毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法

专利名称：：毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及中药领域，尤其涉及毛冬青提取物的质量控制方法。
背景技术：
：毛冬青(IlexpubescensHook,etArn)是冬青科冬青属下的一种植物，为常绿灌木，高约3米。生于山坡、山谷林中或灌丛中。分布于广东、广西、安徽、福建、浙江、江西、台湾等地。毛冬青的根是我国江南一些省区民间常用药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效。毛冬青药材标准是以其根基作为入药部位，并收载于《中华人民共和国药典》77年版(P:107)，毛冬青胶囊和注射液分别收载于卫生部药品标准一中药成方制剂.第七分册(P:23)和第二十分册(P:57)，毛冬青片收载于药监局的国家药品标准_中药成方制剂心系分册(P:497)。经近代药理学研究证明，毛冬青提取物及其制剂在循环和血液系统中具有多方面作用。它能显著提高小鼠常压耐缺氧能力，增加大鼠离体冠脉流量，减慢心率，增大心博幅度；显著对抗急性心肌缺血，对抗心电图ST段上移和T波升高(孟广生等，毛冬青地上部分对大鼠冠脉流量的影响及抗心肌缺血作用.中药药理与临床.1996，(3):34-35)。毛冬青注射液能使麻醉猫和犬静脉血压明显下降，降压作用缓慢但持久(董昆山等主编.现代临床中药学.中国中医药出版社.1998,p:504-506)。毛冬青能使兔耳皮下血管及肢体肌肉血管血流量增加，能消除去甲肾上腺素或加压素诱导的血管收縮(中山医学院第一附属医院外科.毛冬青对兔离体器官血管作用的实验及其在断肢再植中的临床应用.中华医学杂志.1974，54(2):97-100)。口服毛冬青皂苷Ilexs邻oninB3能显著降低实验性小鼠高胆固醇血脂(Kazuyukihidakaetal.NewtriterpenesaponinsfromT7e义/w力esce/51，Chem.Pharm.Bull.1987，35(2):524-529)。毛冬青具有抗血栓作用，连续口服10天毛冬青提取物(70%甲醇)能显著地延长实验性大鼠出血试验的时间，但对血浆的凝聚时间影响不大；它还能显著地抑制血小板中丙二醛(malondialhyde)的形成(YongN.Hanetal.Antithromboticactivityofthetriterpenoidsofi7ez尸"ie5re/sandtheconversionmethodofthetriterpenoidsofT7ex尸〃力es"ce/751havingnoantithromboticactivityintothetriterpenoidshavingantithromboticactivity.UnitedStatesPatent4,987,125)。毛冬青注射液对凝血酶诱导的肌动蛋白聚合、肌球蛋白与肌动蛋白微丝的结合有强烈的抑制作用(黄才等.毛冬青和复方丹参注射液对猪血小板细胞骨架蛋白的影响.湛江医学院学报.1993，11(1-2):9-11)。毛冬青注射液对甘油诱导的大鼠急性肾功能衰竭(ARF)有预防作用(陈少刚等.毛冬青预防大鼠甘油致急性肾功能衰竭的初步实验研究.实用医学杂志.1990，6(4):5-8)。毛冬青注射液对动物S-180肿瘤放射有增敏，且E/0比值达1.4(吴少雄等.毛冬青(IP)作为放射增敏剂的初步动物实验研究.癌症.1990，9(6):512-513)。另外毛冬青提取物能显著地縮短去势大鼠阴茎勃起起伏期，在交配能力上，能縮短大鼠扑捉和射精潜伏期，增加扑捉和射精次数,提示具有抗ED作用(周国伟等.治疗勃起功能障碍症的毛冬青提取物制剂及其制备方法.中国发明专利.公开号CN1355028A.授权号ZLOO127593.3)。目前毛冬青制剂主要应用于冠心病、高胆固醇血症、高血压、血栓闭塞性脉管炎、缺血性脑中风、中心性视网膜炎、慢性盆腔炎、输卵管炎性阻塞、萎縮性鼻炎以及外科感染性外伤等治疗，效果良好(董昆山等主编.现代临床中药学.中国中医药出版社.1998，p:504-506)。有关毛冬青提取物或上述提到的胶囊、注射液和片剂有效成分，文献普遍认为是黄酮化合物(中国药科大学主编.中药辞海第一巻.