专利名称：硝基呋喃类药物代谢物残留的酶联免疫检测试剂盒及使用方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种检测动物源性 食品中硝基呋喃类药物代谢物残留的酶联免疫检测试剂盒及其方法。
背景技术：
硝基呋喃类药物GW^y^w朋s)是人工合成的具有5—硝基呋喃
基本结构的广谱抗菌药物，硝基呋喃类抗生素主要包括呋喃唑酮
(尸i/razc^油/ e)、 呋喃它酮 (/^ah油"e)、 呋喃西林 GW^o/"r^朋e)、呋喃妥因GWz^o/z^朋toi/7)等，这类抗生素因其 具有抑菌性和杀菌性而广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病 的预防与治疗，部分品种具有促生长的作用，可用作饲料添加剂。
硝基呋喃类药物是一类具有潜在致癌和诱导有机体产生突变的 物质。由于呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等硝基呋喃类 抗生素在体内代谢迅速，其代谢产物3-氨基-2-恶唑烷酮(A0Z)、 3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(AM0Z)、氨基脲(SC)和1-氨基-乙内 酰脲(AH)能与蛋白质结合，形成比原药化合物更稳定的蛋白结合物。 这些代谢物可以在弱酸性条件下(如人类胃液的酸性条件)从蛋白质 中释放出来，因此当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这 些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人 体吸收而对人类健康造成危害。
欧盟委员会于2003年通过了 2003/181/EC委员会决议，建立了用于检测禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物的代谢物的各种方法
的最小要求性育u限值(i/j'm'迈〃ffl We《"j'i-ed尸ar/bi7Z7a77ce ,iiBJ' ts， i/j 尸丄) 为1 U g kg"，也就是说欧盟实验室检测硝基呋喃类药物的代谢物的 各种方法的灵敏度都要达到1 P g kg—1，欧盟从第三国进口的动物性 产品中硝基呋喃类药物的代谢物的含量不得超过lPg kg—、因此， 为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠， 灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。
在国内外已经发表有关硝基呋喃类抗生素的残留检测方法的文 献中，早期的文献报道大多数是检测原药化合物。然而由于硝基呋喃 类抗生素对光敏感，具有代谢快速的特点，在动物体内的半衰期不过 数小时，通常不太可能检出原药的残留，例如呋喃唑酮在停药后12h 内从组织中消失，而其代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(A0Z)在动物体内则 以组织蛋白结合物的形式存在，在体内可残留数周，在停药后至少6 周内A0Z在猪肌肉组织中继续存在，因此当原药浓度降至检测限以下 时，检测其代谢物浓度是可能的。其他硝基呋喃类抗生素也有类似特 性。
目前，检测AM0Z， A0Z、 SC和AH等残留的方法主要有电喷雾-串联 质谱(ESI—MS—MS)、液相色谱-质谱联用法(LS-MS)以及液相色谱 -串联质谱法(LS-MS-MS)等。尽管仪器分析方法灵敏、准确，但通 常需要对样品进行繁琐的预处理，耗时、成本高，而且所用仪器比较 昂贵且庞大笨重，需要专业技术人员维护，不适于现场检测。免疫测 定技术的应用弥补了上述技术的缺陷，具有简单、快速并且灵敏的特点，可达痕量(Ug kg")水平，是目前世界各国推行并实施的一种
高通量初筛方法。
目前已有应用于硝基呋喃类抗生素代谢物检测的免疫测定技术
及试剂盒，但均只能进行单一药物代谢物残留的检测，例如目前市售
国内外试剂盒均为单一药物残留检测试剂盒，且查找国内相关专利也 均为单一药物代谢物残留检测试剂盒及方法，如专利《检测呋喃西林
代谢物的酶联免疫试剂盒及其应用》，申请号200710063871.8;专
利《呋喃妥因代谢物酶联免疫分析试剂盒及其应用》，申请号
200710063837.7;专利《检测呋哺它酮代谢物的酶联免疫试剂盒及其 应用》，申请号200710063872.2;专利《一种用于呋喃唑酮残留分 析的酶联免疫检测试剂盒及应用》，申请号200510086346. 9等。然 而，免疫测定技术作为一种高通量初筛的方法，如果只能检测单一代 谢物，尤其对硝基呋喃类抗生素代谢物残留检测的意义就不大了，因 为硝基呋喃类抗生素包括几种，如呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、 呋喃妥因等，其代谢产物又分别为3-氨基-2-恶唑烷酮(A0Z)、 3-氨 基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)、氨基脲(SC)和1-氨基-乙内酰 脲(AH)，所以检测单位在实际检测中需要对这几类代谢物均进行检 测，如果免疫试剂盒只能检测一种代谢物，因为有4种代谢物， 一个 样品就必须检测4次，这样就会延长了检测时间、增加了检测工作量、 而且增加了检测成本，失去了初筛方法的意义了。
总之，国内外现有硝基呋喃免疫检测方法检测对象单一，很难应 用于实践，且现有产品由于普遍存在稳定性差、样品前处理及检测步骤复杂、设备条件要求较高、价格昂贵等不足，严重影响了硝基呋喃 类抗生素的检测与监控，因此研制多残留检测、操作简单、设备要求
低、廉价的硝基呋喃类抗生素代谢物多残留ELISA试剂盒具有非常重
