检测羊泰勒虫病的elisa诊断试剂盒及其制备方法

专利名称：检测羊泰勒虫病的elisa诊断试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，特别是一种诊断抗原使用纯化的羊泰勒虫 裂殖子抗原的用于柃测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒，本发明还包括该试剂 盒的制备方法。
技术背景羊泰勒虫病是由羊泰勒虫(M^7eris引起绵羊和山羊的一种蜱传性 血液原虫病。1914年最先发现于埃及，随后在非洲、欧洲、亚洲的许多国家都 发现该病原。我国羊泰勒虫病系杨辅国等在1957年首先发现于四川省甘孜藏族 自治州乾宁县。经分子生物学研究，我国部分地区的羊泰勒虫病原是不同与国 外已知病原所引起的羊的血液原虫病。该病原为我国的特有病原。研究发现， 我国羊泰勒虫病的病原是吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫，并且表现出了极强的致病 性和致死性。调査发现该病原分布广泛，直接威胁着我国养羊业的发展。世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health (英)，Office Intentional des Epizootic(法)，0IE]用来检测泰勒虫病的血清学方法是间接 荧光抗体技术。目前，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测技术已经成功的应用在 环形泰勒虫的检测上，并且OIE认为酶联免疫吸附试验(ELISA)技术将以特异 性更高、敏感性更强和比间接荧光抗体(IFA)检出抗体的时期更长等优点，作 为未来检测该病的更好工具。目前在我国羊泰勒虫病的检测仅仅依靠血涂片检 査，此种检査方法不仅要求检测人员熟悉虫体形态，而且在感染率特低的情况 下容易发生漏检，也不能大批量的进行检测。 发明内容本发明的目的是提供一种检测效率高、不易发生漏检、并能同时进行批量 检测的用于检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒，本发明还包括这种诊断试剂 盒的制备方法及其使用方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一种检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒，包括可与待测样品结合的固体支持物；包被于可与待测样品结合的固体支持物上的羊泰勒虫裂殖子抗原，每孔0. lug;
作为二抗的用酶标记的兔抗羊IgG; 标准羊泰勒虫阳性血清；
标准羊泰勒虫阴性血清；
明胶；
底物稀释液； 30%线
无色底物； 终止液；
磷酸盐缓冲液。
所述的固体支持物为酶标板；所述的底物稀释液为柠檬酸-磷酸盐缓冲液； 所述的无色底物为邻苯二胺；所述的终止液是2摩尔的硫酸；所述的酶为辣根 过氧化物酶；所述的磷酸盐缓冲液为25X浓縮PBST洗液。
所述检测羊泰勒虫病的ELISA试剂盒的制备方法为
a. 包被抗原用0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液稀释羊泰勒虫裂殖子抗原浓度 至0. lug/孔，将此稀释抗原按100ul/孔加入酶标板，加盖后37"C温箱放置1小 时后，4。C冰箱过夜；
b. 洗涤用PH7. 2 PBS+0. 1%吐温-20洗涤包被抗原的酶标板4次；
c. 封闭碳酸盐缓冲液中加入0.5%明胶(W/V)，加热溶解后冷却至室温， 每孔加入200ul， 37'C温育30分钟后甩干；
d. 洗涤用PH7.2 PBS+0. 1%吐温_20洗涤封闭后的酶标板4次；
e. 风干后密封4"C保存。
