药注射剂学》，赵新光著，广东科技出版社2000年出版)，因为中药有效成份95%来自植物类中药提取物，故本发明所涉及不溶性有效成份亦指植物类中药提取物。随着临床中药注射剂应用不断增多，中药注射剂的品种、规格越来越多，随之而来的是相关不良反应(ADR)报告呈逐年明显增长的趋势。在所有中药引起的ADR中，ADR发生比例较高，危害最大的是注射剂，约占75%,更多可能引起严重ADR的是中药静脉注射剂，其ADR具有其明显特点多发性与普遍性，临床表现的多样性、涉尿多系统、多器官，不可预知性，同一品种批与批之间ADR具有差异性。研究表明，植物类中药静脉注射剂中水不溶性成分是影响中药静脉注射剂安全性的主要因素中药注射液成分复杂，多含酶、甙、多肽、多糖、鞣质、角质蛋白等大分子物质，注射给药后，这些大分子物质作为抗原，与人类血清蛋白的结合物有髙度致敏活性，导致变态反应(王晓瑜等.中药静脉滴注引发的不良反应的探讨及防范.中国临床医学，2005，12(4):732);又因市售输液器对15拜以下微粒无明显去除效果，而人体细小毛细血管直径仅47pm，所以大量不溶性微粒沉积在人体毛细血管中，可以引起毛细血管堵塞、缺血、缺氧，导致静脉炎、水肿、肉芽肿等(王辉，王育琴.62例中药注射剂不良反应分析.药物不良反应杂志，2004,6(6):417);加之中药注射液提取工艺繁杂，制备过程中混杂的微量不纯成分，存放过程中质量发生变化，使用过程中与常用输液配伍致不溶性微粒增加等因素可致ADR(王贵田.中药注射剂引起不良反应因素的分析.中国药师，2001，4(5):53),报道数十例中药注射剂发生输液反应患者的剩余药液进行细菌内毒素检测，结果均为阴性，澄明度检测肉眼可见异物及不溶性微粒检测都大大超过药典规定限量标准，说明中药注射剂引起输液反应可能不是细菌内毒素引起，而是不溶性微粒所致热原样反应；另外中药注射剂普遍含有绿原酸，这是一种半抗原物质，经一定反应与蛋白质结合后有致敏性，可产生高致敏反应，但缺乏一行之有效的方法进行预测。中药静脉注射剂中水不溶性成分主要包括(l)微粒外源性带入(易于控制)；内源性形成(制剂稳定性差，由水不溶性成分在各个环节形成)；(2)色素有效成份本身固有颜色(植物类提取物绝大多数呈现一定颜色)，作为杂质的颜色(一般工艺难以除掉)；(3)无色的水不溶性成分植物类提取的有效成分呈无色的甚少。药品的三大基本要素安全、有效、质量可控，其作用基础均为化合物，因此对中药静脉注射剂中水不溶性成分在体内ADME(吸收(absoiption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)和排泄(excre-tion))过程的研究与评价是"安全、有效、质量可控"的基础研究之一，通过研究中药水不溶性成分的成药性，建立一种准确有效的对已上市中药静脉注射剂进行再检测或开发中的中药静脉注射剂进行提前评价与检测的方法，对于中药现代化具有重要意义。
发明内容针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种预测中药水不溶性有效成分静脉注射剂成药性的方法，可准确有效地对已上市中药静脉注射剂进行再评价，或对开发中的中药静脉注射剂进行提前评价与预测。本发明是通过以下技术方案实现的一种预测中药有效成分静脉注射剂成药性的方法，步骤如下一、进行体外试验(1)参照药品说明书或拟用方法，将中药有效成分与溶媒按所提供的比例混匀，配制成一定浓度的待测溶液，待用；(2)对健康哺乳动物静脉取血，常规方法制备血浆，血清及去白蛋白血清，然后向血浆、血清及去白蛋白血清中分别加入待测溶液，其中，血浆、血清及去白蛋白血清与加入的待测溶液的体积比均为150:1;(3)将上述含中药有效成分的血浆、血清及去白蛋白血清涡流混匀，离心，肉眼观察溶解情况，观察是否有沉淀产生；(4)若有沉淀产生，则用0.110ml的溶剂溶解沉淀，并用高效液相色谱法测定中药有效成分在溶剂中的浓度；(5)釆用高效液相色谱法测定上清液中中药有效成分的浓度；(6)通过计算确定中药有效