专利名称：：测定血清游离肉碱的试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及定量检测游离肉碱(FREECARNITINE,简称FCar)的方法，更具体讲，涉及定量检测人血浆或血清中FCar含量的试剂。
背景技术：
：肉碱是介导脂肪酸通过线粒体膜进入线粒体进行P—氧化产生供肌肉和其它细胞代谢所需能量的重要的辅因子。它是一种人体中天然存在的类维生素营养物质。其主要功能是转运脂肪进入线粒体，促进脂肪酸燃烧，为机体提供能量。通常情况下，肉碱缺乏会导致骨骼肌和心肌紊乱，因为这两种肌肉都是高能耗的组织。检测肉碱的含量可以对于和此组织相关的疾病进行诊断和治疗支持。此外肾病和透析病人的肉碱会出现代谢紊乱情况，对肉碱进行监测可以对临床措施的采取提供支持，此外，一些关于肉碱的临床意义还在发现中。目前已报道的测定方法有高效液相(HPLC)法和质谱(MS)法等，多数敏感度不够。有的需要使用放射性同位素，易造成放射性污染。有的方法复杂，需时较长，不能适应临床常规使用。
发明内容本发明的目的是提供一种测定血清游离肉碱的试剂，以克服现有技术存在的缺陷。技术原理样本中的肉碱在(3—硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+)氧化型存在下被肉碱脱氢酶(CDH)特异性的氧化成脱氢肉碱，同时卩一硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+)氧化型转化成在卩—硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)还原型。而脱氢肉碱在(3—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)存在下被肉碱脱氢酶(CDH)特异性的还原成肉碱，同时(3—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)也转化成(3—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD+)。如此肉碱和脱氢肉碱在Thio-NAD+和NADH的存在下通过CDH进行酶循环反应导致Thio-NADH的不断累积，达到平衡后，Thio-NADH的生成量和样本中的肉碱的浓度呈一定比例，从而可以通过测定Thio-NADH的生成速度进行标本的游离肉碱定量。并且，Thio-NAD+和NADH可参与上述循环反应直到枯竭状态，灵敏度非常高。本发明的试剂，包括如下含量的组分的缓冲溶液Thio-NAD十(硫代辅酶)0.001g/L~10g/LNADH(还原辅酶1)0.01g/L~10g/L肉碱脱氢酶(CDH)0.5KU/L500KU/L所说的缓冲溶液没有特别限制，可以是Tris、磷酸盐或GOOD'S等常规缓冲剂，溶液的pH值为49;优选的，所说的试剂还可以包含缓冲剂、防腐剂、螯合剂、稳定剂、表面活性剂或蛋白酶抑制剂等；所说的防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、氯霉素等抗生素或是常见的阳离子类表面活性剂，如十六垸基三甲基溴化氨或十四垸基三甲基溴化氨；；所说的稳定剂可以选择牛血清白蛋白(BSA)、甘油、氨基酸、金属离子、螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、表面活性剂或蛋白酶抑制剂等，浓度没有特别限制，只要不影响正常的反应测定即可，优选的浓度为0.15g/L;优选的，本发明的试剂可以是双试剂，即该试剂分为试剂(Rl)和试剂(R2)，也可以将所有组分配在一起形成单试剂，也可以配成2个以上的部分形成多试剂，但以双试剂方式为佳；所说的双试剂中，试剂(Rl)的组分为和含量为Thio-NAD+(硫代辅酶)0.001g/L10g/L;NADH(还原辅酶l)0.01g/L10g/L;溶液的pH值为4-7试剂(R2)的组分为和含量为肉碱脱氢酶(CDH)0.5KU/L-500KU/L溶液的pH值为8-9;试剂可以是液体试剂，或为冻干试剂，使用前用水或一定的缓冲液溶解后再使用。本发明的试剂可以采用常规的物理混合的方法方法进行制备，冻干试剂也可以采用常规的方法，将上述配比的液体制剂，进行冻干后，获得产口口口5本发明的试剂，可以用于定量检测人血浆或血清中FCar含量。本发明的试剂，配制简单、快捷、不需特殊仪器，在临床实验室常见的全自动或半自动生化分析仪上即可完成操作，整个过程只需10分钟，大大节省了人力和物力，同时使临床对大量标本进行测定成为可能。本发明的用于测定游离肉碱的酶循环反应试剂，具有较高的稳定性，可以广泛应用在临床体外诊断上，并降低试剂的浪费。图1为本法和HPLC法的对比图2为利用本方法测定的试剂线性。具体实施例方式实施例l按照下列配方配制试剂:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>配制完成后进行检测，达到了设定的准确度、精密度和线性的要求，考虑到试剂储存的稳定性和其中肉碱脱氢酶、NADH在溶液状态下不稳定，把该产品做成双试剂产品，Rl和R2试剂的体积比例为2:1，具体成份分配和配制方法如下试剂Rl:Tris缓冲液12g/LThio-NAD十lg/LBSAlg/LNaN30.5g/L试剂R2:Tris缓冲液12g/LBSAlg/LNaN30.2g/LR2-B干粉CDH300KU/1NADH6g/L对Rl和R2试剂的成份进行分配以后，先按照液体双试剂的方式进行了游离肉碱试剂配制，即把R2—B中CDH和NADH按照设定浓度加入R2一A溶解液中，即获得产品。或采用如下的方法进行冻干，制备冻干制剂先将溶液从25t:冷却到一40。