专利名称：一种结合荧光定量pcr的基因分型检测方法
技术领域：
本发明属于基因检测方法，具体地说涉及一种结合荧光定量PCR进行基因分型检测的方法。
二.
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。实时荧光定量PCR 就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量 分析。其原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的 进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧 光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增 曲线图。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶 段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断 产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模 板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有 在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可 以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引 入了两个非常重要的概念荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置 是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数被称为CT值(threshold value )。
实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特 异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指 示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
非探针类常用的染料是SYBR Green I。 SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA 结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理 想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm ，发射波长最大约为520咖。在PCR反 应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地惨入DNA双链后，发射荧光 信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
我们利用SYBR Green I染料法可以在反应末尾对扩增产物进行熔解曲线分析。在熔解 曲线分析过程中，随着温度从低于产物熔解点缓慢升到高于产物熔解点，定量PCR仪连续监 测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。熔解曲线分析可用于产物的分析 鉴定，同时避免了耗时的电泳。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指基因组水平上由单个碱 基变异引起的DNA多态性，在人群中的发生频率大于1%，它是人类可遗传的变异中最常见 的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500 1000个 碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP 一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因(biallelic)。由于SNP 的二态性，非此即彼，在基因组筛选中3,往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这 就利于发展自动化技术筛选或检测SNP。
目前已建立的SNP分型方法很多。包括传统的PCR—RFLP、 PCR—单链构象多态性(single —strand eonformation polymorphism, SSCP)、等位基因特异性PCR(allele specific PCR， AS—PCR)和直接测序.以及近几年发展起来的变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPIX)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix— assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MAU)I—T0F MS)、动态等位基因特异性杂交(dvnamic allele specific hybridization DASH)和DNA芯片 等技术。尽管这些新方法具有通量高、易于自动化等优点，但其极高的成本和昂贵的仪器设 备是许多中、小型实验室所无法承担的。
利用荧光定量方法来进行SNP分型检测的方法也被广泛应用，比较常用的是Taq腿n探针和 MGB探针法。探针法价格昂贵，对引物设计要求很高，并且受限于目前国内研发水平。
我们可以利用荧光染料SYBRGreenI法来进行SNP分型。基于SNP的二态性，假设某基 因型存在A/G两态性，我们分别设计针对A型和G型的引物，理论上对于AA纯合型，只和A 引物结合；对于GG型，只和G引物结合；对于AG型，可以和两型引物都结合，从而达到分 型的目的。
反映在扩增曲线图上面就是对于AA型，加入引物A的反应管有扩增曲线和其对应的CT 值，而G引物反应管无扩增曲线和CT值；对于GG型，加入引物G的反应管有扩增曲线和其 对应的CT值，而A引物反应管无扩增曲线和CT值；GA型则两者都有扩增曲线和CT。
这种结合荧光定量SYBRGreenI法的SNP分型法，有SYBR Green I法的所有优点。比如 由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程 序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔解曲线 分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色 多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SY服Green I的灵敏 度很高。但也正由于SY服GreenI与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级 结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性，并且影响SNP分型检测定性判 断的准确性。
人们希望在利用这种结合荧光定量SYBRGreen I法的SNP分型法时，进一步提高定性分 析的准确性。
4三.
发明内容
(1) 要解决的技术问题
提供一种即有荧光染料SYBRGreenI检测法的方便、通用、便宜的优点，又能提高其SNP 分型检测特异性的荧光定量PCR基因分型检测方法。
(2) 技术方案
本发明的发明目的是这么实现的先针对SNP样本进行引物设计；利用反相引物和SNP 检测引物进行荧光定量反应，使得每个样本分别获得两种等位基因扩增产物的Ct值和熔解曲 线分析结果；最后根据扩增曲线和熔解曲线判断结果；在引物设计时，对引物进行特殊修饰， 分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3'端倒数第3-7个碱基中进行化学修饰，修饰 方法是在任一个碱基位置以转换或颠换的方式引入1个错配碱基。通过这种化学修饰从而使 引物的错误延伸率降低，提高分型检测的特异性，增强检测结果的专一性。
本发明的一个优选例是所述的引物的化学修饰发生在引物序列倒数第3个碱基位置，在 该位置以转换或颠换的方式引入1个人为的错配碱基。
(3) 有益效果
本方法结合了SYBR Green I法的通用性、简便性和快速性，并且弥补了其不足，增加了 特异性。适合进行大规模SNP检测工作。
简便本方法所使用的SYBR Green I是一种特异结合双链的DNA染料，与DNA结合 后荧光增强1000倍左右，极为适合检测PCR产物，由于SYBR Green I能与所有双链DNA 结合，通用性好，使用简单，价格相对低。
快速PCR只需要40个循环左右即大约1个小时左右就可以完成反应，因而利用荧光定 量SNP检测是一种比较节省时间、快速的方法。
特异在等位基因特异性扩增反应中，在PCR扩增引物的3'末端倒数第三位人为引入一 个不匹配碱基，使得引物延伸的特异性大大提高，降低了SNP的假阳性率。
四.