成分在血浆、血清、去白蛋白血清中的溶解百分比，若溶解量均占加入总量的50%以上，则该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，否则较低；二、进行体内试验(1)参照药品说明书或拟用方法，将中药有效成分与溶媒按所提供的比例混匀，配制成一定浓度的待测溶液，待用；(2)参照药品说明书规定剂量对健康哺乳动物静脉点滴待测溶液，连续点滴17次，每天1次，在最后一次点滴过程中，机采血浆，并制备血清，即为含中药有效成分的血浆、血清；(3)将上述含中药有效成分的血浆、血清涡流混匀，离心，肉眼观察溶解情况，观察是否有沉淀产生；(4)若有沉淀产生，则用0.110ml的溶剂溶解沉淀，并用高效液相色谱法测定其在溶剂中的浓度；(5)采用高效液相色谱法测定上清液中中药有效成分的浓度；(6)通过计算确定中药有效成分在血浆、血清中的溶解百分比，若溶解量均占测得总量的50%以上，则该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，否则较低；综合上述实验结果，若两个实验的推测结果均为该中药有效成分静脉注射剂成药性较高,则推断该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，否则较低。所述溶媒是550%葡萄糖注射液、0.55%氯化钠注射液、注射用水。所述溶剂是95%乙醇、乙腈、氯仿。所述健康哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、猪、犬、猴及人中的一种。本发明涉及评价的中药材主要有26种红花、灯盏花、黄芷、刺五加、瓜萎皮、银杏叶、丹参、大珠红景天、抱茎苦荬菜、三七、麦冬、川芎、附片、降香、党参、金银花、黄芩、连翘、茵陈、栀子、人参、苦参、郁金、冰片、五味子、大黄。涉及评价的中药静脉注射剂主要有63种红花注射液、灯盏花素注射液、灯盏细辛注射液、黄芪注射液、刺五加注射液、瓜萎皮注射液、舒血宁注射液、丹参注射液、大株红景天注射液、苦碟注射液、血栓通注射液、参麦注射液、冠心宁注射液、丹红注射液、参附注射液、香丹注射液、参芪扶正注射液、骨瓜提取物注射液、脉络宁注射液、双黄连注射液、茵栀黄注射液、康艾注射液、注射用益气复脉、苦黄注射液、血必净注射液、舒肝宁注射液、清开灵注射液、复方半边莲注射液、醒脑静注射液、蟾酥注射液、复方麝香注射液、灯盏细辛酮酯注射液、催吐清胃注射液、人参四逆注射液、注射用辛芍、灯黄注射液、盐酸千金藤注射液、注射用抗血小板溶栓素、赤苷脉通注射液、注射用参麦皂苷、活血通络注射液、肾康注射液、注射用红花黄色素、注射用金森脑素、脑细胞调节素注射液、注射用络通、脑血宁注射液、胰宁注射液、白屈菜注射液、通光藤注射液、惊天宁注射液、注射用黄杨宁、复方梓柳碱注射液、泰克吉宁注射液、注射用丹红、喘根治注射液、脑必舒注射液、君痛宁注射液、安痔注射液、芍丹通脑注射液、注射用复方荭草、注射用脑通冻干粉、绿原酸。本发明首次提出一种预测中药中水不溶性有效成份静脉注射剂成药性的方法，简单有效，实用性与可操作性强，此方法可以应用于对已上市的中药注射剂安全性进行再评价、检测，对开发中的中药静脉注射剂成药性进行提前预测，在中药注射剂生产与研发中具有广泛的用途。本发明对于因正在生产的中药静脉注射剂水不溶性有效成分造成的ADR可进行有效的提前预警，保证人民群众的用药安全，对于正在开发的中药静脉注射剂创新药物提供有效的质量评价方法，对于我国中药现代化的建设具有重要的实际意义。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明实施例一预测丹参中有效成分丹酚酸B静脉注射剂成药性的犬体外与体内试验1.实验材料、仪器与动物丹酚酸B:购于云南科翔生物技术有限公司；5%葡萄糖注射液济南三九益民制药有限责任公司生产，规格100ml:5g,批号20070342;液相色谱美国Agilent公司1100液相色谱系统；离心机LD5-2A型，北京医用离心机厂；犬健康比格犬，体重4,96.7kg，雄性，共5只，购自济南立秋动物繁殖中心，生产许可证号"SCXK(鲁)20070024"。