C，这个冷却维持四个小时，保证瓶内的溶液温度均匀，然后在一定的真空度下(20pa的压强下)进行缓慢升温到25°C，这个过程需要3—4个小时，然后在25'C下和20pa的压强的真空度下进行干燥，这个过程完全由真空冻干机来控制，约需要37个小时。等冻干品的温度和冻干机干燥室的温度一致时，表示冻干品已经达到充分干燥状态，干燥过程结束，最后在玻璃瓶内冲入氮气，盖上塞子，完成整个2-B的冻干。获得冻干制剂。实施例2应用实施例设备日立7170型自动生化分析仪根据游离肉碱检测试剂的反应原理，考虑到试剂灵敏度和吸样比例之间的影响关系和目前全自动生化分析仪反应池容量的要求和限制，采用样本:试剂l:试齐U2二12PL:200UL:100nL的比例来试验。首先采用紫外可见分光光度计在405nm波长下和37"C孵育下，对一定浓度的游离肉碱和配制的游离肉碱单试剂按照反应比例混合后进行吸光度变化扫描，发现游离肉碱和游离肉碱检测试剂混合后有非常明显的吸光度上升趋势，其斜率固定，见下图1。考虑到双试剂混合后的酸度和温度的缓冲时间，因此在日立自动生化分析仪上选取了第六分钟到第十分钟的吸光度变化来检测游离肉碱的含量。下面是确定的反应体系参数。样本采集及用量人血清，用量血清12pL。试剂用量Rl200jiL，R2100pL。反应条件血清12pL，和R1试剂混匀后,37'C孵育5分钟后，加入试剂R2混匀后孵育一分钟，然后采用405nm波长开始测定，连续测定4分钟，每隔一分钟测定一次。求吸光度变化值(AA/min)。校准方法用市售肉碱配制浓度为5(^rnol/L的溶液作为标准品。上述试剂测定新鲜的病人血清中的FCar的含量，在日立7170全自动生化分析仪进行检测，HPLC法作为对照，结果如图h图l中，曲线l代表理论曲线，曲线2代表测定结果的回归曲线，纵坐标为本发明的测定结果，横坐标为HPLC测定结果，计量单位为"mol/L;统计y=0.961x+1.33测定例数=20相关系数F0.990由此可见，采用本发明的酶循环法测定游离肉碱和HPLC具有良好的相关性。用市售肉碱配制最高值为200)imol/L的线性标准品，用上述试剂测定结果如下线性标准液pmol/L测定结果pmol/L0.00.140.042.180.081.2120.0121.6160.0159.1200.0192.3图2中，纵坐标为本发明的线性标准液的浓度，横坐标为采用本法测得的浓度，计量单位为Umol/L;其中r2=0.9997由此可见，采用本发明的试剂，酶循环法测定游离肉碱可以达到测定上限为200jamol/L。实施例3按照下列配方配制试剂组分浓度JWMES缓冲液21g/LThio-NAD+lg/LBSAlg/L<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>统计y=0.986x+0.08测定例数=20相关系数F0.990。1权利要求1.测定血清游离肉碱的试剂，其特征在于，该试剂为包括如下含量的组分的缓冲溶液Thio-NAD+(硫代辅酶)0.001g/L～10g/LNADH(还原辅酶1)0.01g/L～10g/L肉碱脱氢酶(CDH)0.5KU/L～500KU/L。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所说的缓冲溶液是Tris、磷酸盐或GOOD'S,溶液的pH值为4-9。3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所说的试剂还包含防腐剂、螯合剂、稳定剂、表面活性剂或蛋白酶抑制剂。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所说的防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、氯霉素等抗生素或是常见的阳离子类表面活性剂。5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所说的稳定剂选自白蛋白、甘油、氨基酸、金属离子、螯合剂、表面活性剂或蛋白酶抑制剂。6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，金属离子为Mg2+，螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、表面活性剂为Tritonx-100或吐温类，蛋白酶抑制剂为蛋白酶抑制剂PMSF(对甲基磺酰氟)、抑肽酶、植酸、硼酸盐。7.根据权利要求l所述的试剂，其特征在于，所说的试剂是由试剂(R1)和试剂(R2)组成的双试剂。8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所说的双试剂中，试剂(Rl)的组分为和含量为Thio-NAD+(硫代辅酶)0.001g/L~10g/L;NADH(还原辅酶l)0.01g/L~10g/L;溶液的pH值为4-7;试剂(R2)的组分为和含量为-肉碱脱氢酶(CDH)0.5KU/L~500KU/L溶液的pH值为8-9。9.根据权利要求l所述的试剂，其特征在于，试剂为冻干试剂。全文摘要本发明提供了一种测定血清游离肉碱的试剂，该试剂为包括如下含量的组分的缓冲溶液硫代辅酶0.001g/L～10g/L，还原辅酶10.01g/L～10g/L，肉碱脱氢酶0.5KU/L～500KU/L。本发明的用于测定游离肉碱的酶循环反应试剂，具有较高的稳定性，可以广泛应用在临床体外诊断上，并降低试剂的浪费。文档编号G01N33/50GK101514984SQ200810033819公开日2009年8月26日申请日期2008年2月22日优先权日2008年2月22日发明者崔鹏飞,张映新申请人:上海蓝怡科技有限公司