专利名称：单个藻细胞膜电位、膜电阻的非损伤性测定方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能同时测量单个藻细胞膜电位和膜电阻的非损伤性测定方法及装置，属 于细胞膜电信号分析技术领域。
技术背景细胞质膜是外源物质诸如药物、毒物、激素等接触最早的靶位，并有多个受体，因此质 膜对这些物质的作用特别敏感。故而质膜电生理信号的测定是医学、药理学、病理学、毒理 学以及营养吸收和机体的抗逆性等研究领域广泛应用的分析手段。目前，对活细胞膜电位的 直接测定与监控，国内外主要采用微电极插入法和膜片钳技术。该类工作需要使用精密的仪 表，且操作复杂，须由非常熟练的专家进行。此外，细胞中插入微电极必然降低作为试验对 象的细胞的寿命，而组建膜片钳实验系统费用昂贵，试验成本高，普通实验室承担不起，因 而其普及受到很大阻力。近年来，国内外涌现出多种细胞电位测定系统，如细胞电位测定装置、细胞压力和膜电 位测定探针、细胞电图仪、亲脂性阴离子荧光探针(DiBAC4)等。其中细胞电位测定装置以 矩阵排列的微电极记录细胞放置器中多个细胞的电活动，该系统结构繁杂、干扰因素多、人 为误差大，且主要用于细胞团膜电位的测定。细胞压力和膜电位测定探针操作简单，但由于 探针尖端刺入被测细胞中，因而造成细胞损伤。细胞电图仪对细胞无损伤或损伤很小，且能 瞬时或持续记录细胞电活动和导电性，但该技术只能用于记录贴壁、悬浮培养的动物细胞的 电活动。DiBAC4只能反映膜电位改变情况，却无法得出确切的膜电位电压值。因而，大型单 细胞膜电位的非损伤性测定存在很大难度。膜同时兼有电阻和电容的符合特征，因此膜电阻 和膜电位密切相关，而且均是反映膜电导特性的标志参数，能用一套装置同时测定单细胞的 膜电位和膜电阻对研究细胞膜完整性、通透性等重要生理特性有极大意义，而以往的细胞电 位测定系统均无法完成无损伤细胞膜电位和膜电阻的同时测定。
发明内容
本发明所要解决的问题，就是针对上述现有技术的缺点，提供一种单个藻细胞膜电位和 膜电阻的非损伤性测定方法和装置，他通过细胞表面技术对轮藻、丽藻等的单个藻细胞膜电 位和膜电阻实现连续测定，且不影响藻细胞寿命。本发明解决其技术问题，采用的技术方案是， 一种藻细胞膜电位、膜电阻非损伤性测定 方法，包括细胞无损伤固定方法和无损伤采集膜电信号的细胞表面技术。采用凡士林无损伤固定细胞，并制成套管式藻细胞探头；套管上部空隙(参比池)充灌0.1mol七"氯化钾溶液， 作为参比液模拟藻细胞内电环境，并导通参比的银\氯化银电极和藻细胞；套管内壁附着铂金 电极，与外部脉冲发生仪相连。细胞表面技术通过分别置于参比池和测定池的银\氯化银电极 采集藻细胞膜内外电生理信号，外接电极信号仪显示膜电位信号。一种藻细胞膜电位、膜电阻非损伤性测定装置，包括藻细胞反应装置和电信号显示装置。在藻细胞反应装置中有5对电极固定环和5个可滑动式细胞探头固定架，分别用于固定成对的银\氯化银电极和套管式藻细胞反应探头；此外，还有含电极插孔和细胞探头插孔的平行置于细胞反应装置底部的5个管状测定池，内充灌藻细胞缓冲液。藻细胞膜电信号显示装置为 电极信号仪和脉冲发生器集成的多通道电生理信号仪，显示两对应银\氯化银间电势差，即藻 细胞膜电位。脉冲发生器通过铂金电极每10-15秒对藻细胞输出脉冲电刺激，根据膜电位和 瞬时电流实现藻细胞膜电阻的测定。本发明有益效果是，同时测定藻细胞膜电位和膜电阻，并对细胞无损伤，且一次能够测 定五个平行值，效率高，测量准确，可推广应用于以藻细胞为实验材料的毒理、病理和环境 检测等领域。
下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细说明； 图1是本发明方法之一套管式藻细胞探头 图2是本发明方法之二细胞表面技术应用原理3是本发明测定装置前后剖面示意图附图标记说明1、参比池；2、硅胶管；3、有机玻璃管；4、凡士林；5、藻细胞；6 7、银\氯化银电 极；8 9、电极固定环；10、滑动式细胞探头固定架；11、测定池；12、多通道电生理信号 仪；13、藻细胞缓冲液；14、铂金电极；15、电极信号仪；16、脉冲发生器具体实施方式