2.实验过程及结果2.1体外实验2.1.1实验过程(1)取适量丹酚酸B与5n/。的葡萄糖注射液混匀，配制成丹酚酸B的浓度为5mg/ml的待测溶液，待用；(2)对5只健康比格犬进行后肢外侧小隐静脉各取血10ml，将所取得血混合，常规方法制备血浆(60。C灭活，并加酶抑制剂)，血清(60'C灭活，并加酶抑制剂)及去白蛋白血清，然后取血浆、血清及去白蛋白血清各10ml，分别向其加入lml的待测溶液。(3)将上述含丹酚酸B的血浆、血清及去白蛋白血清分别涡流混合lmin，4000rpm离心5min,肉眼观察溶解情况，无沉淀产生；(4)准确测定上清液体积，HPLC测定上清液中丹酚酸B的浓度，并计算出上清液中含有的丹酚酸B总量；(5)通过计算确定丹酚酸B在血浆、血清、去白蛋白血清中的溶解百分比。2.1.2实验结果(1)离心后肉眼观察结果血浆、血清及去白蛋白血清均无沉淀产生。(2)体外试验丹酚酸B溶解状态见表l。表1比格犬体外实验丹参酚酸B的溶解状态<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>*沉淀中丹酚酸B总量(mg)=丹酚酸B在乙腈中浓度(mg/ml)X乙腈体积(ml)*上清液中丹酚酸B总量(mg)=丹酚酸B在上清液中浓度(rag/ml)X上清液体积(ml)上清液中丹酚酸B总量(mg)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>丹酚酸B加入总量(mg)2丄3结果分析实验结果表明含丹酚酸B的比格犬血浆、血清、去白蛋白血清离心后未出现沉淀。经HPLC测定,丹酚酸B在比格犬血浆、血清、去白蛋白血清中溶解量占加入总量的95.6。/。、98.2。/0、96.4%，可预测丹酚酸B静脉注射剂成药性较好。本发明运用比格犬体外实验方法对丹酚酸B的静脉注射剂成药性进行了准确评价，方法简单实用，对于预测水不溶性有效成份成药性具有指导意义。2.2体内试验2.2.1实验过程(1)取适量丹酚酸B与5%的葡萄糖注射液混匀，配制成丹酚酸B的浓度为7.5mg/ml的待测溶液，待用；(2)向比格犬静脉滴注待测溶液50ral，连续给药3次，每天1次，在第3次给药过程中，机采血浆，并制备血清5ml。将所得5只比格犬血浆混合后，6(TC灭活，并加酶抑制剂；将所得5只比格犬血清混合后，601C灭活，并加酶抑制剂。(3)取上述制备好的含丹酚酸B的血浆、血清各10ml，涡流混合lmin，5000rpm离心5min,肉眼观察溶解情况，无沉淀产生。(4)准确测定上清液体积，HPLC测定上清液中丹酚酸B的浓度，计算出上清液中含有的丹鼢酸B总量。(5)通过计算确定丹酚酸B在血浆、血清中的溶解百分比。2.2.2实验结果(1)离心后肉眼观察结果含有丹酚酸B的待测溶液在比格犬静脉滴注给药过程中，血浆、血清均无沉淀产生。(2)体内试验丹酚酸B溶解状态见表2。表2比格犬体内试验丹酚酸B溶解状态<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*沉淀中丹酚酸B总量(Pg)==丹酚酸B在乙腈中浓度(tig/ml)X乙腈体积(ml)*上清液中丹酚酸B总量(Pg)=丹酚酸B在上清液中浓度(Pg/ml)X上清液体积(ml)*丹酚酸B测得总量(Pg)=沉淀中丹酚酸B总量(Pg)+上清液中丹酚酸8总量(Pg)上清液中丹酚酸B总量(Pg)溶解百分比(％)=-X100°/o丹酚酸B测得总量(Pg)2.2.3结果分析连续3天对比格犬静脉滴注含丹酚酸B的待测溶液，通过在HPLC分析乙腈、血浆及血清的上清液中丹酚酸B浓度。结果表明，丹酚酸B主要溶解于血浆、血清中，血浆及血清离心后均无沉淀出现，丹酚酸B在血浆及血清的溶解百分比均为100%,说明丹酚酸B在静脉滴注过程中成药性较好。此方法可有效预测丹参有效成分丹酚酸B在静脉滴注过程中成药性。3.