要的经济和社会意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有硝基呋喃检测技术的不足，提供一种既 能同时检测多种硝基呋喃类抗生素代谢物总残留，又可检测单一硝基 呋喃抗生素代谢物残留，高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量 快速检测硝基呋喃类抗生素代谢物的酶联免疫检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供所述酶联免疫试剂盒检测硝基呋喃类 抗生素代谢物残留的使用方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下测定原理首先将多种代谢 物偶联抗原包被于固相载体例如酶标板上，然后加入标样或待测样 品，再加入多种酶标记代谢物抗体的混合液，包被抗原与待测样品中 的代谢物竞争酶标抗体，待测样品代谢物含量高时，则与固相抗原结 合的酶标抗体就少，反之结合在固相抗原上的酶标抗体就多，反应后 加入底物进行显色加以测定，当酶标抗体量一定时，加入的待测样品 含代谢物越多，与固相抗原结合酶标抗体就越少，发色反应减弱，百 分吸光度值低，反之，则发色反应增强，百分吸光度增高，因而根据 百分吸光度值与代谢物浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，再 根据标准曲线和待检样品的百分吸光度值，即可推算出待测样品中代 谢物的浓度。本发明的技术方案是提供一种检测硝基呋喃类药物代谢物残留 的酶联免疫试剂盒，包括
(1) 包被多种硝基呋喃代谢物偶联抗原的酶标板；
(2) 酶标记抗体工作液；
(3) 硝基呋喃代谢物标准溶液；
(4) 底物液；
(5) 底物缓冲液；
(6) 反应终止液；
(7) 浓縮洗涤液；
(8) 样品稀释浓縮液。
所述酶标板是96孔或40孔酶标板，酶标板孔内包被有能与抗硝
基呋喃代谢物抗体特异结合的多种硝基呋喃代谢物偶联抗原，其是使
用碳二亚胺法(EDC)、活泼酯法(DCC、 NHS)、混合酸酐法(氯甲酸 异丁酯)将A0Z、扁0Z、 SC和AH等代谢物半抗原与载体蛋白偶联得 到的，所用的包被液为pH9.6、 0. 05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，碳酸 盐缓冲溶液含1 2g碳酸钠和2 4g碳酸氢钠以及双蒸水1L，封闭 液为1 5%脱脂奶粉溶液。
所述硝基呋喃代谢物抗体的制备过程中，所用的免疫原为采用活 泼酯法(DCC、 NHS)或混合酸酑法(氯甲酸异丁酯)将代谢物半抗原 与载体蛋白共价偶联合成得到的，以免疫抗原免疫兔子或小鼠，制备 硝基呋喃代谢物多克隆抗体、利用杂交瘤技术制备硝基呋喃代if物单 克隆抗体或利用基因工程方法制备基因工程抗体。收集抗血清、腹水、发酵液等，用辛酸硫酸铵沉淀纯化或过亲和层析柱进行纯化。
所述酶标记硝基呋喃代谢物抗体工作液为采用戊二醛法或过碘
酸盐氧化法将酶与代谢物(A0Z、扁0Z、 SC和AH等)抗体进行分别 偶联后按一定比例混合得到的。所用标记酶可为辣根过氧化物酶或细 菌提取碱性磷酸酯酶，本发明优选为辣根过氧化物酶，且采用改良后 的过碘酸盐氧化法进行标记，提高了标记效率，节省了酶与抗体的用 量，保证标记后酶与抗体具有良好的活性。
所述硝基呋喃代谢物标准溶液分别为AOZ标准溶液、AM0Z标准 溶液、SC标准溶液和AH标准溶液等，不同代谢物标准溶液的浓度均 为8,lug/L、 2.7ug/L、 0.9ug/L、 0.3ug/L、 0.1pg/L和0u g/L。
所述底物显色液当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物液为含有 3，3，5，5—四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(0PD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5. 0磷 酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的 氢氧化钠溶液；
当标记酶为细菌提取的碱性磷酸酯酶时，所述底物液为对硝基磷 酸盐缓冲液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5. 0磷 酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1 2mol/L^^酸溶液或2mol/L的 氢氧化钠溶液。
所述浓縮洗涤液为含0.5 1.5%吐温20的磷酸盐缓冲液，磷酸 盐缓冲液pH7.4，浓度为O. lmol/L，为正常使用浓度的15 25倍。所述样品稀释浓縮液为pH7.4、 0. l 0.25mol/L的磷酸盐缓冲 液，为正常使用浓度的5 15倍。
可以作为固定硝基呋喃代谢物抗原的载体的物质较多，例如聚苯 乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、玻 璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以为凹孔、纸片、小珠 等。
本发明所述抗原抗体的制备方法具体陈述如下
(1)抗原的合成
半抗原的合成
a. 代谢物A0Z半抗原的合成
3-氨基-2-恶唑垸酮(A0Z)与对酸基苯甲酸反应生成带有羧基的 半抗原。
b. 代谢物AM0Z半抗原的合成
3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑垸酮(AM0Z)与对醛基苯甲酸在水 中反应生成带有羧基的半抗原。
c. 代谢物SC半抗原的合成
将氨基脲(SC)的硝基还原为氨基，生成带有氨基的半抗原。
d. 代谢物AH半抗原的合成
1 -氨基-乙内酰脲(AH)与间醛基苯甲酸在水中反应生成带有羧基 的半抗原。
包被原和免疫原的合成