所述检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒的使用方法为
a. 加被检血清在PH为7. 2的PBST中加入O. 5%明胶，加热溶解，冷却至 室温，用此液体按l: 400稀释血清，每孔加入100ul稀释血清，37。C温育l小 时；
b. 洗涤用1倍PBST洗4次，PBS洗2次；
c. 加酶标二抗在PH为7.2的PBST中加入0.5%明胶，加热溶解，冷却 至室温，用此液体按l: 800稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，，每孔加入 100ul， 37。C温育1小时；d. 洗涤用1倍PBST洗4次，PBS洗2次；
e. 加底物每孔加入配好的邻苯二胺底物100ul， 37。C避光放置约20分钟；
f. 终止反应每孔入50ul 2M H2S04终止反应；
g. 在酶标仪上492nm处读出OD值。
本发明羊泰勒虫裂殖子抗原制成的间接ELISA诊断试剂，具有虫体抗原特 有的高特异性；该ELISA诊断试剂盒实现了本病检测的标准化、自动化、且适 合羊泰勒虫病的早期诊断和人规模的野外血清流行病学调查。本检测方法能早
期诊断本病， 一般在感染后5天就能检出特异性抗体，检测出血清抗体的最早时
间比比传统显微镜检测出的时间提前5-10天。
具体实施例方式
下面结合实施例对本实用新型发明做进一步说明。
本发明检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒的制备
1、首先制备羊泰勒虫裂殖子抗原
l.l虫体繁殖用青海血蜱或血液感染试验除脾羊，待染虫率达到10%以上 时，颈静脉放血，20%枸橼酸抗凝。
1. 2虫体分离虫体的分离包括两种方法
a.低渗裂解红细胞法
a. 1洗涤感染虫体血液用10倍稀释的pH 7. 4 Tris—Hcl三羟甲基氨基甲 烷盐酸盐缓冲液洗涤血液，洗涤时，用吸管把离心管内的沉淀物吹打均匀后，4 。C下以2000转/分离心1分钟，然后用注射器抽掉上清液，尽量除去黄血层(白 细胞层)，然后重新加入洗涤液，吹打，离心，如此反复，直到上清液澄明为止， 最后一次离心之后量取红细胞压积。
a,2裂解红细胞用红细胞压积10倍量的0.8%的枸橼酸钠来裂解，直到显 微镜下80. 0%的红细胞裂解为止，在裂解好之后，要调回等渗。
a. 3差速离心把裂解好的血液4。C下，以2000转/分离心15分钟，取上 清，弃沉淀。
a,4上清液高速离心把差速离心后的上清液，4。C下，以6000转/分离 心20分钟，弃上清，留沉淀。沉淀用10倍稀释的Tris — EDTA三羟甲基氨基甲 烷盐一乙二胺四乙酸缓冲液(pH 7.4)悬浮，用吸管吹打均匀，再同上高速离 心，如此反复两次，最后一次在微型台式高速离心机中，以9000转/分离心2分钟，离心结束后，弃上清，留沉淀，用Tris—EDTA缓冲液洗涤2次，收集沉 淀，保存于低温冰箱备用。 b.溶血素裂解红细胞法
b. 1加1 : 1的阿氏液稀释采集的抗凝血，在4 。C 9 0 0 g离心1 0 min弃上清。
b. 2用Tris-buffer 4 °C 5 0 0 g离心1 0 min洗涤沉淀3次。 b. 3以1 : 5的Tris-HC1 buffer稀释沉淀过柱收集红细胞。 b. 4在4 。C下5 0 0 g离心1 0 min洗脱的红细胞。 b. 5用1 : 1倍的Tris-HC1 buffer稀释，3 7 。C水浴预热5 min。 b. 6加溶血素3 7 。C水浴1 0 min。
b. 7在冰水中用每毫升加1 0 Pi的0 . 5 M EDTA 终止反应。
b.8加6 0X的Perco111 5ml到管底，在其上加4 0X的Perco11 2
Oml;在将含有裂殖子的溶解物加在其上。4。C下9 Q 0 0转离心2 Qmin。 b.9收集介于4 0 %— 6 0 %之间的沉降带，用等量Tris-HCl buffer悬