结论本发明通过含中药有效成分丹酚酸B静脉注射剂在比格犬体外与体内试验，验证了丹参有效成分丹酚酸B静脉注射剂成药性较好，本方法可准确的预测丹酚酸B是否具中药静脉注射剂的成药性，为上市中药静脉注射剂再评价及开发中药静脉注射剂的成药性提供了简便、具有实际意义的手段，避免了中药静脉注射剂开发的盲目性。实施例二预测麦冬中有效成分麦冬皂苷B/D静脉注射剂成药性的犬体外与体内试验1.实验材料、仪器与动物麦冬皂苷B/D:购于贵州普兰卡医药研究有限公司；10%葡萄糖注射液山东太乙制药有限公司生产，规格500ml:50g,批号20070222:液相色谱美国Agilent公司1100液相色谱系统；离心机LD5-2A型，北京医用离心机厂；犬健康比格犬，体重4.96.7kg，雄性，共5只，购自济南立秋动物繁殖中心，生产许可证号"SCXK(鲁)20070024"。2.实验过程及结果:2.1体外试验2丄1实验过程(1)取适量麦冬皂苷B/D与10n/。的葡萄糖注射液混匀，配制成麦冬皂苷B/D的浓度为4mg/ml的待测溶液，待用；(2)对5只健康比格犬进行后肢外侧小隐静脉各取血10ml，将所取得血混合，常规方法制备血浆(6crc灭活，并加酶抑制剂)，血清(6crc灭活，并加酶抑制剂)及去白蛋白血清，然后取血浆、血清及去白蛋白血清各10ml，分别向其加入lml的待测溶液。(3)将上述含麦冬皂苷B/D的血浆、血清及去白蛋白血清分别涡流混合lmin，4000rpm离心5min，肉眼观察溶解情况，有沉淀产生；(4)用10ml氯仿溶解沉淀，高效液相色谱法(HPLC)测定其在氯仿中浓度，计算沉淀中含有麦冬皂苷B/D总量；(5)准确测定上清液体积，HPLC测定上清液中麦冬皂苷B/D的浓度，计算上清液中含有麦冬皂苷B/D总量；(6)通过计算确定麦冬皂苷B/D在血浆、血清、去白蛋白血清中的溶解百分比。2丄2实验结果(1)离心后肉眼观察结果血浆、血清及去白蛋白血清均有沉淀产生。(2)体外试验麦冬皂苷B/D溶解状态见表3。表3比格犬体外试验麦冬皂苷B/D的溶解状态<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>清中的溶解百分比(％)*_*沉淀中麦冬皂苷B/D总量(rag)-麦冬皂苷BZD在氯仿中浓度(mg/ml)X氯仿体积(ml)*上清液中麦冬皂苷B/D总量(mg)-麦冬皂苷BZD在上清液中浓度(mg/ml)X上清液体积(ml),上清液中麦冬皂苷B/D总量(mg)溶解百分比(％)=-X100%麦冬皂苷B/D加入总量(mg)2.1.3结果分析实验结果表明含麦冬皂苷B/D的比格犬血浆、血清、去白蛋白血清离心后均出现沉淀。经HPLC测定，麦冬皂苷B/D在比格犬血浆、血清、去白蛋白血清中溶解量占加入总量的3.0%、6.8%、1.2%,可预测麦冬皂苷B/D静脉注射剂成药性较差。本发明运用比格犬体外实验的方法对麦冬皂苷B/D的静脉注射剂成药性进行了准确评价，方法简单实用，对于预测水不溶性有效成份成药性具有指导意义。2.2体内试验2.2.1实验过程(1)取适量麦冬皂苷B/D与10%的葡萄糖注射液混匀，配制成麦冬皂苷B/D的浓度为5.5mg/ml的待测溶液，待用；(2)向比格犬静脉滴注待测溶液50ml,连续给药5次，每天1次，在第5次给药过程中，机采血浆，并制备血清5ml。将所得5只比格犬血浆混合后，6(TC灭活，并加酶抑制剂；将所得5只比格犬血清混合后，6CTC灭活，并加酶抑制剂。(3)取上述制备好的含麦冬皂苷B/D的血浆、血清各10ml，涡流混合lmin,5000ipm离心5min,肉眼观察溶解情况，有沉淀产生。(4)用10ml的氯仿溶解沉淀，并用高效液相色谱法(HPLC)测定其在氯仿中的浓度，计算沉淀中含有麦冬皂苷B/D的总量。(5)准确测定上清液体积，HPLC测定上清液中麦冬皂苷B/D的浓度，计算上清液中含有麦冬皂苷B/D的总量。(6)计算确定麦冬皂苷B/D在血浆、血清中的溶解百分比。2.2.2实验结果(1)离心后肉眼观察结果含有麦冬皂苷B/D的待测溶液在比格犬静脉滴注给药过程中，血浆、血清均有沉淀产生。