专利名称：一种用于子宫内膜异位症疾病的检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术和医学检验领域，涉及一种用于子宫内膜异位症疾病的检 测试剂。
背景技术：
子宫内膜异位症(简称内异症)是一种严重影响育龄期妇女生活质量的常见 病。临床主要表现为痛经、慢性盆腔痛及不孕等。目前临床治疗内异症的首选方 法是手术治疗，但临床实践表明，手术后5年的复发率仍高达40—50%，大部 分患者需要第二次手术治疗。有研究表明，多次复发及手术治疗可造成生殖内分 泌功能的紊乱和卵巢功能早衰，内异症的复发已成为临床治疗中一个非常棘手的 问题。然而，目前人们对内异症复发的原因并不甚了解，而现行的rAFS分期系 统也并不能达到预测复发的目的，有关的流行病学调査所得出的复发高危因素的 结果也都颇有争议，因此临床上尚缺乏一种可用于检测内异症的方法。寻找一种 简便的、客观的、可检测内异症疾病的方法，帮助判断内异症预后及复发、指导 治疗方案的制定已成为本领域研究人员较为关注的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种用于子宫内膜异位症疾病的 检测试剂。
所述的检测试剂含有一种或一种以上的相关内异症疾病单克隆抗体，所述的 相关内异症疾病的单克隆抗体优选PR-B鼠抗人单克隆抗体(Lab Vision Corporation, Cat.No: #MS-192-P0)或/和NF-kB p65鼠抗人单克隆抗体 (BioVision， Cat. No: 3012-100)。
本发明的另一目的是提供含有上述检测试剂的检测试剂盒。 所述的检测试剂盒包含固相和上述PR-B鼠抗人単克隆抗体和/或NF-kB p65
鼠抗人单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供上述PR-B鼠抗人単克隆抗体和/或NF-kB p65鼠抗人单克隆抗体在制备用于子宫内膜异位症疾病的检测试剂中的用途。
本发明进行了离体实验，结果表明，本发明在检测内异症复发中具有良好的
敏感性和特异性，通过本发明可以较为方便的判别内异症易复发者，从而指导临
床治疗及随访，达到减少内异症复发的效果。 本发明通过下述技术方案实现
选取内异症复发组和未复发组病例，通过免疫组化SP方法检测内异症的相关 基因在上述复发组和未复发组中存在的差异表达情况，再经离体验证实验判定相 关基因在不同组别中的表达差异及其与病理特征之间的关系，统计分析确定敏感 性、特异性指标，制备本发明检测试剂或检测试剂盒。 本发明通过下述步骤制备
1) 选择内异症的相关基因
选择内异症的相关基因ERa 、 PR、 PR-B、 NF-KBp65、 COX-2,用免疫组化 SP方法在离体标本中验证所述的相关基因在内异症患者复发组和未复发组 中存在差异表达；
2) 离体验证实验
(1) 收集临床病史资料，判定内异症复发组和未复发组 收集经手术病理证实为内异症的患者的病史资料，根据预后情况，判定
其为复发或未复发者；
(2) 选取离体标本，进行免疫组化实验验证
选取内异症复发组和未复发组的离体病灶标本石蜡包埋，使两组病例相
关因素分布上均具有可比性；
用免疫组化SP法检测两组病例的上述相关基因的表达情况，经病理读片， 按染色强度和染色范围综合评分。
(3) 统计分析，确定试剂组成
用Fisher确切概率法、Wilcoxon秩和检验、和Logistic回归分析等方法分 析上述相关基因在不同组别中的表达差异及其与临床病理特征之间的关系， 结果显示相关基因NF-KB p65、 COX-2在复发组中的表达显著高于未复发 组，PR-B在复发组中的表达显著低于未复发组，而PR、 ERa在两组中的表 达无明显差异；根据统计结果显示的敏感性、特异性指标，确定有效检测组成成分，制备 本发明检测试剂或检测试剂盒。
本发明采用PR-B鼠抗人単克隆抗体和/或NF-kB p65鼠抗人单克隆抗体作 为有效检测组成成分制备检测试剂。
本发明进一步采用上述检测试剂制备检测子宫内膜异位症疾病的试剂盒。