将硝基呋喃代谢物半抗原和牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白，通过碳二亚胺法(EDC)、 活泼酯法(DCC、 NHS)、混合酸酐法(氯甲酸异丁酯)进行偶联得到 包被抗原与免疫原。免疫原与包被原通过柱层析进行纯化，纯度经 SDS—PAGE电泳鉴定。
(2) 硝基呋喃代谢物单克隆抗体的制备
动物免疫以代谢物半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c 小鼠进行间隔免疫，间接ELISA检测并得到血液里含有代谢物特异性 抗体的小鼠脾脏。
细胞融合与克隆取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨 髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液， 筛选阳性 L。利用有限稀释法或显微克隆法对阳性孔进行克隆化，得 到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成 细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管， 立即放入37'C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8 周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7 14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7 10天后采集腹水。经辛酸一饱和硫酸胺法或亲和层析法进行腹水纯 化，纯度经SDS—PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-2(TC保存。
(3) 硝基呋喃代谢物兔多克隆抗体的制备 采用新西兰大白兔作为免疫动物，以硝基呋喃代谢物半抗原与载
体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
(4)硝基呋喃基因工程抗体的制备
基因工程抗体主要指小分子抗体，包括Fab (由完整的轻链和 Fd构成)，Fv (由VH和VL构成)，ScFv (单链抗体，VH和VL之间由 一条连接肽连接而成)，单域抗体(仅由VH组成)，或多特异性抗体 (将不同特异性的单链抗体通过连接肽连接在一起，同时具有多种单 链抗体的特异性)等经基因工程技术改造后的抗体。
制备方法为提取硝基呋喃代谢物单克隆细胞或经硝基呋喃代谢 物免疫原免疫后的小鼠脾细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重 链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基因，将轻重链基因 进行连接制备单链抗体，或再将不同单链抗体进行连接制备多特异性 单链抗体，然后插入适当的表达质粒，在大肠杆菌中表达，利用免疫 亲和方法进行纯化，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定。
其中，酶标记硝基呋喃代谢物抗体的制备
将硝基呋喃代谢物抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用过碘酸钠 法进行偶联。具体方法为
① 溶解5mg HRP于lmL超纯水中，加入新配置的0. lmol/L过碘 酸钠75 ii L，置室温或4"C冰箱反应20min或30min。
② 反应完后装入透析袋，0. 001mol/L pH4. 0醋酸缓冲溶液4'C透 析过夜，期间需更换透析液几次。
③ 将抗体用0.1mol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/mL，另外用 0. lmol/L碳酸缓冲液将活化好的服P的溶液pH调至9. 5。将0. 5mL抗体加入HRP溶液中，置室温或4"冰箱反应2h。
加入100 ii L 4mg/mL硼氢化钠，4。C冰箱反应2h。 ⑤对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液-2(TC保藏备用。 将不同的酶标记硝基呋喃代谢物抗体按照一定比例进行混合，即
得酶标记物溶液。
其中，酶标板的制备方法为
用包被缓冲液将不同的硝基呋喃代谢物抗原按需要稀释，向酶联
板微孔中加入抗原稀释液，放入37t:环境进行孵育，再放入4r环境
中过夜孵育，得到的酶联板的稳定性好，倾去包被液，用洗涤液洗涤， 然后在每孔中加入封闭液，37T:孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜 真空密封保存。
本发明同时提供了利用上述酶联免疫试剂盒进行动物源性食品 中硝基呋喃检测的方法，包括以下步骤
(1) 样品前处理；
(2) 使用试剂盒检测；
(3) 结果处理与分析。 本发明提供待测样品前处理方法为
将组织样品用组织匀浆机高速匀浆；牛奶样本离心去除脂肪层； 蜂蜜样本加蒸馏水溶解均匀；将鸡蛋样本破壳后取出蛋清蛋黄，轻轻 搅匀防止泡沬产生。
(1)动物组织例如鸡肉、猪肉或鱼虾
取2±0. 05g的组织样品的均质物，加入8mL的蒸馏水，lmLlM HCL和200n L10mM的2—硝基苯甲醛，充分振荡；在37。C过夜孵育大约 12h;加入10mL 0. 1M K2HP04， 0. 8mL 1M NaOH和10mL乙酸乙酯，剧 烈振荡lmin;在室温20 25。C下3000g以上离心10min;取出5mL 乙酸乙酯到另一个容器中5(TC下氮气吹干；用2mL正己烷溶解干燥 物，用2mL已稀释好的复溶液充分混合；在室温20 25t:下3000g 以上离心lOmin;取50 u L下层液体用于分析。
(2) 牛奶