中国医药科学出版社.1998，p:1100;江苏新医学院编中药大辞典(下册)上海科学技术出版社.1998，p:441)，在毛冬青胶囊或注射液质量标准的含量测定项目中还使用芦丁为对照的分光光度法测定制剂中总黄酮量，在片剂标准中含量测定指标换成了原儿茶醛，但此标准批件中仍有增设总黄酮含测建议，其实毛冬青提取物或制剂的有效成分并不是黄酮，而是三萜皂甙和木脂素甙。至于出现毛冬青含有黄酮成分报道，那可能是早期的化学成分预试验的结果，据调査，到目前为止国内外尚无一篇有关从毛冬青根部中分离获得黄酮类单体的报道。在国内，有不少毛冬青制剂专利获得公开，曲韵智(CN1686362)、孙民富(CN1759847)先后公开了滴丸处方和制备方法，范友灵等(CN1686251)公开了软胶囊处方和制备方法，刘露(CN1733013)公开了注射液处方和制备方法；张平(CN1628832)和王伟(CN1813829)先后公开了冻干粉针制备方法，前者的毛冬青提取物经聚酰氨柱纯化处理，后者经大孔树脂处理，但样品标示的有效成分都称黄酮。袁海龙等(CN1772020)公开的用大孔树脂纯化毛冬青制备冻干粉针的方法，粉针所用的提取物皂甙含量大于8(F。，但其皂甙含量以何物计不明确。袁氏发明中，冻干粉针剂与市售毛冬青注射液质量比较的关键项目含量测定是以"新毛冬青素"计折算，然而"新毛冬青素"究竟是指何物并不清楚。综上所述可以了解，国内目前公开的毛冬青提取物或制剂都未能涉及到具体皂甙或皂甙成分组合的概念，即使是袁氏专利(CN1772020)提到皂甙，但因其皂甙含量测定的参比物质不明或公开不充分，使得所声称的皂甙含量可靠性就较难得到保障。现有的毛冬青提取物及制剂，其生产工艺均系以生药投料量为基准提取药材并直接制成制剂，过程中不考虑浸膏收率或对中间体设立质量监控指标，药品的质控体系完全取决于成品检验，更为不足的是现有毛冬青胶囊或注射液质量标准均是以芦丁作对照测定总黄酮含量，而毛冬青片则以原儿茶醛为对照测定微量原儿茶醛成分，显然这些这些指标成分都与毛冬青所含的有效主要成分相背离。这种质量体系不能正确反映药品内在质量的状况，客观上影响了毛冬青在临床上的有效使用，更限制了它在国际市场上的应用和推广，因此完善和提高毛冬青及其制剂的质量体系和具体控制方法是目前迫切需要着手解决和应对的现实问题。
发明内容本发明是在比较深入研究毛冬青有效成分的基础上，根据其主要有效成分特点，提出了一种比较客观反映实际状况的毛冬青提取物或制剂的质控方法。本发明公开了一种毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，包括以IlexsaponinBl为对照，测定毛冬青总皂甙含量。上述毛冬青总皂甙含量测定采用香草醛-硫酸法，包括下列步骤a、对提取物样品，使用甲醇溶解；对药材样品，则须用甲醇索氏提取2—6小时；b、在被测样品溶液中，加入8%香草醛无水乙醇溶液0.5ml、72%硫酸5.Oml，摇匀后置50—7(TC水浴中加温8—12分钟，然后立即置冰浴冷却8—12分钟，取出后放置4一6分钟；c、制作空白对照(即不加提取物样品重复a、b步骤)，在533—539nm下测定吸收值，然后根据标准曲线，计算总皂甙含量。较佳的，上述质量控制方法还包括采用高效液相色谱法测定IlexsaponinAl、IlexsaponiriBl或IlexsaponinB3中的一种或多种的含量。上述高效液相色谱法的皂甙含量测定中，药材样品须用甲醇索氏提取2—6小时，提取物样品可用30-80%甲醇溶解，过滤后进样，其成分的检测可以使用紫外分光或蒸发光散射或示差折光仪中的一种，色谱柱采用d3反相柱，柱温40。C，流动相采用0.2%甲酸溶液(v%):乙睛甲醇体积比为47:(10-15):(45-40);流速1.0ml/min。采用紫外分光检测时，检测波长为205nm;采用蒸发光散射检测时，Tn=120°C，Te=130°C，空气流速1.2SLM;采用示差折光仪检测时，温度设置在45'C。同样较佳的，上述质量控制方法还包括薄层层析鉴别IlexsaponinAl、IlexsaponinBl或IlexsaponinB3中的一种或多种。薄层层析鉴别取毛冬青提取物或制剂适量，用甲醇制成每lml含5mg提取物溶液，作为供试品溶液。另取IlexsaponinAl、IlexsaponinBl和Ilexs邻oninB3对照品，加甲醇制成每lral含lmg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述四种溶液各1-2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲垸-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)IO'C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(v%)，在105。