浮，10 0 0 0转离心1 0 min沉淀被重复洗涤三次。用1 ml重悬沉淀且一 7
0保存。
上述两种方法所获得的虫体冻融5 7次，经超声波进行破碎。将破碎好的抗原 液4。C下，以8000r/min离心20分钟，收集上清液，通过凝胶层析法，收集峰 值蛋白作为ELISA抗原。
2、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊二抗的制备过程 用常规方法制备兔抗羊IgG
健康羊血清在35%的饱和硫酸胺沉淀3次，然后4度作用20分钟，3000转 离心10分钟。沉淀加入生理盐水充分溶解后过DEAE纤维素柱，收集峰值IgG 蛋白。用聚乙二醇浓縮提纯的IgG后用弗氏完全佐剂乳化免疫兔子，l个月后再 用弗氏不完全佐剂乳化的IgG 二免兔子，3个月后用不完全佐剂乳化的IgG三免 兔子，后采血分离血清，琼脂扩散实验效价1: 32时即可放血，分离血清后提 取兔抗羊IgG (方法如上)。
酶结合物的标记(采用改良的过碘酸钠法制备酶结合物) 2. 1取6mg冊P(辣根过氧化物酶)溶于0. 5ml蒸馏水中，加入新配制的0. 06M Nal04水溶液0. 5ml， 4度放置40分钟，取出后加入0. 16 M乙二醇水溶液0. 5ml，室温放置l小时，加入含5mg的纯化的兔抗羊IgG的水溶液l ml，混匀后置入 透析袋，在0.05 M的碳酸盐缓冲液中透析过夜。
2. 2将结合的酶结合物吸出，加入NaBH4 (5mg/ ml) 0.2 ml，置4度，2小时。
2、 3在结合物中加入40。/。的饱和硫酸铵(PH7. 2)， 4度作用30分钟，4度5000 转离心10分钟，将沉淀中液体吸干，将沉淀物溶于0. 02M的PBS (PH7.4)中， 并透析过夜，期间换液4次，4度5000转离心IO分钟，弃沉淀，将上清测标 记率后置冰箱备用。
3、 标准阳性血清的制备用60只青海血蜱饥饿成蜱感染无泰勒虫病的2 只羊，在饲喂蜱后的一个月，再用200只青海血蜱饥饿成蜱进行二次感染。于 第二次上蜱后的10 30天，每隔10天采血20ml，分离血清，混合后置-20。C冰 箱备用。
4、 标准阴性血清的制备从甘肃省景泰县无羊泰勒虫病地区选购年龄为4 6月的20只绵羊，在采血前一周，每天从耳尖采血制作血涂片，姬姆萨染色镜 检，确定无任何种血孢子虫寄生。采血分离血清，混合后置-2(TC冰箱备用。
5、然后按下述程序制备ELISA检测试剂盒
a. 滴度为1:160包被抗原即0. lug/孔(碳酸盐缓冲液稀释抗原)，混匀后每孔加 入100ul稀释抗原，加盖后37。C温箱1小时后4。C冰箱过夜。
b. PH7. 2 PBS+0. 1%吐温-20洗4次。
c. 称取0.25g明胶加入50ml碳酸盐缓冲液中，加热溶解后冷却至室温，每孔 加入200ul， 37。C温育30分钟后甩干。PH7. 2 PBS+0. 1%吐温_20洗4次。
d. 称0.25明胶加入到50ml PH7. 2 PBST中，加热溶解，冷却至室温，用此稀 释血清l: 400，每孔加入100ul稀释血清，37。C温育l小时，PBST洗4次。
e. 按要求用PBST稀释二抗(兔抗羊IgG)，每孔加入100ul， 37。C温育1小时， PBST洗3次。
f. PBS洗2次，每孔加入配好的底物100ul。
g. 37。C避光放置约20分钟，每孔入50ul 2M H2S04终止反应。
h. 在Internal Barcode Reader上492nm处读出0D值。 6、结果判定并按下列公式计算出OD比值一倌=待检血清样品平均0D值—标准阴性血清平均0D值
标准阳性血清平均OD值一标准阴性血清平均OD值 X1QQ
在标准阳性血清平均0D值大于1. 0且P/N值大于2时，测定结果方为有效。 否则，应査明原因重做。0D比值小于15%，判定为"-"；0D比值在16-20%，判 定为"± " ; 0D比值在21-40%，判定为"+ "; 0D比值在41-60%，判定为"+十"; 0D比值大于60。/。，判定为"+ + + "。