本发明采用分类回归树方法(Classification and regression tree method)及留 出-交叉验证法(Leave-one-outcross-validation, LOOCV)分析后，结果表明，联合 PR-B和NF-kB p65在内异症离体组织标本中的表达评分较其它指标或组合能获 得显著好的预测疾病复发的效果，其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值 最佳，分别为86.8%， 82.1%， 0.82禾卩0.87。
本发明提供了一种客观的预测内异症复发的生物试剂及试剂盒，其实施简 便，能帮助早期诊断，并通过早期干预达到改善预后的目的，同时也为进一步揭 示内异症复发的分子机制提供了基础参考数据。
图1是NF-kBP65免疫组化染色片，其中，
(a) :用子宫内膜癌组织染色的阳性对照片(X400)，阳性为棕黄色染色，
(b) :正常子宫内膜组织用PBS代替一抗作阴性对照(X400)，
(c) :内异症异位内膜染色片(X400)，评分5分，
(d) :内异症异位内膜染色片(X400)，评分2分。 图2是PR-B免疫组化染色片，其中，
(a) :正常子宫内膜组织染色的阳性对照片(X400)，阳性为棕黄色染色，
(b) :正常子宫内膜组织用PBS代替一抗作阴性对照(X400)，
(c) :内异症异位内膜染色片(X400)，评分l分，
(d) :内异症异位内膜染色片(X400)，评分3分。
图3是LOOCV检测PR-B和NF-kB p65作为内异症复发标记物的ROC曲
线，
逐一验证PR-B、 NF-kB p65不同评分分别作为判断内异症复发取舍点时的 ROC值，虚线为随机分类的对照曲线。图4是根据PR-B和NF-kB p65评分预测疾病复发的分类回归树示意图。 具体实施方案 实施例l
1) 选择内异症的相关基因
选择内异症的相关基因ERa 、 PR、 PR-B、 NF-kBP65、 COX-2，用免疫组化 SP方法在离体标本中验证所述的相关基因在内异症患者复发组和未复发组中存 在差异表达；
2) 离体验证实验
收集临床病史资料，判定内异症复发组和未复发组
收集经手术病理证实为内异症的患者的病史资料，包括一般人口学特征、既 往史、症状史、手术情况、术后辅助治疗等，术后每3月定期随访，并连续随访 30个月以上，了解预后情况，判断其为复发或是未复发；
本发明所述的内异症复发的定义为符合下述第一或第二点则定义为复发
(1) 术后3个月起经阴道超声检测到单侧或双侧卵巢囊肿>=3 !1，且有内异 症囊液稠厚的特异性低回声，并连续存在2个月经周期以上，且相关疼痛症状复 发，需再次药物治疗者，
(2) 经再次手术病理证实新发病灶为卵巢内膜样囊肿者。 选取离体组织标本，进行免疫组化实验验证
选取内异症复发组53例和未复组织发组56例的离体病灶组织标本石蜡包埋， 两组病例在年龄、疾病r-AFS分期、月经周期等相关因素分布上均具有可比性。
用免疫组化SP方法检测离体组织标本中的ERa 、 PR、 PR-B、 NF-KBp65、 COX-2的表达情况
(1) 将离体组织石蜡标本以4um连续切片，取第一片切片做HE染色确 认病理诊断后行PR-B和NF-kB p65免疫组化染色，
(2) 脱蜡:二甲苯脱蜡2次，每次10分钟，然后放入100%、 95%、 90%、 80%、 70%等各级酒精溶液中各2分钟，再放入蒸馏水中3分钟，
(3) 抗原修复将切片置于耐高温容器中，注入抗原修复液(PH值9.0 的EDTA)，使切片位于液面以下。置烘箱内加热使容器内液体温度保 存在92'C-98"C之间并持续45分钟，取出容器，自然冷却至室温，(4) 标记一抗(PR-B和NF-KBp65单抗的稀释度分别为1: 50和1: 100)，
4'C温箱孵育过夜，
(5) TBS冲洗三遍，标记二抗，37。C温箱孵育30分钟，
(6) TBS冲洗三遍，DAB显色5分钟，
(7) 苏木素复染核2分钟，
(8) 常规脱水、透明封片。 免疫组化染色评分
独立病理读片，按染色强度和染色范围综合评分。评分标准为PR-B阳
性信号为内膜上皮或间质细胞核内出现棕黄色颗粒，NF-kB p65阳性信号为