(2)体内试验麦冬皂苷B/D溶解状态见表4。表4犬体内试验麦冬皂苷B/D溶解状态溶解状态血浆血清麦冬皂苷B/D在氯仿中浓度(Pg/ml)0.5660.591氯仿体积(ml)1010沉淀中麦冬皂苷B/D总量(Pg)*5.665.91麦冬皂苷B/D在上清液中浓度(Mg00/ml)上清液体积(ml)9.49.9上清液中麦冬皂苷B/D总量(M)*00麦冬皂苷B/D测得总量(Pg)*5.665.91麦冬皂苷B/D在血浆、血清、去白00蛋白血清中的溶解百分比(％)**沉淀中麦冬皂苷B/D总量(Mg)-麦冬皂苷BZD在氯仿中浓度(Pg/ml)X氯仿体积(ml)*上清液中麦冬皂苷B/D总量(Mg)=麦冬皂苷B/D在上清液中浓度(Mg/ml)X上清液体积(ml)*麦冬皂苷B/D测得总量(Pg)-沉淀中麦冬皂苷B/D总量(jxg)+上清液中麦冬皂苷B/D总量(Mg)上清液中麦冬皂苷B/D总量(Pg)溶解百分比(％)=-X100%麦冬皂苷B/D测得总量(Jig)2.2.3结果分析连续3天对比格犬静脉滴注含麦冬皂苷B/D的待测溶液，通过在HPLC分析氯仿、血浆及血清的上清液中麦冬皂苷B/D浓度。结果表明，麦冬皂苷B/D主要溶解于氯仿中，血浆、及血清离心后均有沉淀出现，麦冬皂苷B/D在血浆、血清的上清液中均未检出，说明麦冬皂苷B/D在静脉滴注过程中成药性较差。此方法可有效预测丹参有效成分麦冬皂苷B/D在静脉滴注过程中成药性。3.结论本发明通过含中药有效成分麦冬皂苷B/D静脉注射剂在比格犬体外与体内试验，验证了麦冬有效成分麦冬皂苷B/D静脉注射剂成药性较差，本方法可准确的预测麦冬皂苷B/D是否具中药静脉注射剂的成药性，为上市中药静脉注射剂再评价及开发中药静脉注射剂的成药性提供了简便、具有实际意义的手段，避免了中药静脉注射剂开发的盲目性。实施例三检测丹参中有效成分丹酚酸A静脉注射剂成药性的食蟹猴体外与体内试验1.实验材料、仪器与动物丹酚酸A:购于云南科翔生物技术有限公司；0.9%氯化钠注射液:江苏恒瑞医药股份有限公司生产，规格100ml:0.9g，批号20070310;液相色谱美国Agilent公司1100液相色谱系统；离心机LD5-2A型，北京医用离心机厂；猴健康食蟹猴，体重2,04.0kg,年龄34岁，雄性，共2只，购自云南灵长类实验动物有限公司，生产许可证号"SCXK(滇)-2005-0001"。2.实验过程及结果2.1体外试验2丄1实验过程(1)取适量丹酚酸A与0.9。/。氯化钠注射液混匀，配制成丹酚酸A的浓度为3mg/ml的待测溶液，待用；(2)对2只健康食蟹猴进行后肢皮下静脉各取血20ml，将所取得血混合，常规方法制备血浆(60'C灭活，并加酶抑制剂)，血清(6(TC灭活，并加酶抑制剂)及去白蛋白血清，然后取血桨、血清及去白蛋白血清各10ml，分别向其加入lml的待测溶液。(3)将上述含丹酚酸A的血浆、血清及去白蛋白血清分别涡流混合lmin，4000rpm离心5min,肉眼观察溶解情况，无沉淀产生；(4)准确测定上清液体积，HPLC测定上清液中丹酚酸A的浓度，计算上清液中含有丹酚酸A总量；(5)通过计算确定丹酚酸A在血浆、血清、去白蛋白血清中的溶解百分比。2丄2实验结果(1)离心后肉眼观察结果血浆、血清及去白蛋白血清均无沉淀产生。(2)体外试验丹酚酸A溶解状态见表5。表5猴体外试验丹酚酸A的溶解状态溶解状态血浆血清去白蛋白血清丹酚酸A加入总量(mg)丹酚酸A在95。/。乙醇溶液中浓度(mg/ml)000乙醇溶液体积(ml)3沉淀中丹酚酸A总量(mg)*000丹酚酸A在上清液中浓度(mg/ml)0.3110.2820.291上清液体积(ml)9.29.89.9上清液中丹酚酸A总量(mg)*2.8592.7632.881丹酚酸A在血浆、血清、去白蛋白血清中95.392.196.0的溶解百分比(％)**沉淀中丹酚酸A总量(mg)-丹酚酸A在乙醇溶液中浓度(mg/ml)X乙醇溶液体积(ml)*上清液中丹酚酸A总量(mg)-丹酚酸A在上清液中浓度(mg/ml)X上清液体积(ml)上清液中丹酚酸A总量(mg)溶解百分比(％)=-X100%丹酚酸A加入总量(mg)2丄3结果分析实验结果表明含丹酚酸A的食蟹猴血浆、血清、去白蛋白血清离心后均未出现沉淀。