用分子筛柱分离纯化的酶标记二抗，并封装于塑料瓶或玻璃瓶内；
用塑料瓶或玻璃瓶分别封装30%的过氧化氢水溶液和2摩尔的硫酸，用黑色 纸或塑料袋包装邻苯二胺。
实施例1 一.羊泰勒虫裂殖子抗原的制备
选试验除蜱羊l只，剪去背部被毛，粘十.布袋，在布袋中饲喂200只青海 血蜱饥饿成蜱，让其叮咬进行感染(或用含有隆德株羊泰勒虫液氮保存红细胞 颈静脉接种，进行感染)。
在感染羊后，毎天肌肉注射地塞米松，首次4支/羊，以后2支/羊，每天 注射一次，直至染虫率升高为止。从感染之日起，每天早晨测量羊的体温，从 体温开始十.升之日起，每天从耳缘静脉涂制血片，甲醇同定两次，姬母萨染色 后，用显微镜检查红细胞染虫率。当红细胞染虫率达到10.0%以上时，颈动脉放
血，20. oy。枸橼酸钠抗凝。
低渗裂解红细胞法
洗涤感染虫体血液用10倍稀释的pH 7.4 Tris—Hcl缓冲液洗涤血液， 洗涤时，用吸管把离心管内的沉淀物吹打均匀后，4'C下，以2000转/分离心l 分钟，然后用注射器抽掉上清液，尽量除去黄血层(白细胞层)，然后重新加入 洗涤液，吹打，离心，如此反复。直到上清液澄明为止。最后一次离心之后量 取红细胞压积。
裂解红细胞用红细胞压积10倍量的0.8%的枸橼酸钠来裂解，直到显微镜 下80.0%的红细胞裂解为止，在裂解好之后，要调回等渗。
差速离心把裂解好的血液4。C下，以2000转/分离心15分钟，取h清，弃沉淀。
上清液高速离心把差速离心后的上清液，4。C下，以6000转/分离心20 分钟，弃上清，留沉淀。沉淀用10倍稀释的Tris — EDTA缓冲液(pH 7.4)悬 浮，用吸管吹打均匀，再同上高速离心，如此反复两次，最后一次在微型台式 高速离心机中，以9000转/分离心2分钟，离心结束后，弃上清，留沉淀，用 Tris — EDTA缓冲液洗涤2次，收集沉淀，保存丁低温冰箱备用。
上述方法所获得的虫体冻融5 7次，经超声波进行破碎。将破碎好的抗原 液4。C下，以8000r/min离心20分钟，收集上清液，通过凝胶层析法，收集峰 值蛋白作为ELISA抗原。
二. HRP标记的兔抗羊二抗的制备过程 用常规方法制备兔抗羊IgG
健康羊血清在35%的饱和硫酸胺沉淀3次，然后4度作用20分钟，3000转 离心10分钟。沉淀加入生理盐水充分溶解后过DEAE纤维素柱，收集峰值IgG 蛋白。用聚乙二醇浓縮提纯的IgG后用弗氏完全佐剂乳化免疫兔子，l个月后再 用弗氏不完全佐剂乳化的IgG二免兔子，3个月后用不完全佐剂乳化的IgG三免 兔子，后采血分离血清，琼脂扩散实验效价1: 32时即可放血，分离血清后提 取兔抗羊IgG (方法如上)。
酶结合物的标记(采用改良的过碘酸钠法制备酶结合物) 取6mg服P (辣根过氧化物酶)溶于0. 5ml蒸馏水中，加入新配制的0. 06MNal04 水溶液0.5ml， 4度放置40分钟，取出后加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，室 温放置1小吋，加入含5mg的纯化的兔抗羊IgG的水溶液1 ml，混匀后置入透 析袋，在0.05 M的碳酸盐缓冲液中透析过夜。
将结合的酶结合物吸出，加入Na朋4 (5mg/ ml) 0.2 ml，置4度，2小时。 在结合物中加入40%的饱和硫酸铵(PH7.2)， 4度作用30分钟，4度5000转离 心10分钟，将沉淀中液体吸干，将沉淀物溶于0.02M的PBS (PH7.4)中，并 透析过夜，期间换液4次，4度5000转离心IO分钟，弃沉淀，将上清测标记 率后置冰箱备用。
三. 标准阴阳性血清的制备