内膜上皮或间质细胞细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒，用已知的阳性片作阳
性对照，PBS代替一抗作阴性对照(见图l、图2);
显微镜下随机选择IO个视野，观察所选择的高倍镜视野中的所有细胞，
记录阳性染色细胞百分数(°/。)并记分，弱阳性(+ ):上皮或间质阳性细胞数<
10% ，记l分；阳性(+ + ):上皮或间质阳性细胞数在10% 50%之间，
记2分；强阳性(+ + + ):上皮或间质阳性细胞数>50% ，记3分；细胞着色
强度以多数阳性细胞呈现的染色(棕黄色)记分着色和已知阳性片同样强为
强着色，记3分；着色浅、但与阴性对照片有明显区别者为浅着色，记l分；
染色强度在浅着色和强着色之间者为中等着色，记2分。将阳性百分数记分
和细胞染色记分按表1计算图相加得最后积分。
表1是阳性百分数和细胞染色记分计算图表。 表1
细胞着色百分数
+ ++ +++
细+123
胞
着++234
色
强+++345
度
73)统计分析，选取有效检测组成成分
用Fisher确切概率法、Wilcoxon秩和检验、和Logistic回归分析(R 2.5.1 软件www.r-Droiect.org)等方法分析上述五种基因在不同组别中的表达差异 及其与临床病理特征之间的关系。结果显示NF-kB p65、 COX-2在复发组 中的表达显著高于未复发组，PR-B在复发组中的表达显著低于未复发组，而 PR、 ERa在两组中的表达无明显差异；
用分类回归树方法(Classification and regression tree method)及留出-交叉 验证法(Leave-one-out cross-validation, LOOCV)分析，结果显示，用分类回归 树方法评定当NF-KBp65评分S2，或者PR-B评分=5，或PR-B评分> 2且NF-KBp65评分=3就评定为未复发，剩余情况则评定为复发；用留出-交叉验证法计算联合PR-B、 NF-kB p65用于预测疾病复发的敏感性、特异性、 阳性预测值和阴性预测值分别为86.8%， 82.1%， 0.82禾tl 0.87 (见图3)。
结果证实，本发明采用联合PR-B和NF-KB p65在内异症离体组织标本 中的表达评分较其它指标或组合更能得出最满意的预测疾病复发的效果。
权利要求
1、一种用于子宫内膜异位症疾病的检测试剂，其特征是所述的检测试剂含有一种或一种以上的相关内异症疾病单克隆抗体。
2、 权利要求l所述的用于子宫内膜异位症疾病的检测试剂，其特征是所述的检 测试剂含有PR-B鼠抗人单克隆抗体或/和NF-KBp65鼠抗人单克隆抗体。
3、 一种用于子宫内膜异位症疾病的检测试剂盒，其特征是含有权利要求2的检 测试剂。
4、 PR-B鼠抗人单克隆抗体或/和NF-KBp65鼠抗人单克隆抗体在制备诊断子宫 内膜异位症疾病的检测试剂中的用途。
5、 按权利要求4所述的用途，，其中所述的检测试剂用于检测子宫内膜异位症的 相关基因的差异表达。
6、 按权利要求5所述的用途，，其中所述的子宫内膜异位症的相关基因是ERa 、 PR、 PR陽B、 NF-KBp65和COX隱2。
全文摘要
本发明属生物技术和医学检验领域，涉及一种用于子宫内膜异位症疾病的检测试剂。本发明采用PR-B鼠抗人单克隆抗体或/和NF-κB p65鼠抗人单克隆抗体制成检测试剂和检测试剂盒，通过检测子宫内膜异位症的相关基因ERα、PR、PR-B、NF-κB p65和COX-2在内异症复发组和未复发组的差异表达，获得预测疾病复发与否的效果，其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为86.8％，82.1％，0.82和0.87。本发明实施简便，有助于子宫内膜异位症疾病早期诊断，并通过早期干预达到改善预后的目的，为进一步揭示内异症复发的分子机制提供了基础参考数据。
文档编号G01N33/577GK101498725SQ200810033500
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月3日 优先权日2008年2月3日
发明者刘惜时, 沈芳华, 蕾 袁, 郭孙伟 申请人:复旦大学附属妇产科医院