C加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。本发明的关键在于质控指标的选取，本发明确定的质控成分指标能适用于毛冬青、毛冬青提取物以及它们的制剂，其中毛冬青有效成分提取物，不仅包括所有采用常规手段获得的提取物，还包括改进现有工艺获得的提取物。上述毛冬青制剂包括毛冬青液体制剂及固体制剂，液体制剂不仅包括毛冬青糖浆、毛冬青注射液等液体形式的成品制剂，还包括毛冬青提取物、毛冬青流浸膏等半成品制剂；固体制剂包括颗粒剂、片剂(包括速释和缓释片)、胶囊剂(包括缓释胶囊)、软胶囊、干糖浆剂和冻干粉针等固体形式的成品制剂，还包括毛冬青干浸膏粉等半成品制剂。本发明是在研究毛冬青多种有效成分的基础上，率先提出采用Ilexs邻oninBl为对照的毛冬青总皂甙含量测定的质控方法。至于为何选择IlexsaponinBl作对照品，首先是因为IlexsaponinBl是毛冬青或毛冬青提取物或它们的各种制剂中主要有效成分之一；其次是Ilexs邻oninBl在作对照测定时，其溶液的可见吸收光谱与被测的各类毛冬青样品比较一致；能符合对多成分的中药或植物药中质量研究的技术要求；再者是IlexsaponinBl为二糖皂甙，其同母核结构(甙元)的其它主要皂甙是IlexsaponinB3，其基本化学性质与IlexsaponinBl接近，也符合作对照品的基本技术要求，但因其是三糖皂甙，极性更强，分离制备的难度提高，为了提高发明的实用性，因此采用IlexsaponinBl来测定毛冬青总皂武含量。经大量对各种提取方法获得的毛冬青提取物及各种类型毛冬青提取物制剂实测试验证实，以Ilexs邻oninBl为对照的测定毛冬青总皂甙含量的质控方法切实可行，同时又较为科学合理它不仅体现了近年来国内外对毛冬青有效成分的基础研究的最新成果，也可克服或修正国内受认识局限而建立的毛冬青总黄酮含量测定的质控方法，具有鲜明的技术进步优势。图1.Ilexs邻oninAl化学结构式图2.IlexsaponinBl和IlexsaponinB3化学结构式R1R2ilexsaponinB1:Glc-Xyl-HilexsaponinB3:Glc-Xyl-Glc图3.丁香树脂醇-4-O-{3-D-葡萄糖甙化学结构式具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如《中国药典》2005版中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例1毛冬青提取物中皂甙单体的分离毛冬青中单体成分分离取适量毛冬青提取物，用2-5倍量水溶解分散，与等体积的正丁醇萃取三次，合并正丁醇相，浓縮，得黄色的粗总皂甙。后经大孔树脂层析、硅胶柱层、RP-18反相柱层和凝胶柱层反复分离、精制(具体方法由下列文献记载KazuyukiHidakaetalNewTriterpensSaponinsfromJ/ex;w^scem:Chem.Pharm.Bull.35(2):524-529,1987)，分别获得单体i、n、m和w。单体I:FAB-MS(m/z):1351.72(2M+Na),1005.52(2M-Glu+Na),687.25(M+Na),663.49(M-l);HRMS(m7z):687.3723(M+Na),理论值687.3720,分子式为C^HssO^NMR(Py-d6)S:1.05(3H，d,30Me),1.17(3H,s,25Me),1.22(3H,s,26Me)，1.40(3H,s,29Me),1.71(3H，s，27Me),1.73(3H,s,23Me),2.91(lH,s,H-18),3.07(lH,m,H曙19),3.35(lH.brd，H-3),4.03(lH，brs,G-3),4.19(1H，t,G-2),4.27(2H,d,G-4,5),4.34(1H，dd,G-6)，4.43(1H,d,G-6)，5.14(1H，brs,19-OH),5.56(lH,s，H-12),6.24(lH,d,G-l)。