标准阳性血清的制备用60只青海血蜱饥饿成蜱感染无泰勒虫病的2只羊，在 饲喂蜱后的一个月，再用200只青海血蜱饥饿成蜱进行二次感染。于第二次上蜱后的10 30天，每隔10天采血20ml，分离血清，混合后置-2(TC冰箱备用。 标准阴性血清的制备从甘肃省景泰县无羊泰勒虫病地区选购年龄为4 6月的 20只绵羊，在采血前一周，每天从耳尖采血制作血涂片，姬姆萨染色镜检，确 定无任何种血孢子虫寄生。采血分离血清，混合后置-2(TC冰箱备用。
四. 检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒的制备
(1) 用碳酸盐缓冲液将保存的裂殖子抗原稀释成效价为1:160即含量为 0. lug/孔，按每孔剂量加入96孔ELISA检测酶标板，轻轻振荡混匀后置 37°C1小时然后4"C过夜。
(2) 用pH7. 2的PBST洗涤所述96孔ELISA酶标板4次。
(3) 拍干液体。称取0.25g明胶加入50ml碳酸盐缓冲液中，加热溶解后 冷却至室温，每孔加入200ul， 37。C温育30分钟后甩干。
(4) PH7. 2 PBS+0. 1%吐温-20洗4次，装入96孔ELISA酶标板专用包装袋， 用封口机封口后4'C保存。
(5) 用加入0.5。/。明胶的PBST (PH7.2)将辣根过氧化物酶标兔抗羊IgG稀 释成1:800的浓度。
五、 辅料制备
25XPBST配制(pH7. 2; NaCl， 100. 0g; KC1， 5. 0g; MgCl2*6H20， 2. 5g; KH2PO" 5.0g; Na2HP04, 28 . 5g; CaCl2' 2H20， 2. 5g; Tween-20 12.5ml，用蒸馏水定容 1000ml)
血清稀释液制备用(1)所述O. 01M PBS中加入O. 5%明胶(W/V)。
底物稀释液配制柠檬酸(含一分子水)5. llg， Na2HP04, 7. 3g，溶解于900ml 无离—f水中，调整pH为5.0后定容至1000ml。
试剂盒的组装，试剂盒含96孔ELISA检测板1块，酶标兔抗羊IgG(O. 5ml/ 支)l支，标准阴阳性血清各20ul， 30%H2O2 (5ml/支)1支，2MH2S04 (10ml/ 支)1支，lg明胶1瓶，酶底物1片，底物稀释液一瓶50ml。
本发明建议经用分子筛柱分离纯化标记抗原采用1. 5mlE卯endorf管保存， 每支装O. 5ml;用高密度聚乙烯塑料管封装30。/。的过氧化氢水溶液1支(5ml/支)； 用纸包装1片邻苯二胺；同样用高密度聚乙烯塑料管封装2摩尔的硫酸1支
(10ml/支)。考虑到本检测盒使用中所需用的清洗液(即磷酸缓冲液)较多， 在盒内不再带有清洗液，而由使用者自行配制。或者再在本发明的检测试剂盒中增加25X浓縮洗液25ml/瓶，移液槽3个，以方便使用。 六、本发明的试剂盒使用方法如下
1. 称O. 25g明胶加入到50ml PH7.2PBST中，加热溶解，冷却至室温，用 此稀释血清1: 400，每孔加入100ul稀释血清，37。C温育1小时，PBST洗4次， PBS洗2次；
2. 按要求用加入0.5y。明胶的PBST稀释二抗1: 800 (兔抗羊IgG)，每孔加 入100ul ， 37。C温育1小时，PBST洗2次。
3. PBS洗2次，每孔加入配好的底物100ul。
4. 37。C避光放置约20分钟，每孔入50ul 2M 1^04终止反应。
5. 在Internal Barcode Reader上492nm处读出OD值，并按卜列公式计 算出OD比值
卜,待检血清样品平均OD值一标准阴性fe清平均OD值
标准阳性血清平均OD值一标准阴性血清平均OD值 X 100
结果判定在标准阳性血清平均OD值大于L 0且P/N值大于2时，测定结 果方为有效。否则，应査明原因重做。OD比值小于15%，判定为OD比值在 16-20%，判定为"±" ;0D比值在21-40%,判定为"+ "; OD比值在41-60%,判 定为"+ + "; 0D比值大于60y。，判定为"+ + + ，，。
权利要求