经HPLC测定，丹酚酸A在食蟹猴血浆、血清、去白蛋白血清中溶解量占加入总量的95.3%、92.1%、96.0%,可预测丹酚酸A静脉注射剂成药性较好。本发明运用食蟹猴体外实验的方法对丹酚酸A静脉注射剂成药性进行了准确评价，方法简单实用，对于预测水不溶性有效成份成药性具有指导意义。2.2体内试验2.2.1实验过程(1)取适量丹酚酸A与0.9%氯化钠注射液混匀，配制成丹酚酸A的浓度为4.5mg/ml的待测溶液，待用；(2)向食蟹猴静脉滴注待测溶液100ml，连续给药4次，每天1次，在第4次给药过程中，机采血浆，并制备血清10ml。将所得2只食蟹猴血浆混合后，60'C灭活，并加酶抑制剂；将所得2只食蟹猴血清混合后，60'C灭活，并加酶抑制剂。(3)取上述制备好的含丹酚酸A的血浆、血清各10ml，涡流混合lmin,5000rpm离心5min,肉眼观察溶解情况，无沉淀产生。(4)准确测定上清液体积，采用高效液相色谱法测定上清液中丹酚酸A的浓度，计算上清液中含有丹酚酸A总量。(5)通过计算确定丹酚酸A在血浆、血清中的溶解百分比。2.2.2实验结果(1)离心后肉眼观察结果含有丹酚酸A的待测溶液在食蟹猴静脉滴注给药过程中，血浆、血清均无沉淀产生。(2)体内试验丹鼢酸A溶解状态见表6。表6猴体内试验丹酚酸A溶解状态溶解状态血浆血清丹酚酸A在乙醇溶液中浓度(M/ml)00乙醇溶液体积(ml)33沉淀中丹酚酸A总量(P)*00丹酚酸A在上清液中浓度(Pg/ml)3.943.80上清液体积(ml)9.19.9上清液中丹酚酸A总量(Mg)*35.8537.62丹酚酸A测得总量(Mg)*35.8537.62丹酚酸A在血浆、血清、去白蛋白100100血清中的溶解百分比(％)**沉淀中丹酚酸A总量(Mg)-丹酚酸A在乙醇溶液中浓度(Mg/ml)X乙醇溶液体积(ml)*上清液中丹酚酸A总量(Mg)-丹酚酸A在上清液中浓度(Mg/ml)X上清液体积(ml)*丹酚酸A测得总量(Pg)-沉淀中丹酚酸A总量(Mg)+上清液中丹酚酸八总量(M)上清液中丹酚酸A总量(^g)溶解百分比(％)=-X100%丹酚酸A测得总量(M)2.2.3结果分析连续3天对食蟹猴静脉滴注含丹酚酸A的待测溶液，HPLC分析95%乙醇溶液、血浆及血清的上清液中丹酚酸A浓度。结果表明，丹酚酸A主要溶解于血浆、血清中，血浆、血清离心后均无沉淀出现，丹酚酸A在血桨、血清的溶解百分比均为100%,说明丹酚酸A水溶性较好，在静脉滴注过程中成药性较好。此方法可有效预测丹参有效成分丹酚酸A在静脉滴注过程中成药性。3.结论本发明通过含中药有效成分丹酚酸A静脉注射剂在比格犬体外与体内试验，验证了丹参有效成分丹酚酸A静脉注射剂成药性较好，本方法可准确的预测丹酚酸A是否具中药静脉注射剂的成药性，为上市中药静脉注射剂再评价及开发中药静脉注射剂的成药性提供了简便、具有实际意义的手段，避免了中药静脉注射剂开发的盲目性。实施例四检测丹参中有效成分丹参酮IIA静脉注射剂成药性的食蟹猴体外试验1.实验材料、仪器与动物丹参酮IIA:购于贵州普兰卡医药研究有限公司；5%葡萄糖注射液济南三九益民制药有限责任公司生产，规格100ml:5g，批号20070342;液相色谱美国Agilent公司1100液相色谱系统；离心机LD5-2A型，北京医用离心机厂；猴健康食蟹猴，体重2.04.0kg，年龄34岁，雄性，共2只，购自云南灵长类实验动物有限公司，生产许可证号"SCXK(滇)-2005-0001"。2.实验过程及结果2.1体外试验2丄1实验过程(1)取适量丹参酮IlA与5n/。的葡萄糖注射液混匀，配制成丹参酮IlA的浓度为4mg/ml的待测溶液，待用；(2)对2只健康食蟹猴进行后肢皮下静脉各取血20ml，将所取得血混合，常规方法制备血浆(60'C灭活，并加酶抑制剂)，血清(60C灭活，并加酶抑制剂)及去白蛋白血清，然后取血浆、血清及去白蛋白血清各10ml，分别向其加入lml的待测溶液。