13CNMR(Py-d6)S:39.812(C-l,39.7(文献值)),29.149(C-2，29.0),78.425(C-3，78.3),49.295(C-4,49.1),57.058(C-5，56.9),21.110(C-6，21.0),33.928(C-7,33.8)，40.470(C-8,40.3),47.245(C-9，47.1),37.921(C-10,37.8),24.307(C-11,24.4),128,582(C-12,128.4),139.297(C-13,139.2),42.254(C-14,42.1),29.287(C-15,29.1),26.197(C-16,26.0)，48.711(C-17,48.6),54.573(C-18,54.4),72.690(C-19，72.6)，42,169(C-20,42.1),26.728(C-21,26.6),37.688(C-22,37.8),24.455(C-23,24.4),181.054(C-24,181.0),14.006(C-25,13.9),17.383(C-26,17.3)，24.795(C-27,24.7),177.050(C-28,177.1),27,079(C-29,27.0),16.724(C-30,16,7);95.862(G-1,95.7)，74.007(G-2,73.8),78.903(G-3，78.7),71.246(G-4，71.1)，79.243(G-5,79.1),62.347(G-6,62.2)。经上述综合的光谱分析和文献(Kazuyukihidakaetal.Atriterpeneandsaponinfromrootsofi7ex/w76&sce/7&Phytochemistry1987,26(7):2023-2027)数据对比，确认单体I为毛冬青皂苷甲(IlexsaponinAlorIlexsaponinA),化学结构见图l。单体II:FAB-MS(m/z):789.38(M+Na),1555.75(2M+Na);HRMS(m/z):789.4413(M十Na)，理论值789.4401,分子式为C41H66013。NMR(Py-d6)S:0.768(3H,s，24Me),0.955(3H，s,26Me),0.969(3H,s,25Me),1.001(3H，d，30Me),U32(3H，s，23Me)，U04(3H,s，29Me)，1.610(3H,s,27Me),3.103(1H,d,3-H),3.156(lH，d,18-H),3.554(lH,t,X陽l-H),3.785(lH,brd,G-5-H),5.214(lH,d,X-l-H)，5.420(lH，s，12-H)。13CNMR(Py-d6)S:38.792(C-1,38.8(文献值))，27.057(C-2,27.0)，88.800(C-3，88.9),39.567(C-4，39.5)，55.922(C-5,55.9),18.604(C-6，18.6),33.546(C-7，33.5),40.236(C-8,40.2)，47.723(C-9，47.7),36.997(C-10，36.9)，24.880(C-11,24.8)，127.254(C-12,127.2)，139.456(C-13,139.5)，41.116(C-14,42.0)，29.224(C-15,29.2),26.707(C-16，26.6),47.904(C-17,47.8),47.394(C-18，47.3)，73.434(C-19,73.4),42.997(C-20,42.8),23.956(C-21,23.9),32.410(C-22,32.3),28.109(C-23，28.0)，15.524(C-24,15.5),16.108(C-25，16.1),17.255(C-26,17.2),24.360(C曙27，24國3)，180.610(C-28,180.7),29.808(C-29，29.8),16.724(C-30,16.6);3-O-Sugar:105.664(X-l,105.7),83,225(X-2,82.8),77.936(X-3,77.8),71.628(X-4,71.5)，66.637(X-5,66.5)，106.004(G-1,105.8)，77.012(G-2,76.8),78.202(G-3,78.1),70.938(G-4,70.8),77.936(G-5,77.8)，62.644(G-6,62.6)。经上述综合的光谱分析和文献(Kazuyukihidakaetal.Newtriterpenesaponinsfrom//expw6esce"s,Chem.Pharm.Bull.1987,35(2):524-529)数据对比，确认单体II为IlexsaponinBl，化学结构见图2。