图1是利用本发明方法之一制作套管式藻细胞探头，在硅胶管2内，套有机玻璃管3， 有机玻璃管内充满凡士林4用于包埋和封接藻细胞5，硅胶管上端形成的参比池1中充满 O.lmol L'1氯化钾溶液，藻细胞5头部浸于氯化钾溶液，另一端浸于藻细胞缓冲液13。图2是本发明方法之二细胞表面技术应用原理图。如图所示，银\氯化银电极6、 7分别 通过电极固定环8、 9固定，藻细胞探头由可滑动式固定架10固定。银\氯化银电极头部6插 入参比池1，银\氯化银电极7头部插入测定池11。银\氯化银电极6、参比池1中氯化钾溶 液、藻细胞5、藻细胞缓冲液13、银\氯化银电极7形成回路，其间电势差值(藻细胞膜电位) 由多通道电生理信号仪12测量和显示。本发明原理如下由于藻细胞5仅极小部分浸于参比池1氯化钾溶液，形成一微小孤立的膜片，且该氯化 钾溶液模拟细胞内电环境，故该膜片段内外离子浓度近相同，则银\氯化银电极6处电位El "0。假设E2为银X氯化银电极7测量的电位，两电极间测得电位差AE^E1 — E2，而银\氯化 银电极6、 7之间固有电极电位理论值为0，且E1《0，则AE近似为藻细胞5膜内外电位差， 即细胞膜电位，由多通道电生理信号仪12测知。膜电阻信号(AR)测量时，多通道电生理信号仪通过两根铂金电极14，对藻细胞5施 以持续时间为2 — 3s、大小为2 — 7nA的直流电脉冲(I)，激起的电位差不超过5 — 10mV。根 据多通道电生理信号仪12测量藻细胞5瞬时膜电位(AE')和系统瞬时扰动电流(1)，从而确定藻细胞5膜电阻AR二AE' /1。图3是本发明测定装置前后剖示意图。如图所示，本发明装置是一个可同时测定五个藻 细胞膜电位和膜电阻的多通道测定系统。该装置五对银\氯化银电极、五个藻细胞探头、多通 道电生理信号仪12的五套电极信号仪15和脉冲发生器16均同时工作，实现五个藻细胞膜电 位、膜电阻的同时测定，该测定方法和装置效率高，测定成本低。具体实施方法如下将图1所示藻细胞探头、银\氯化银电极6和7、铂金电极、多通道电生理信号仪依据 图2进行连接，同时按照图3所示连接其他同步测定需要的藻细胞探头、银\氯化银电极、铀 金电极等。装置连接完毕后，打开测定池11进液口和出液口，使藻细胞缓冲液13连续的进 入和流出测定池11，但其中始终充满藻细胞缓冲液13。接通多通道电生理信号仪12的电源， 使电极信号仪15和脉冲发生器16同时工作。通过电极信号仪15读取每个藻细胞5的膜电位 值。依据脉冲发生器16输出的瞬时电脉冲(I)和藻细胞瞬时膜电位(AE')，计算出每个藻 细胞膜电阻值(AR)。与此同时，通过其他通道显示结果，同时获取五个藻细胞的膜电位、 膜电阻信息。
权利要求
1. “单个藻细胞膜电位、膜电阻的非损伤性测定方法及装置”，其特征包括(1)套管式藻细胞探头，凡士林无损伤固定藻细胞；(2)细胞表面技术测定方法，对细胞无实质性损伤；(3)银\氯化银电极作为藻细胞电信号采集电极；(4)脉冲发生器和电极信号仪集成为多通道电生理信号仪，构成五个藻细胞膜电信号同步记录、显示装置。
2、 由权利要求l所述的单个藻细胞膜电位、膜电阻的非损伤性测定方法，其特征是套 管式藻细胞探头装置，内充注凡士林无损伤固定藻细胞，制作藻细胞反应探头，凡士林对细 胞电信号无干扰或干扰极小。
3、 由权利要求1所述的单个藻细胞膜电位、膜电阻的非损伤性测定方法，其特征是细 胞表面技术通过设计参比池，充灌参比液模拟藻细胞内环境，细胞电信号采集电极无需插入 细胞，膜内外电位差通过细胞表面进行采集，对藻细胞无损伤。
4、 由权利要求l所述的单个藻细胞膜电位、膜电阻的非损伤性测定方法，其特征是银 \氯化银电极电极电位稳定，作为藻细胞膜电位信号采集电极不影响测定系统稳定性。
5、 由权利要求l所述的单个藻细胞膜电位、膜电阻的非损伤性测定方法，其特征是五 套脉冲发生器和电极信号仪集成制作五通道电生理信号仪，可对五个藻细胞膜电信号进行同 步记录和显示，系统工作可同时获取五个藻细胞膜电位、膜电阻值，测定效率高。
全文摘要
一种单个藻细胞膜电位、膜电阻的非损伤性测定方法及装置，该方法通过细胞表面技术测定大型藻细胞膜电位和膜电阻。它是将套管式细胞探头置于多通道细胞反应装置，每个通道均含有一对电极固定环、细胞探头固定架，用于固定成对排列的银\氯化银电极及套管式藻细胞探头。两银\氯化银电极采集藻细胞膜电位信号，并经电极信号仪记录和显示。脉冲发生器经铂金电极对藻细胞提供脉冲电刺激，依据藻细胞瞬时膜电位，实现膜电阻的同步测定。电极信号仪和脉冲发生器集成为多通道电生理信号仪，实现五个藻细胞膜电位、膜电阻的同时测定，测定效率高。本发明工艺和设备制作简单，操作方便，同时完成对五个藻细胞膜电位和膜电阻的无损伤测定，快速而准确。
文档编号G01N33/48GK101285825SQ200810015570
公开日2008年10月15日 申请日期2008年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者史建国, 孟庆军, 艳 杨, 杨俊慧, 王丙莲, 马耀宏 申请人:山东省科学院中日友好生物技术研究中心