取出lOmL牛奶样本到玻璃离心管中；分别加入0. 36M亚硝基铁 氰化钠缓冲液和1M硫酸锌缓冲液各200 u L;充分混合样本后，在4 l(TC用恒温离心机3000g以上离心10min。取牛奶的离心上清液2mL， 加入16mL的蒸馏水，2mL 1M HCL和200 u L10mM的2—硝基苯甲醛， 充分振荡；在37。C过夜孵育大约12h;加入lOmL 0. 1M K2HP04， 0. 8mL 1MNaOH和10mL乙酸乙酯，剧烈振荡lmin;在室温20 25。C下3000g 以上离心10min;取出5mL乙酸乙酯到另一个容器中5(TC下氮气吹干； 用2mL正己烷溶解干燥物，用2mL已稀释好的复溶液充分混合；在室 温20 25。C下3000g以上离心lOmin;取50 u L下层液体用于分析。
(3) 蜂蜜
取出2g蜂蜜样本到离心管中；加入16mL的蒸馏水振荡溶解， 2mLlM HCL和200yL10mM的2—硝基苯甲醛，充分振荡；在37。C过 夜孵育大约12h;加入10mL 0. 1M K2HP04， 2mL 1M NaOH和10mL乙酸 乙酯，剧烈振荡lmin;在20 25。C下3000g以上离心10min;取出 12mL乙酸乙酯到另一个容器中50。C下氮气吹干；用2mL正己烷溶解干燥物，用4mL已稀释好的复溶液充分混合；在20 25。C下3000g 以上离心10mim取50 u L下层液体用于分析。 (4)鸡蛋取出4g已制备好的鸡蛋样本到100mL离心管中；分别加入16mL 水，2mLlMHCL， 400 y L 0. 36M的亚硝基铁氰化钠缓冲液，振荡混匀； 加入400uL 1M硫酸锌缓冲液，充分振荡8min，室温(20 25°C) 3000g以上离心10min，取出全部上清液，加入400 y L10mM的2_硝 基苯甲醛，充分振荡，5(TC水浴2h，每半个小时剧烈振荡1 2分钟； 分别加入10mL0. 1M K2HP04， lmL 1M NaOH和8mL乙酸乙酯，剧烈振荡 lmin，在室温下(20 25°C) 3000g以上离心10min;取出6mL上层 有机相于5(TC下氮气吹干；用2mL正己烷溶解干燥物，加入4mL已 稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20 25°C) 3000g以上离心 10min;去除上层有机相；取下层水相50uL用于分析。使用试剂盒检测的步骤为(1) 将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡；(2) 将标准品或待测样品加入已经包被有硝基呋喃代谢物抗原 的酶标板孔内，然后每孔加入酶标记物，轻拍混匀，孵育；(3) 洗涤；(4) 每孔加入等量的底物缓冲液与底物液，轻拍混匀，避光孵育；(5) 每孔加入反应终止液，混合均匀，在波长450nm或492nm 下，以空气为空白，酶标仪测定各孔吸光值；本发明提供的检测结果处理与分析方法为以所获标准样品吸光值的平均值计算百分吸光度值，以百分吸光 度值为纵坐标，硝基呋喃代谢物标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制 标准曲线，求出直线方程。用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度 值，根据方程式求出对应样品的硝基呋喃代谢物浓度。所述百分吸光 度值的计算式为百分吸光度值(%)= (B/Bq) X100其中，B为标准溶液或样品的平均吸光值，Bo为0ug/L标准溶液的平均吸光度值。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对硝基呋喃代谢物线性检测范围为0. 1 8. 1 Ug/L，检测限为0. lu g/L，整个检测过程只需35min就可以完成。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1) 本发明的试剂盒既可同时检测多种硝基呋喃抗生素代谢物 总残留，又可检测单一硝基呋喃代谢物残留，避免了同一样品需要检 测多次的问题，节省了检测时间与成本，同时降低了漏检的机率；(2) 本发明的试剂盒采用直接竞争ELISA检测模式，减少了操作步骤，提高了检测的灵敏度、准确度；(3) 本发明的试剂盒采用不同包被抗原混合进行酶标板的包被， 相对于抗体包被，更有利于达到较好的包被效果与较长的保存时间， 从而提高了试剂盒检测的精密度与稳定性；(4) 本发明的试剂盒利用酶标记抗体技术，将酶直接标记于不同的硝基呋喃代谢物特异性抗体上，将硝基呋喃代谢物特异性抗体与 酶两种最重要的反应物合二为一，不仅大大简化了操作步骤和反应时 间，减少了因操作复杂引起的误差，而且无需在试剂盒内再配置抗抗 体，同时也节约了硝基呋喃代谢物特异性抗体与酶的用量，从而大大 降低了试剂盒的成本。基于以上优点本试剂盒非常适用于硝基呋喃代谢物残留的痕量 分析与批量检测，具有重要的现实意义。
图l为标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。 实施例l抗原的制备 (1)硝基呋喃代谢物半抗原的制备a. 代谢物A0Z半抗原的合成3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)与对醛基苯甲酸反应生成带有羧基的半 抗原。b. 代谢物AM0Z半抗原的合成3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(細OZ)与对醛基苯甲酸在水中 反应生成带有羧基的半抗原。c. 代谢物SC半抗原的合成将氨基脲(SC)的硝基还原为氨基，生成带有氨基的半抗原。d. 代谢物AH半抗原的合成氨基-乙内酰脲(AH)与间醛基苯甲酸在水中反应生成带有羧基的 半抗原。(2)硝基呋喃代谢物抗原的制备a. 将50n mol/L硝基呋喃代谢物半抗原溶解在lmL的DMF中，然 后在该溶液中加入等摩尔的DCC和NHS，让其在室温下反应过夜；b. 