单体III:13CNMR(Py-d6)S:38.834(C-1,38.8(文献值))，26.754(C-2,26.8),88.798(C-3,88.8),曙39.584(C-4,39.6),55.918(C-5,55.9),18.678(C-6,18.7),33.480(C-7,33.5)，40.426(C-8,40.3),47.167(C-9，47.7),36.991(C-10,36.9)，24.646(C-11,24.6),127.637(C-12，127.5)，138.807(C-13,138.8),42.094(C-14,42.1),29.1%(C45,29.1)，26.754(C-16,26.7),48.320(C-17,48.3),47.167(C-18,47.1),73.382(C-19,73.4),42.792(C-20,42.6),24.幅(C-21,23.8)，31.842(C-22，31.7),28.119(C-23,28.1)，15.660(C-24,15.6),16.017(C-25,16.0),17.457(C-26,17.4),24.297(C-27，24.3),177.002(C-28,177.1),29.196(C-29,29.7),16.707(C-30,16.7);3-O-Sugar:106.056(X-l,105.8)，83.255(X-2,83.0)，77.977(X-3,77.5),71.600(X誦4,7〗.5)'66.671(X-5，66.7),105.708(G-l,105.8),77.082(G-2,76.9),78.940(G-3,78.3),70,955(G-4,70.9),78.273(G-5，77.9),62.614(G-6,62.6);28-O-Sugar:95.789(G-1,95.7),74.064(G-2,73.8),79.75l(G-3,78.7),70.955(G-4,71.1)，79.205(G-5,79.1),62.159(G-6,62.2)。经与文献数据对比，确认单体ffl为UexsaponinB3，化学结构见图2。单体IV:'HNMR(Py-d6)5:3.22(2H,m,8，8，-H),3.80(6H,s,OCH3x2),3.83(3H,s,OCH3'x2),3.92(lH,m，G-3-H),4.07(2H，m,9,9，-H),4.25-4.40(7H，m,G-2，4，6,5.9，9，-H),5.78(lH，dd,G-l),6.94(2H,s,2,6-H),6.97(2H,s,2，,6，-H)。13CNMR(Py-d6)S:138.42(C-l,133.6(文献值))，104.91(C-2,104.0),154.00(C-3,152.5),135.63(C-4,137.1),154.00(C-5，152.5),104.9l(C-6,104.0),86.54(C-7,85.2),54.96(C-8,53.6),72.27(C-9,71.2),132.14(C-1，,131.2),104.95(C-2，，103.5),149.34(C-3，,147.8),137.42(C-4',134.7),149.34(C-5，,147.8)，104.95(C-6',103.5),86.5l(C-7，,85.0),54.83(C-8',53.5)，72.14(C-9，,7U),56.76(OMe，x2,56.3),56.55(OMex2,55.9)，105.09(G-1，102.7),76.09(G-2,74.0)，78.69(G-3,76.4),71.69(G-4,69.8),78.41(G-5,77.1),62.69(G-6,60.8)。经^和13CNMR光谱测定分析禾口文献(JuneiKinjoetal.Thefirstisolationoflignantri-andtetra-glycosides,Chem.Pharra.Bull.1991,39(6):1623-1625)比较，确定单体IV为丁香树脂醇-4—0-e-D-葡萄糖甙，化学结构见图3。从毛冬青提取物中分离得到皂武单体IlexsaponinAl、IlexsaponinBl禾PIlexsaponinB3(结构见图1和2.)夕卜，还分离获得了一个双环氧木脂素甙类成分丁香树脂醇-4-O-e-D-葡萄糖甙(结构见图3.)，该成分因其有酚羟基结构，可表现出与某些黄酮类化合物相类似的试管反应特征(化学鉴别)，这也许是毛冬青被认为含有黄酮类物质的原因之一。