(3)将上述含丹参酮IIA的血浆、血清及去白蛋白血清分别涡流混合lmin,4000ipm离心5min，肉眼观察溶解情况，有沉淀产生；(4)用10m!95。/。乙醇溶解沉淀，高效液相色谱法(HPLC)测定其在95%乙醇溶液中浓度,计算沉淀中含有丹参酮IIA总量；(5)准确测定上清液体积，HPLC测定上清液中丹参酮IIA的浓度，计算上清液中含有丹参酮IIA总量；(6)通过计算确定丹参酮IIA在血浆、血清、去白蛋白血清中的溶解百分比。2丄2实验结果(O离心后肉眼观察结果血浆、血清及去白蛋白血清均有沉淀产生。(2)体外试验丹参酮IIA溶解状态见表7。表7猴体外试验丹参酮IIA溶解状态<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>的溶解百分比(°/。)*_*沉淀中丹参酮IIA总量(rag)-丹参酮IlA在乙醇溶液中浓度(mg/ml)X乙醇溶液体积(ml)*上清液中丹参酮IIA总量(mg)-丹参酮IIA在上清液中浓度(mg/ml)X上清液体积(ml)上清液中丹参酮IIA总量(mg)溶解百分比(％)=-X100%丹参酮IIA加入总量(mg)2丄3结果分析-实验结果表明含丹参酮IIA的食蟹猴血浆、血清、去白蛋白血清中均出现沉淀。经HPLC测定，丹参酮IIA在食蟹猴血浆、血清、去白蛋白血清中溶解量占加入总量的3.8%、1.8%、3.0%，可预测丹参酮IIA静脉注射剂成药性较差。本发明运用食蟹猴体外实验的方法对丹参酮IIA的静脉注射剂成药性进行了准确评价，方法简单实用，对于预测水不溶性有效成份中药静脉注射剂成药性具有指导意义。2.2体内试验2.2.1实验过程(1)取适量丹参酮IIA与5%的葡萄糖注射液混匀，配制成丹参酮IIA的浓度为5.5mg/ml的待测溶液，待用；(2)向食蟹猴静脉滴注待测溶液100ml，连续给药7次，每天l次，在第7次给药过程中，机采血浆，并制备血清10ml。将所得2只食蟹猴血桨混合后，60'C灭活，并加酶抑制剂;将所得2只食蟹猴血清混合后，60'C灭活，并加酶抑制剂。(3)取上述制备好的含丹参酮IIA的血浆、血清各10ml，涡流混合lmin，5000ipm离心5min,肉眼观察溶解情况，有沉淀产生。(4)用10ml的95%乙醇溶解沉淀，并用髙效液相色谱法测定其在95%乙醇溶液中的浓度，计算沉淀中含有丹参酮IIA总量。(5)准确测定上清液体积，采用高效液相色谱法测定上清液中丹参酮IIA的浓度，计算上清液中含有丹参酮IIA总量。(6)通过计算确定丹参酮IIA在血浆、血清中的溶解百分比。2.2.2试验结果(1)离心后肉眼观察结果含有丹参酮IIA的待测溶液在食蟹猴静脉滴注给药过程中，血浆、血清均有沉淀产生。(2)体内试验丹参酮IIA溶解状态见表8所示。表8犬体内试验丹参兩IIA溶解状态溶解状态血浆血清丹参酮IIA在乙醇溶液中浓度5.96.6(^g/ml)乙醇溶液体积(ml)1010沉淀中丹参酮IIA总量(!^g)*5966丹参酮IIA在上清液中浓度(Mg0.70.6/ml)上清液体积(ml)8.89.9上清液中丹参酮IIA总量(Mg)*6.165.94丹参酮IIA测得总量(Mg)*65.1671.94丹参酮IIA在血浆、血清、去白蛋9.48.2白血清中的溶解百分比(％)**沉淀中丹参酮IIA总量(Pg)=丹参酮11A在乙醇溶液中浓度(Pg/ml)X乙醇溶液体积(ml)*上清液中丹参酮IIA总量(^g)-丹参酮I1A在上清液中浓度(jxg/ml)X上清液体积(ml)*丹参酮IIA测得总量(Mg)-沉淀中丹参酮IIA总量(Pg)+上清液中丹参酮I1A总量(Pg)上清液中丹参酮IIA总量(Pg)溶解百分比(％)=-X100%丹参酮IIA测得总量(Pg)2.2.3结果分析连续3天对食蟹猴静脉滴注含丹参酮IIA的待测溶液，通过HPLC分析95X乙醇溶液、血浆及血清的上清液中丹参酮IIA浓度。结果表明，丹参酮IIA主要溶解于959i乙醇溶液中，血浆、血清离心后均有沉淀出现，丹参酮IIA在血浆、血清中的溶解百分比分别为9.4%、8.2%,说明丹参酮IIA在静脉滴注过程中成药性较差。