离心，取上清液800 p L，缓慢加入到4mL 15mg/mL的BSA或OVA 载体蛋白碳酸缓冲溶液中，然后在磁力搅拌下反应4h;c.待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次，然后用 0.8%生理盐水透析，得产物；d.采用1998年陈新建等公开的紫外扫描测定结合比方法测定结 合比，最后将抗原浓縮保存或冻干保存得到硝基呋喃免疫原和包被原，分装保存于-2crc的冰箱中。实施例2抗体的制备硝基呋喃代谢物鼠单克隆抗体制备动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以硝基呋喃代 谢物半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为60u g/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免 疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按4: 1比例与 SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液， 筛选阳性孔。利用显微克隆法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5Xl()S个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在—7(TC超低温冰箱中长 期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37X:水浴中速融，离心去除 冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8 周龄)腹腔注射杂交瘤细胞5乂106个/只，14天后采集腹水。用免疫 层析法进行腹水纯化，小瓶分装，-2(TC保存。 实施例3辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的提取 1、辣根过氧化物酶的提取a. 水提取称取20千克已洗干净的鲜辣根或辣根皮，切成小块， 在粉碎机中绞碎。碎渣浆加10千克水在低温下搅拌浸提8小时，以 3000转/分速度离心10分钟，收集上清液。b. 硫酸铵分级分离每升滤液加226克硫酸铵粉末，边加边搅 拌，置室温下过夜。次日吸取上清液，再按每升上清液加258克硫酸 铵粉末，随加随搅拌，待硫酸铵完全溶解后，置冷室过夜。次日吸去 上清液，沉淀部分在冷冻离心机中以13000转/分离心20分钟，弃去 上清液，收集沉淀。将沉淀溶于200 300毫升蒸馏水中，分装于透 析袋中，在流动水中透析1 2天，直至透出的水加入氯化钡溶液无 沉淀生成为止。然后再在蒸馏水中透析8小时。合并透析液，在冷冻 离心机中以4000转/分离心15分钟，收集上清液。c. 丙酮分级分离将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用滴管沿杯壁加入等体积预冷至一15"C的丙酮，在冷冻离心机 中以4000转/分离心15分钟，收集上清液，再加入原上清液体积0. 8 倍的一15'C丙酮，离心(条件同上)收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏 水中，透析(方法同上)除去丙酮，即得粗服P。d.精制每升粗酶液加入1毫升1摩尔硫酸锌溶液，在冷冻离 心机中以5000转/分离心10分钟，收集上清液，分装于透析袋内， 于流水中透析除硫酸锌，约需1天，然后在蒸馏水中透析8小时。将 透析液合并，进行真空干燥即得精制HRP。产品呈米黄色纤维状松软 物。2、碱性磷酸酶利用产生碱性磷酸酯酶的E CWW， 317菌株发酵培养，发酵液 经离心(8000r/min， 10min)后，沉淀的菌体经5X 10—4M EDTA—O. 03M pH 8.0 Tris — 0.5M蔗糖高渗液处理后用溶菌酶破壁，上清酶液经 DEAE纤维素搅拌吸附和洗脱，热处理和S印hadex G-100分子筛层析 纯化。实施例4酶标记硝基呋喃代谢物抗体的制备辣根过氧化物酶HRP标记硝基呋喃代谢物抗体的制备采用过碘 酸盐氧化法，具体方法为a. 溶解5mg服P于lmL超纯水中，加入新配置的0. lmol/L过碘 酸钠75 li L，置室温或4。C冰箱反应20min或30min。b. 反应完后装入透析袋，0. 001mol/L pH4. 0醋酸缓冲溶液4。C透 析过夜，期间需更换透析液几次。c. 将硝基呋喃代谢物抗体用O.lmol/L碳酸缓冲液稀释至 10mg/mL，另外用0. lmol/L碳酸缓冲液将活化好的HRP的溶液pH调 至9.5。将0.5mL抗体加入HRP溶液中，置室温或4。C冰箱反应2h。d. 加入100nL 4mg/mL硼氢化钠，4'C冰箱反应2h。e. 对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液-20。C保藏备用。 实施例5酶联免疫试剂盒组分的配制(1) 浓縮洗涤缓冲液的配制含0.5 1.5%吐温20的磷酸 盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH7.4，浓度为O. lmol/L，为正常使用浓度 的15 25倍。(2) 样品稀释浓縮液的配制pH7.4、 0. 1 0.25mol/L的磷酸 盐缓冲液，为正常使用浓度的5 15倍。(3) 封闭液的配制脱脂奶粉1. 0 5. 0 g溶于100mL蒸馏水。(4) 底物缓冲液的配制:30%过氧化氢30 u L溶于19mL的pH5. 0 磷酸-柠檬酸缓冲液中，4。C保存。磷酸-柠檬酸缓冲液的配制0.2M Na2HP0425. 7mL， 0. 1M拧檬酸24. 3mL，加蒸馏水50mL。