实施例2毛冬青提取物的制备-水提取毛冬青饮片100kg，加水600kg，加热回流提取3小时，第二次加水500kg,提取2小时，合并提取液，减压浓縮至相对密度为1.06—1.07(70°C±10)，过一装有50kg大孔树脂水相层析柱，用150kg的水洗涤，然后用100kg量的20%、40%、60%和80%乙醇溶液梯度洗脱，收集40—60%乙醇流份，减压浓縮，真空千燥，得到浸膏粉约5kg。实施例3毛冬青提取物的制备-醇提取毛冬青饮片100kg，加5(F。乙醇500kg，加热回流提取3小时，第二次提取2小时，合并提取液，减压浓縮至相对密度为1.06—1.07(7(TC士10)，过一装有50kg大孔树脂水相层析柱，用100kg量的水洗涤，然后用200kg量的40%、60%和80%乙醇溶液梯度洗脱，收集40一60%乙醇流份，减压浓縮，真空干燥，得到浸膏粉约4.5kg。实施例4毛冬青颗粒剂的制备取实施例2制备的提取物2kg，过80目筛网，加等量糊精，充分混和，置干法制粒机挤压成条,然后破碎制粒，整粒,得到质地脆硬的淡棕色颗粒，分装成袋，每袋净重0.5g，相当生药5g。实施例5毛冬青片的制备取实施例2制备的提取物2kg，过80目筛网，加入预胶化淀粉、微晶纤维素、羟丙基纤维素各500、1200、和300g，充分混和，湿法制粒，干燥后加入适量的硬脂酸镁和胶态二氧化碳，充分混和，压制成片，每片重0.5克/片，相当生药4.5g。实施例6毛冬青胶囊的制备取实施例2制备的提取物2kg，过80目筛网，加入1.5kg淀粉,充分混和，湿法制粒，千燥后加入适量的硬脂酸镁和胶态二氧化碳，充分混和，装填胶囊，每粒内重0.5g，相当生药4.5g。实施例7毛冬青粉针剂的制备取实施例2制得的浸膏粉，加5倍量水溶解，然后用一半体积的正丁醇萃取三次，合并萃取液浓缩并干燥。取该纯化浸膏粉500g(总皂甙含量80%)，加葡萄糖500g，用8000ml灭菌水溶解，灭菌过滤，分装至小瓶内，每瓶4ml，然后冷冻干燥，密封即得。每瓶粉针的总固物0.5g，其中提取物量为250mg。实施例8提取物及其制剂的TLC鉴别试验取实施例2—3制得的毛冬青提取物及实施例4一6的制剂适量，用甲醇制成相当于每lml含5mg提取物的溶液，作为供试品溶液。另取IiexsaponinAKIlexsa.poninBl和IlexsaponinB3对照品，加甲醇制成每lml含lmg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述四种溶液各1-2ul,分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲垸-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)l(TC以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105'C加热至斑点显色清晰，置日光下检视。所有供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实施例9提取物及其制剂的总皂甙含量测定取实施例2—7获得的毛冬青提取物或制剂适量，使用甲醇溶解，在被测样品溶液中，加入8%香草醛无水乙醇溶液0.5ml、72%硫酸5.Oml，摇匀后置60。C水浴中加温10分钟，然后立即置冰浴冷却10分钟，取出后放置5分钟；以对应的试剂作空白，在536nm下测定吸收值，然后根据标准曲线，计算总皂甙含量。标准曲线的获得方法精密称取对照品IlexsaponinBl，用甲醇配制成每lml含0.3mg的对照品溶液，分别精密吸取该溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml至具塞试管中，蒸干，加8%香草醛无水乙醇溶液0.5ffll、72°/。硫酸5.0ml，摇匀后置6(TC水浴加热10分钟，冰浴冷却IO分钟，取出后5分钟，以试剂为空白，在536nm下测定吸收值，对照品在15-120ug浓度范围内与吸收值呈良好的线性关系。表l.总皂甙含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例10提取物及其制剂的单一皂甙含量测定取实施例2—7获得的毛冬青提取物或制剂适量，使用50%甲醇溶解并定容，过滤，进样IO!U，高效液相色谱柱采用Cu反相柱，柱温4(TC，流动相采用0.2%甲酸溶液乙睛甲醇(47:10-15:45-40);流速1.0ml/min。采用蒸散发光检测，Tn=120°C，Te-13(TC，空气流速1.2SLM。