图l，图2，图3，图5，图6，图7为荧光定量PCR仪上的扩增曲线图。该图的横坐标表示 循环数，纵坐标表示荧光值。图中横线3表示荧光域值；曲线1表示为引物对F1+R1，扩 增样本所生成的扩增曲线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线2为 F2+R1这对引物扩增样本所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2;曲线4表示 为引物对F3+R2，扩增样本所生成的扩增曲线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值 为C3;曲线5为F4+R2这对引物扩增样本所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为 C4。
图l:该图表示引入人为突变后的纯合型正常样本的扩增曲线图。图中显示Cl-C2《-5，指示 样本基因型为GG型。
图2:为引入人为突变后的纯合型突变样本的扩增曲线图。图中显示-l《Cl-C2《1，指示样 本基因型为GA型。图3:为引入人为突变后的杂合型样本的扩增曲线图。图中显示C1-C2》5，指示样本基因型 为AA型。
图4:荧光定量PCR仪上的熔解曲线图。表示多个样本荧光定量PCR的熔解曲线分析结果。 横坐标表示Tm(PCR产物熔解温度)值，纵坐标是表示荧光强度/温度的导数值(Derivative). 图中每条曲线代表1个样本的熔解曲线。图中可以看到每条曲线只有一个高峰，表示每个样 本的产物比较单一，产物的特异性比较好；并且多条曲线的高峰值相同，表示样本产物序列 比较接近。
图5:为没有引入人为突变后的纯合型正常样本的扩增曲线图。 图6:为没有引入人为突变后的纯合型突变样本的扩增曲线图。 图7:为没有引入人为突变后的杂合型样本的扩增曲线图。
五.具体实施方式
实施例1:
基于荧光定量PCR扩增反应的SNP测定法
基本检测流程包括U)引物设计；(2)样本准备及荧光PCR扩增；(3)结果判定；(4)
分析与比较。
以人儿茶酚邻位甲基转移酶(C0MT) Vall58Met为例，COMT定位于22qll，在第四外 显子158号密码子发生G-A的置换，从而导致氨基酸Val与Met的置换，从而影响COMT 活性，Val/val型酶具有高活性，Val/Met具有中活性，Met/Met具有低活性。
(1) 引物设计
找到该SNP相关的基因序列，分别针对A和G位点设计两条上游引物以及一条共同的 下游引物。引物序列如下 上游引物F1: GATGGTGGATTTCGCTGTCG 上游引物F2: GGATGGTGGATTTCGCTGTCA 下游弓l物Rl: CTGGTGGGGAGGACAAAGTG
上述引物为了提高特异性，在上游引物Fl和F2的3'末端倒数第3位人为替换引入一个 不匹配碱基T， Fl和F2分别与Rl扩增检测编码Vall58Met的G~~> A的突变。
(2) 样本准备及荧光定量PCR扩增
6每个样本设立两个定量PCR检测管，分别加入F1+R、 F2+R用于检测正常和突变的等位 基因。每管加入的DNA量为20ng， Hotstart DNA聚合酶1U， SYBR Green I标记PCR扩增产 物，建立25pL的反应体系，荧光定量在ABI公司的7500上进行，real-time PCR条件如下 首先95'C 2min的热变性，随后进行40个循环反应(每个循环包括95'C 15s， 6(TC 1 min)， 于每个循环结束时测定每孔的SYBR Green I吸光度值，扩增结束后，做熔解曲线，根据定量 结果的Ct值和熔解曲线分析结果来判定样本的SNP类型。
(3) 结果判定
如图1，图2，图3所示，这些图为荧光定量PCR仪上的扩增曲线图。图的横坐标表示循 环数，纵坐标表示荧光值。
图中横线3表示荧光域值；曲线1表示为引物对F1+R1，扩增样本所生成的扩增曲线； 曲线荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线2为F2+R1这对引物扩增样本所生成 的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2。
当Cl-C2《-5时，我们判断样本基因型为GG型，如图1所示；
当-l《Cl-C2《1时，我们判断样本基因型为GA型，如图2所示；
当C1-C2》5时，我们判断样本基因型为AA型，如图3所示；
(4) 结果验证
对几个样本获得的扩增产物进行熔解曲线的结果分析，见图4。
每条熔解曲线代表一个样本的熔解过程。曲线图显示每条曲线只有一个熔解峰，显示了 样本产物的单一和引物的特异性。
另一方面，各熔解曲线的峰值相近，从熔解曲线上面不能把不同基因型样本扩增产物区 分开来。这说明用常规SYBRGrcenI法，单用熔解曲线进行样本基因型分析不能达到区分目 的，需要结合扩增曲线分析。而仅用扩增曲线分析，不能判断产物的单一性，需要结合熔解 曲线做辅助判断。
从熔解曲线上面不能把产物区分开来，同时熔解曲线也显示了产物的单一和引物的特异性。
(5) 分析与比较
当引物设计未加化学修饰时，即3'末端倒数第三位没有加不匹配碱基的化学修饰的情况 下，两条针对基因突变A型和基因正常G型引物序列如下
上游弓l物F3: GATGGTGGATTTCGCTGGCG 上游引物F4: GGATGGTGGATTTCGCTGGCA 下游引物R2: CACAGCCGGCCCTTTTTC
扩增结果见图5，图6，图7的样本扩增 线图。图的横坐标表示循环数，纵坐标表示荧 光值。图中横线3表示荧光域值；曲线4表示为引物对F3+R2，扩增样本所生成的扩增曲线； 曲线荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线5为F4+R2这对引物扩增样本所生成 的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2。
当C3-C4《-5时，我们判断样本基因型为GG型，如图l所示；