(5) 底物液的配制将3， 3， 5， 5 —四甲基联苯胺(TMB) 80mg溶 于10mLpH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液中，4t:保存。磷酸-柠檬酸缓冲液 的配制0. 2MNa2HP0425. 7mL， 0. 1M柠檬酸24. 3mL，加蒸馏水50mL。(6)酶标板微孔板的包被4种硝基呋喃代谢产物A0Z、 M0Z、 SC和AH的偶联抗原用pH9. 6， 0. 05mol/L的碳酸盐缓冲溶液稀释成 0. 1 5ug/mL然后按4:4:1:1的比例混合，其中碳酸盐缓冲溶液 含1 2g碳酸钠和2 4g碳酸氢钠，双蒸水1L。在酶标板的每孔加100uL， 37。C包被lh后4。C下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤 3次，拍干，然后在每孔中加入200uLl. 0 5. 0%脱脂奶粉，放入37 。C温箱中lh后用PBST洗漆3次，干燥后封入铝箔袋中4。C保存。(7) 将标记好的4种代谢产物A0Z、 AM0Z、 SC和AH的不同酶标抗体按照4:4:i:i的比例混合配制酶标记抗体工作液。(8) 硝基呋喃代谢物标准溶液的配制准确称取硝基呋喃代谢物A0Z标样8. lug，溶于0.01L缓冲液中，然后用缓冲液稀释分别 配制8, 1 u g/L、 2. 7 n g/L、 0. 9 n g/L、 0. 3 u g/L、 0. 1 u g/L硝基呋 喃代谢物AOZ标准溶液，另外缓冲液配制Oug/L对照样，4i:保存； 其他3种代谢产物AMOZ、 SC和AH的标准溶液的配制同上。(9) 试剂分装各种试剂按要求配制，测定合格后无菌分装。 酶标记抗体工作液7mL/瓶，硝基呋喃代谢物标准样品lmL/瓶，底物 液7mL/瓶，底物缓冲液7mL/瓶，终止液7mL/瓶，浓縮洗液50mL/瓶， 浓縮样品稀释液50mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4°C 保存。(10) 试剂盒的组装分别将可拆卸包被好多种硝基呋喃代谢物 偶联抗原的微孔板1块，酶标记抗体工作液、底物液、底物缓冲液、 终止液、浓縮洗液、浓縮样品稀释液各1瓶，硝基呋喃代谢物标准溶 液24瓶，4种不同代谢物各6个，使用说明书1份置试剂盒内指定 位置。试剂盒检验合格后封装，4X:保存。实施例6酶联免疫试剂盒组分的配制实验步骤同实施例5，不同的是采用细菌提取的碱性磷酸酯酶为标记酶，所述底物液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的PH5. 0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为 1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液，按照实验室常规方 法配制。实施例7组建检测硝基呋喃的酶联免疫试剂盒，包含下述组分(1) 包被了多种硝基呋喃代谢物偶联抗原的96孔酶标板；或者 根据需要选择40孔酶标板；(2) 酶标记抗体工作液，7mL/瓶；(3) 硝基呋喃代谢物标准品溶液24瓶，A0Z、 AM0Z、 SC和AH 每个代谢物标准溶液的浓度均为0ug/L、 0. lng/L、 0. 3ug/L、 0.9 ng/L、 2.7ug/L、 8. lng/L， lmL/瓶；(4) 底物缓冲液，7mL/瓶；(5) 底物液，7mL/瓶；(6) 终止液，7mL/瓶；(7) 浓縮洗涤液，50mL/瓶；(8) 浓縮样品稀释液，50mL/瓶；(9) 使用说明书，l份；(10) 盖板膜，2张；(11) 自封袋(含干燥剂)，l个。 实施例8待测样品前处理将组织样品用组织匀浆机高速匀浆；牛奶样本离心去除脂肪层； 蜂蜜样本加蒸馏水溶解均匀；将鸡蛋样本破壳后取出蛋清蛋黄，轻轻搅匀防止泡沬产生。(1) 动物组织例如鸡肉、猪肉或鱼虾取2士0.05g的组织样品的均质物，加入8mL的蒸馏水，lmLlM HCL和200iiL10raM的2 —硝基苯甲醛，充分振荡；在37。C过夜孵育 大约12h;加入lOmL 0. 1M K2HP04， 0. 8mL 1M NaOH和10mL乙酸乙酯， 剧烈振荡lmin;在室温下(20 25°C) 3000g以上离心10min;取出 5mL乙酸乙酯到另一个容器中5(TC下氮气吹干；用2mL正己烷溶解干 燥物，用2mL已稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20 25T:)3000g 以上离心10min;取50tiL下层液体用于分析。(2) 牛奶取出10mL牛奶样本到玻璃离心管中；分别加入0. 36M亚硝基铁 氰化钠缓冲液和1M硫酸锌缓冲液各200 u L;充分混合样本后，在4 l(TC用恒温离心机3000g以上离心10min。取牛奶的离心上清液2mL， 加入16mL的蒸馏水，2mL 1M HCL和200 u L10mM的2—硝基苯甲醛， 充分振荡；在37t:过夜孵育大约12h;加入lOmL 0. 1M K2HP04， 0. 8mL 1M NaOH和10mL乙酸乙酯，剧烈振荡lmin;在室温下(20 25°C) 3000g以上离心10min;取出5mL乙酸乙酯到另一个容器中50。C下氮 气吹干；用2mL正己烷溶解干燥物，用2mL已稀释好的复溶液充分混 合；在室温下(20 25°C) 3000g以上离心10min;取50uL下层液体用于分析。(3) 蜂蜜取出2g蜂蜜样本到离心管中；加入16mL的蒸馏水振荡溶解，2mLlM HCL和200uL10mM的2—硝基苯甲醛，充分振荡；在37"C过 夜孵育大约12h;加入10mL 0. 