表2.单一皂甙含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1.一种毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，包括以IlexsaponinB1为对照，测定毛冬青总皂甙含量。2.如权利要求1所述毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，其特征在于，所述毛冬青总皂甙含量测定采用香草醛-硫酸法测定。3.如权利要求1所述毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，其特征在于，所述香草醛-硫酸法包括下列步骤a、对毛冬青提取物或毛冬青制剂样品，使用甲醇溶解；对毛冬青药材样品，则用甲醇索氏提取2—6小时；b、加入香草醛和浓硫酸，在50—7(TC水浴中加温8—12分钟，然后立即置冰浴冷却8一12分钟，取出后放置4一6分钟；c、制作空白对照，在533—539nm下测定吸收值，然后根据标准曲线，计算总皂甙含量。4.如权利要求1一3中任一权利要求所述毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法还包括采用高效液相色谱法测定IlexsaponinAl、IlexsaponinBl或IlexsaponinB3中的一种或多种的含量。5.如权利要求4所述毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱法测定IlexsaponinAl、IlexsaponinBl或IlexsaponinB3中的一种或多种的含量时，其成分检测仪器可以使用紫外分光或蒸发光散射或示差折光仪中的一种，色谱柱采用Cu反相柱，柱温40°C，流动相釆用0.2%甲酸溶液乙睛甲醇体积比为47:(10-15):(45-40);流速1.0ml/min。6.如权利要求5所述毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，其特征在于，所述成分检测仪器采用紫外分光时，检测波长为205nm;采用蒸发光散射检测时，T『12(TC,Te二130'C,空气流速1.2SLM;采用示差折光仪检测时，温度设置在45'C。7.如权利要求1一3中任一权利要求所述毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法还包括薄层层析鉴别IlexsaponinAl、IlexsaponinBl或IlexsaponinB3中的一种或多种。8.如权利要求7所述毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，其特征在于，所述薄层层析鉴别包括下列步骤a、取待测样品适量，用甲醇制成每lml含5mg溶液，作为供试品溶液；b、另取Ilexs邻oninAl、IlexsaponinBl或IlexsaponinB3对照品，加甲醇制成每lml含lmg溶液，作为对照品溶液；C、照薄层色谱法试验吸取上述供试品溶液或对照品溶液各1-2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上；d、三氯甲垸乙酸乙酯甲醇水以体积比为15:40:22:10混合，l(TC以下放置的下层溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105t!加热至斑点显色清晰，置日光下检视；e、判断供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的斑点。全文摘要本发明涉及中药领域，公开了一种毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质量控制方法，包括以IlexsaponinB1为对照，测定毛冬青总皂甙含量。本发明在比较深入研究毛冬青有效成分的基础上，根据其主要有效成分特点，提出了一种比较客观反映实际状况的毛冬青药材、提取物或毛冬青制剂的质控方法，为确保毛冬青各类制剂在临床上安全和有效使用打下更坚实基础。文档编号G01N21/35GK101284030SQ20081003846公开日2008年10月15日申请日期2008年6月3日优先权日2008年6月3日发明者华菊根,张国明,张英华,徐晓英,馨胡,袁华梁申请人:上海雷允上科技发展有限公司;上海市中药研究所