1. 一种检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于包括可与待测样品结合的固体支持物；包被于可与待测样品结合的固体支持物上的羊泰勒虫裂殖子抗原，每孔0.1ug；作为二抗的用酶标记的兔抗羊IgG；标准羊泰勒虫阳性血清；标准羊泰勒虫阴性血清；明胶；底物稀释液；30％H2O2；无色底物；终止液；磷酸盐缓冲液。
2、 根据权利要求1所述的一种检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒，其特 征在于所述的固体支持物为酶标板；所述的底物稀释液为柠檬酸-磷酸盐缓冲液； 所述的无色底物为邻苯二胺；所述的终止液是2摩尔的硫酸；所述的酶为辣根 过氧化物酶；所述的磷酸盐缓冲液为25 X浓縮PBST洗液。
3、 一种制备如权利要求1所述检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒的方法， 其特征在于a. 包被抗原用0. 05MPH9.6碳酸盐缓冲液稀释羊泰勒虫裂殖子抗原浓度至 O.lug/孔，将此稀释抗原按100ul/孔加入酶标板，加盖后37t温箱放置1小时后， 4'C冰箱过夜；b. 洗涤用PH7.2PBS+0.1。/。吐温-20洗涤包被抗原的酶标板4次；c. 封闭碳酸盐缓冲液中加入0.5y。明胶W/V，加热溶解后冷却至室温，每 孔加入200ul， 37°(3温育30分钟后甩干；d. 洗涤用PH7.2PBS+0.1。/。吐温-20洗涤封闭后的酶标板4次；e. 风干后密封4'C保存。
4、 根据权利要求1所述的一种检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒的使用 方法，其特征在于a.加被检血清在PH为7.2的PBST中加入0.5。/。明胶，加热溶解，冷却至室温，用此液体按l: 400稀释血清，每孔加入100ul稀释血清，37t:温育l小 时；b. 洗涤用1倍PBST洗4次,PBS洗2次；c. 加酶标二抗在PH为7.2的PBST中加入0.5%明胶，加热溶解，冷却 至室温，用此液体按l: 800稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，，每孔加入 100ul， 37r温育1小时；d. 洗涤用1倍PBST洗4次，PBS洗2次；e. 加底物每孔加入配好的邻苯二胺底物100ul,37。C避光放置约20分钟；f. 终止反应:每孔入50ul2MH2SO4终止反应；g. 在酶标仪上492nm处读出OD值。
全文摘要
一种检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒及其制备方法，包括可与待测样品结合的固体支持物；包被于可与待测样品结合的固体支持物上的羊泰勒虫裂殖子抗原，每孔0.1ug；作为二抗的用酶标记的兔抗羊IgG；标准羊泰勒虫阳性血清；标准羊泰勒虫阴性血清；明胶；底物稀释液；30％H₂O₂；无色底物；终止液；磷酸盐缓冲液。经包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、风干后密封4℃保存等工艺制备而成。本发明具有虫体抗原特有的高特异性；该ELISA诊断试剂盒实现了本病检测的标准化、自动化、且适合羊泰勒虫病的早期诊断和大规模的野外血清流行病学调查。能早期诊断本病，一般在感染后5天就能检出特异性抗体，检测出血清抗体的最早时间比比传统显微镜检测出的时间提前5-10天。
文档编号G01N33/569GK101285838SQ20081001831
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者关贵全, 刘志杰, 李有全, 宏 殷, 罗建勋, 马米玲, 高玉龙 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所