1M K2HP04， 2mL 1M NaOH和lOmL乙酸 乙酯，剧烈振荡lmin;在室温下(20 25°C) 3000g以上离心10min; 取出12rnL乙酸乙酯到另一个容器中5(TC下氮气吹干；用2mL正己垸 溶解干燥物，用4mL已稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20 25 °C ) 3000g以上离心10min;取50 u L下层液体用于分析。 (4)鸡蛋取出4g己制备好的鸡蛋样本到lOOmL离心管中；分别加入16mL 水，2mLlMHCL， 400 n L 0. 36M的亚硝基铁氰化钠缓冲液，振荡混匀； 加入400uL 1M硫酸锌缓冲液，充分振荡8min，室温(20 25°C) 3000g以上离心10min，取出全部上清液，加入400 p L10mM的2—硝 基苯甲醛，充分振荡，5(TC水浴2h，每半个小时剧烈振荡1 2分钟； 分别加入lOmLO. 1M K2HP04， lmL 1M NaOH和8mL乙酸乙酯，剧烈振荡 lmin，在室温下(20 25°C) 3000g以上离心10min;取出6mL上层 有机相于50"C下氮气吹干；用2mL正己垸溶解干燥物，加入4mL已 稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20 25°C) 3000g以上离心 10min;去除上层有机相；取下层水相50uL用于分析。 实施例9试剂盒的检测方法(l)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温(20 24"C)平衡30min 以上，将足够标准和样品所用数量的条板固定于支架，标准和样品做 两个平行实验，按顺序编号；(2)在标准品孔加入50 u L标准品，样品孔加入50 u L待测样品。然后每孔加入50uL酶标记物，轻拍混匀。盖上盖板膜，在室温孵 育20min;(3) 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，每轮洗板 拍打3次，以保证完全除去孔中的液体。用250 u L蒸馏水充入孔中， 再次倒掉微孔中的液体，再重复操作3遍；(4) 每孔加入100 uL显色液(将底物缓冲液与底物液等体积混 合)，轻拍混匀，盖上盖板膜，暗处室温孵育15min;(5) 加入50pL反应终止液到微孔中。混合好在波长450nm或 492nm，以空气为空白，测定各孔吸光值，必须在加入终止液后60min 内读取吸光值。检测结果计算与分析以所获标准样品吸光值的平均值计算百分吸光度值，以百分吸光 度值为纵坐标，硝基呋喃标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲 线，求出直线方程。见附图1。 Y=—15.201X+87.907; R2=0.994。用 同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，根据方程式求出对应样品 的硝基呋喃代谢物浓度。所述百分吸光度值的计算式为 百分吸光度值(%)= (B/BQ) X100其中，B为标准溶液或样品的平均吸光值，Bo为0 u g/L标准溶 液的平均吸光度值。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对 硝基呋喃代谢物线性检测范围为0. 1 8. 1 ug/L，检测限为0. lu g/L，整个检测过程只需35min就可以完成。实施例IO试剂盒精密度与准确度试验1、标准品溶液重复性试验从3批按照实施例4 (6)中的方法制备的酶标板中，各抽出20 个微孔，测定0.9yg/L标准溶液的吸光度值(OD值)，重复20次， 计算变异系数CVX，结果见表l。表1标准品溶液重复性试验样品浓度Pg/L第l批第2批第3批批间CV%CV%CV%CTO标准品0.94.74.94.38.1结果表明试剂盒标准品检测的批内变异系数范围在4. 3 4. 9% 之间，批间变异系数为8. 1%。 2、样本重复性与准确度试验准确度是指测得值与真值的符合程度，在ELISA测定中，准确度 常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白鱼虾、牛奶、 蜂蜜中，将硝基呋喃添加至终浓度为1Pg/L(l^/kg)、 5Pg/L(^/kg)， 每个浓度各10个平行，测定3批。计算平均值、添加回收率及批内 与批间变异系数。结果见表2。表2样本重复性与准确度试验结果添加 样品浓度含:第l批回收第2批第3批 回收回收CV%含量CV%含量 率％ 率％ 率％批间cv% cv%鱼虫下10.83 83.0 6.7 0,85 85.0 8.4 0.81 81.0 9.3 14.95 4.205 84.1 5.7 4.09 81.8 7.9 4.18 83.6 8.9 13.4 1 0.913 91.3 4.4 0.83583.5 5.1 0.889 88.9 4.3 16.8牛奶5 4.565 91.3 7.1 4.43588.7 6.1 4.18 83.6 5.8 13.1 1 0.813 81.3 8.2 0.85385.3 5.2 0.813 81.3 6.3 15,6蜂蜜5 4.76 95.2 8.1 4.15583.1 9.8 4.06 81.2 8.9 13.9结果表明鱼虾、牛奶、蜂蜜样本的添加回收率在81.0 95.2%之 间，批内变异系数在4.3 9.8%之间，批间变异系数在13. 1 16.8 %之间。实施例11保存期试验(1) 将试剂盒放置于2 8T:，分别取0、 2、 4、 6、 8、 9、 10、 11和12个月的试剂盒，对硝基呋喃代谢物标准样品(0.1pg/L)的 吸光度值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测 定。(2) 将试剂盒在37"保存的条件下放置12天，每天对硝基呋 喃代谢物标准样品(0.1 iig/L)的吸光度值、50%抑制浓度、添加 回收率、批内变异系数各参数进行测定。(3) 将试剂盒在一2(TC冰箱保存12天，每天对硝基呋喃代谢物 标准样品(0.1 iig/L)的吸光度值、50%抑制浓度、添加回收率、 批内变异系数各参数进行测定。从结果可看出，经过三种条件保存试验，硝基呋喃代谢物标准样 品(0.1 ixg/L)的吸光度值下降小于5%，且0D不低于1.6; 50% 抑制率在0.5 1.0ug/L之间；添加回收率在75 105%之间；批内变异系数小于10%;各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以 在2 8"保存12个月。