此方法可有效预测丹参有效成分丹参酮IIA在静脉滴注过程中成药性。3.结论本发明通过含中药有效成分丹参酮IIA静脉注射剂在比格犬体外与体内试验，验证了中药静脉注射剂有效成分丹参酮IIA成药性较差，本方法可准确的预测丹参酮IIA是否具中药静脉注射剂的成药性，为上市中药静脉注射剂再评价及开发中药静脉注射剂的成药性提供了简便、具有实际意义的手段，避免了中药静脉注射剂开发的盲目性。权利要求1.预测中药有效成分成药性的方法，其特征在于步骤如下(一)进行体外试验(1)参照药品说明书或拟用方法，将中药有效成分与溶媒按所提供的比例混匀，配制成一定浓度的待测溶液，待用；(2)对健康哺乳动物静脉取血，常规方法制备血浆，血清及去白蛋白血清，然后向血浆、血清及去白蛋白血清中分别加入待测溶液，其中，血浆、血清及去白蛋白血清与加入的待测溶液的体积比均为1～50∶1；(3)将上述含中药有效成分的血浆、血清及去白蛋白血清涡流混匀，离心，肉眼观察溶解情况，观察是否有沉淀产生；(4)若有沉淀产生，则用0.1～10ml的溶剂溶解沉淀，并用高效液相色谱法测定中药有效成分在溶剂中的浓度；(5)采用高效液相色谱法测定上清液中中药有效成分的浓度；(6)通过计算确定中药有效成分在血浆、血清、去白蛋白血清中的溶解百分比，若溶解量均占加入总量的50％以上，则初步推测该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，否则较低；(二)进行体内试验(1)参照药品说明书或拟用方法，将中药有效成分与溶媒按所提供的比例混匀，配制成一定浓度的待测溶液，待用；(2)参照药品说明书规定剂量对健康哺乳动物静脉点滴待测溶液，连续点滴1～7次，每天1次，在最后一次点滴过程中，机采血浆，并制备血清，即为含中药有效成分的血浆、血清；(3)将上述含中药有效成分的血浆、血清涡流混匀，离心，肉眼观察溶解情况，观察是否有沉淀产生；(4)若有沉淀产生，则用0.1～10ml的溶剂溶解沉淀，并用高效液相色谱法测定其在溶剂中的浓度；(5)采用高效液相色谱法测定上清液中中药有效成分的浓度；(6)通过计算确定中药有效成分在血浆、血清中的溶解百分比，若溶解量均占测得总量的50％以上，则推测该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，否则较低；综合上述实验结果，若两个实验的推测结果均为该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，则推断该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，否则较低。2.根据权利要求1所述的预测中药有效成分成药性的方法，其特征在于所述溶媒是550%葡萄糖注射液、0.55%氯化钠注射液、注射用水。3.根据权利要求1所述的预测中药有效成分成药性的方法，其特征在于所述溶剂是95%乙醇、乙腈、氯仿。4.根据权利要求1所述的预测中药有效成分成药性的方法，其特征在于所述健康哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、猪、犬、猴及人中的一种。全文摘要本发明涉及一种预测中药有效成分静脉注射剂成药性的方法，可以应用于对已上市的中药注射剂安全性进行再评价、检测，对开发中的中药静脉注射剂成药性进行提前预测，在中药注射剂生产与研发中具有广泛的用途。其步骤为先将中药有效成分与溶媒按比例混匀，配制成一定浓度的待测溶液，然后分别进行体内实验和体外实验制备含中药有效成分的血浆、血清，高效液相色谱法测定其在血浆、血清中的溶解度；若两个实验的结果均为溶解量占加入总量的50％以上，则该中药有效成分静脉注射剂成药性较高，否则较低。文档编号G01N30/02GK101251527SQ20081001502公开日2008年8月27日申请日期2008年4月1日优先权日2008年4月1日发明者厉保秋申请人:山东大学