当C3-C4》5时，我们判断样本基因型为AA型，如图2所示；
当-l《C3-C4《1时，我们判断样本基因型为GA型，如图3所示。
上图中结果分别于A、 B、 C图中的结果对照可看出，没有引入错配的引物不能很好的处 分出GG和AA两种纯合型，没有办法对未知样本进行鉴定。
实施例2:
基于荧光定量PCR扩增反应的SNP测定法 引物设计
仍以人儿茶酚邻位甲基转移酶(C0MT) Vall58Met为例，COMT定位于22qll，在第四 外显子158号密码子发生G-A的置换，从而导致氨基酸Val与Met的置换，从而影响COMT 活性，Val/val型酶具有高活性，Val/Met具有中活性，Met/Met具有低活性。
找到该SNP相关的基因序列，分别针对A和G位点设计两条上游引物以及一条共同的下 游引物。引物序列如下 上游引物F5: GATGGTGGATTTCGCTTGCG 上游引物F6: GGATGGTGGATTTCGCTTGCA 下游引物R3: CTGGTGGGGAGGACAAAGTG
上述引物为了提高特异性，在上游引物F5和F6的3'末端倒数第4位人为替换引入一个 不匹配碱基T， F5和F6分别与R3扩增检测编码Vall58Met的G^> A的突变。
应理解其他在倒数第5个或第6个或第7个碱基所做的人为错配，比如在第5个碱基位 的以转换或颠换式错配修改也属于本发明所述的增加特异性的方法的等效替换。序列表
<110>上海裕隆生物科技有限公司 <120>—种结合荧光定量PCR的基因分型检测方法 <160>9
<210> 1 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F1。 <400> 1
gatggtggat ttcgctgtcg 20
<210>2
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220> 、
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F2。
<400> 2
ggatggtgga tttcgctgtc a 21
<210〉3 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR
的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物Rl。
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<210>4 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220〉
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F3。 <400> 4
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<210> 5 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F4。
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<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物R2。
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cacagccggc cctttttc 18<210> 7 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F5。
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<210> 8 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F6。
<400> 8
ggatggtgga tttcgcttgc a 21
<210> 9 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作一种结合荧光定量PCR 的基因分型检测方法中实施例相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物R3。
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ctggtgggga ggacaaagtg 20
1权利要求
1.一种结合荧光定量PCR的基因分型检测方法，步骤包括引物设计，荧光定量PCR，根据扩增曲线和溶解曲线判断结果；其特征在于，引物的特殊修饰，分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3’端倒数第3-7个碱基中进行化学修饰，修饰方法是在任一个碱基位置以转换或颠换的方式引入1个错配碱基。
2. 如权利要求1所述的结合荧光定量PCR的基因分型检测方法，其特征在于， 所述的引物的化学修饰发生在引物序列倒数第3个碱基位置，在该位置以转换 或颠换的方式引入1个错配碱基。
全文摘要
本发明公开了一种结合荧光定量PCR的基因分型检测方法，解决了荧光定量的SYBR Green法引物延伸错配率高，基因分型检测特异性差的缺点。本发明提供的解决方法是分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3’端倒数第3-7个碱基中，任一个碱基位置以转换或颠换的方式引入1个人为错配碱基，从而使引物的错误延伸率降低来达到目的。运用本发明可以大大提高荧光定量的SYBRGreen法用于SNP基因分型检测的特异性和准确性。
文档编号G01N21/64GK101608215SQ200810039230
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者候洪杰, 汪宁梅, 穆海东, 飒 黎 申请人:上海裕隆生物科技有限公司