权利要求
1、一种硝基呋喃类药物代谢物残留的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包含下列成分(1)包被了多种硝基呋喃代谢物偶联抗原的酶标板；(2)酶标记抗体工作液；(3)硝基呋喃代谢物标准溶液；(4)底物液；(5)底物缓冲液；(6)反应终止液；(7)浓缩洗涤液；(8)样品稀释浓缩液。
2、 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述酶标板采用96孔或40孔酶标板，包被有能与硝基呋喃代谢物抗体特异 结合的硝基呋喃代谢物偶联抗原，并封闭微孔表面未吸附硝基呋喃代 谢物偶联抗原的位点。
3、 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述硝 基呋喃代谢物抗原是采用碳二亚胺法、活泼酯法或混合酸酐法将硝基 呋喃代谢物半抗原与载体蛋白进行偶联得到。
4、 根据权利要求1所述酶联免疫分析试剂盒，其特征在于所述 酶标记硝基呋喃代谢物抗体工作液为采用戊二醛法或过碘酸盐氧化 法将标记酶与代谢物抗体进行分别偶联后按一定比例混合得到；所述 标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取的碱性磷酸酯酶；所述硝基呋喃代谢物抗体为鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体或基因工程抗体任意一 种。
5、 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当标记 酶为辣根过氧化物酶时，所述底物液为含有3， 3， 5, 5—四甲基联苯胺 或邻苯二胺的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述底物缓冲液为含有 过氧化氢或过氧化脲的pH5. 0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为 1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液；当标记酶为细菌提取的碱性磷酸酯酶时，所述底物液为对硝基磷 酸盐缓冲液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5， 0磷 酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的 氢氧化钠溶液。
6、 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓 縮洗涤液为含0.5 1.5%吐温20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液 pH7.4，浓度为O. lmol/L。
7、 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述样 品稀释浓縮液为pH7. 4、 0. 1 0. 25mol/L的磷酸盐缓冲液。
8、 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述硝 基呋喃代谢物标准溶液分别为AOZ标准溶液、AM0Z标准溶液、SC标 准溶液或AH标准溶液，所述代谢物标准溶液的浓度均为8. 1 n g/L、 2. 7ug/L、 0.9ug/L、 0. 3ng/L、 0.1 u g/L和0 u g/L。
9、 一种权利要求1所述酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在 于包括以下步骤(1) 样品前处理；(2) 使用试剂盒进行检测；(3) 结果处理与分析。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于步骤(2)包括以 下步骤(1) 将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡；(2) 将标准品或待测样品加入已经包被有硝基呋喃代谢物混合 抗原的酶标板孔内，然后每孔加入酶标抗体工作液，轻拍混匀，孵育.(3) 洗涤；(4) 每孔加入等量的底物缓冲液与底物液，轻拍混匀，避光孵育.(5) 每孔加入反应终止液，混合均匀，在波长450nm或492nm 下，以空气为空白，酶标仪测定各孔吸光值。
全文摘要
本发明公开了一种检测硝基呋喃类药物代谢物残留的酶联免疫试剂盒，包括包被多种硝基呋喃代谢物抗原的酶标板、酶标记抗体工作液、标准溶液、底物液、底物缓冲液、反应终止液、浓缩洗涤液和样品稀释浓缩液。本发明同时公开了所述试剂盒进行检测的使用方法，包括样品的前处理，使用试剂盒检测和结果处理与分析等步骤。本发明提供的试剂盒采用直接竞争酶联免疫吸附分析技术，既可同时检测多种硝基呋喃代谢物总残留，又可检测单一硝基呋喃代谢物残留，避免了同一样品需多次检测，降低了漏检率，灵敏度高、稳定性好、步骤少、成本低，非常适合大量样品的筛查，具有重要的现实意义。
文档编号G01N33/543GK101241132SQ20081002590
公开日2008年8月13日 申请日期2008年1月18日 优先权日2008年1月18日
发明者孙远明, 杨金易, 沈玉栋, 弘 王, 肖治理, 雷红涛 申请人:华南农业大学