专利名称：高血压遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体高血压遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与高血压密切相关的血管紧张素转化酶基因(ACE)、血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)、 内皮型一氧化氮合成酶基因(NOS3)上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体高血压遗传易感性。
背景技术：
原发性高血压(essential hypertension, EH)是以血压升高为主要临床表现的疾病，通常简称为高血 压。高血压是多种心、脑血管疾病的重要病因和危险因素，影响重要脏器如心、脑、肾的结构与功能，最 终导致这些器官的功能衰竭，迄今仍是心血管疾病死亡的主要原因之一。
高血压患病率和发病率在不同国家、地区和种族之间有差别，发达国家较发展中国家高，美国黑人较 白人高(约为白人的2倍)。高血压患病率、发病率及血压水平随年龄增加而升高，在老年人较为常见， 尤其是收縮期高血压。
原发性高血压的发病受多种因素的影响，病因可分为遗传因素和环境因素两个方面。高血压的发生与 发展也正是遗传因素与环境因素相互作用的结果。 一般认为，高血压的发病，遗传因素约占40%，环境因 素约占60%。科学研究表明，携带不同基因型的人患高血压的风险不同，因此了解自己的基因状况，可以 更有针对性地通过饮食、生活习惯的调整来降低患病风险。
血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)是肾素一血管紧张素系统中的关键酶，它 使血管紧张素II的生成增加而减少缓激肽的降解。肾素把血管紧张素原转化为血管紧张素I (Angl),再在 血'管紧张素转化酶(ACE)的作用下转化为血管紧张素II (AngII)，然后通过和血管紧张素II受体结合而 发挥作用。当携带风险基因型时，血清中ACE蛋白的表达量及其活性增加，机体内血管紧张素生成增加， 易引起血管收縮、血管壁增厚，导致血压升高。
血管紧张素II (AngII)作用于血管平滑肌和肾上腺皮质等细胞的血管紧张素卩-1型受体，血管紧张 素II-l型受体被激活后促进血管收縮和醛固酮释放，引起水钠潴留及血压升高，^介导细胞增殖和原癌基
因表达等。当携带风险基因型时，血管紧张素n-i型受体的数目及与配体结合的亲和力增加，从而使动脉
壁对AngII的反应增强，机体对血管紧张素敏感性增高，血管壁张力增加、醛固酮释放增多，易造成水钠 潴留，高血压发生风险增加。
内皮型一氧化氮合成酶(N0S3)主要分布于冠状血管及心腔面的内膜，主要功能是参与精氨酸和脯氨 酸代谢，并催化生成一氧化氮(NO)。当携带风险基因型时，相应蛋白产物第298位上的谷氨酸被替换成天 冬氨酸(Glu298Asp),内皮型一氧化氮合成酶(N0S3)功能受损，机体合成一氧化氮能力降低，导致血管 壁张力增加。
发明内容
基于血管紧张素转化酶基因(ACE)、血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)、内皮型一氧化氮合成酶基 因(N0S3)上的3个SNP位点多态性可用来评估个体高血压遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个 体高血压遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括
检测ACE基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对；
检测AGTR1基因上A1166C SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测N0S3基因上G894T SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； PCK反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成 技术进行合成。本发明试剂盒的组分和含量包括
1. 荧光定量PCR反应套装
10 X荧光定量PCR反应缓冲液2pl， 25raM dNTP混合液0.2^1， 25rnM MgC12溶液1. 2pl， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.05^1， 20PM特异性引物对每条引物各0,225nl， IOMM特异性荧光探针对每条探针各0.25^， 去离子水10.65^1。
2. 电泳检测套装
10X PCR反应缓冲液2.5nl， 25mM dNTP混合液0.2jil， 25mM MgCl2溶液1.5jd， 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125pl， 20nM电泳检测引物对每条引物各0.25pl， 去离子水18. 675^1， 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常紐 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2:电泳检测分型
使用检测试剂盒中的电泳检测套装，反应的体系为总体积25nl，包含浓度为12. 5ng/nl的DNA模板 lnl、 IOXPCR反应缓冲液2.5^1， 25mMdNTP混合液0.2|nl, 25mMMgC12溶液1.5^1, 5units/fxl Taq DNA 聚合酶0.125pl， 20nM电泳检测引物对每条引物各0.25nl，去离子水18.675^。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94'C、 12分钟，进行30个循环的94°C、 30秒，60'C、 30秒， 72°C、 30秒，然后进行72。C、 IO分钟。
然后利用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带数量。
步骤3:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行3次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积l(Hil，包含浓度为20ng/nl的DNA模板2^1、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. lpl 25rnM dNTP 混合液、0.6^1 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20nM的有义引物和反义引物 各0.225pl、 1(HiM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25iLi1，去离子水5.325nl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、 2分钟，95°C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 60'C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的位置和数量来确定所检测的 SNP位点的基因型。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体高血压遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医哮检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒,对被检测者基因组DNA的ACE基因上的SNP位点进行PCR扩增和电泳检测， 对AGTRl基因上A1166C SNP位点、N0S3基因上G894T SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定这3个SNP 位点的基因型。
步骤3:个体高血压遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体高血压遗传易感性的分析报告单,。报告中详细说明了被 检测者高血压遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体高血压遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体高血压遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测血管紧张素转化酶基因(ACE)上SNP位点、血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)上A1166C SNP位点、内皮型一氧化氮合成酶基因(NOS3)上G894T SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括1) 荧光定量PCR反应套装10X荧光定量PCR反应缓冲液2ri，25mMdNTP混合液0. 2W， 25mM MgC12 溶液1.2^1， 5units/W Taq DNA聚合酶0.05W， 2(Ml特异性引物对每条引物各0.225ri, IO幽特异性 荧光探针对每条探针各0.25W，去离子水10.65W。2) PCR反应套装10X PCR反应缓冲液2. 5W, 25raM dNTP混合液0. 2W, 25mM MgC12溶液1. 5t4， 5unitsAa Taq DNA聚合酶0. 20PM特异性引物对每条引物各O. 去离子水18.675W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
全文摘要
本发明公开了一种检测高血压遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测血管紧张素转化酶基因(ACE)、血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)、内皮型一氧化氮合成酶基因(NOS3)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与高血压遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体高血压遗传风险。
文档编号G01N21/64GK101608219SQ20081003926
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司