专利名称：组织块超声脱水方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织切片的制作，尤其涉及组织切片制作过程中利用超声波进行组织块脱 水的方法。
背景技术：
组织切片制作方法目前主要有石蜡制片、快速石蜡制片、冰冻制片和火棉胶制片等方 法。但是这些方法都存在着一定的缺点。如石蜡制片的时间长，不能满足急诊需要；快速 石蜡制片因要求温度较高，片子清晰度较差；冰冻制片要求有液态二氧化碳，基层难以普 及；火棉胶制片难以达到理想的薄度，清晰度也差。因此寻求快快实、简便、清晰度好的 制片方法是快速病理诊断急需解决的问题。而超声波在制片上的应用可有效解决上述问题。 本发明即是通过研究超声波在制片脱水步骤中合适的频率、时间、温度及有关条件，优化 了超声波在石蜡制片中的应用，不仅縮短了组织切片制作时间，也获得了良好的制片质量。发明内容本发明的目的是提供一种新型的组织块超声脱水方法及其应用。本发明的组织块超声 脱水法特别适合快速制作高质量的组织切片。本发明利用了超声波的穿透性和空化效应，将被动的脱水过程变成主动的脱水过程， 使得组织块脱水达到快速的效果，但是由于超声波的热效应会对组织块造成一定的损坏， 从而影响切片质量，因此需要控制超声波的频率、时间和温度等条件之间的关系，从而即 縮短了脱水时间，又不降低组织切片的制片质量。本发明采用了下述技术方案一种组织块超声脱水方法，包括下列步骤室温下，将固定后的组织块采用浓度70% — 100%的乙醇水溶液梯度脱水，在乙醇梯 度脱水过程中，使用超声波2次以上，较佳的使用2—5次，每次4一40分钟。上述室温为20±5°C。上述超声波的频率范围在20—30KHZ,优选24—30KHZ。上述乙醇梯度脱水是指，依次采用70%、 80%、 95%和100%的乙醇脱水。上述组织块固定可采用常规的固定方法，如在20。C下，用10%的甲醛固定24小时。较佳的，上述步骤2为，在室温下，组织块先采用70%的乙醇短暂常法脱水，而后分 别在80%、 95%和100%的乙醇中超声波脱水，每次超声波脱水时间为20—40分钟。较佳 的每次超声波脱水时间为20 — 30分钟。上述70%的乙醇短暂常法脱水时间在30分钟以上，超声波脱水时，在80%的乙醇中 超声波脱水一次、95%和100%的乙醇中各超声波脱水两次。更佳的，上述步骤2为，在室温下，组织块先采用70%的乙醇短暂常法脱水，再用80 %乙醇常法脱水，95%的乙醇常法短暂脱水，再用超声波直接无水乙醇脱水两次，每次超 声波脱水时间为4一40分钟，优选20—30分钟。上述70%的乙醇短暂常法脱水时间至少30分钟，80%乙醇常法脱水时间为2—4小时， 95%的乙醇常法短暂脱水时间为每次至少30分钟，脱水两次。本发明还进一步公开了上述组织块超声波脱水方法在制备组织切片上的应用。本发明公开了一种组织切片制备方法，包括固定、脱水、透明、浸蜡、切片和染色， 其中，脱水即采用前述的组织块超声波脱水方法进行。较佳的，上述浸蜡工序在60'C下进行。 上述乙醇的百分比浓度均为体积百分比浓度。本发明的优点在于，使用了室温进行组织块脱水，方便操作，通过对超声波使用的频 率、时间及温度等相关条件的控制，使得组织块的总脱水时间最短縮为2小时，与常规方 法脱水时间相比可縮短8 — 18小时，而且所获得的切片质量和常规石蜡制片制作的切片基 本相同，有的地方还显得更好一些，优化了制片质量，如本发明的方法縮短了组织块在脱 水、透明和浸蜡中的时间，减少试剂、温度对组织块的损坏；脱水脱脂更彻底，浸蜡能达 到冲水程度，效果很好；切片染色更为清晰，组织和细胞收縮更少，血管和致密组织结构 更清晰等。本发明的快速制作切片方法，还可以带来其它好处，如减少试剂消耗、节约经 费；减少污染，保护工作人员健康；也可加快医疗服务。
图1常法脱水的猪肾组织切片图HE X 100 图2常法脱水的猪肾组织切片图HE X 400图3使用超声波从低浓度至高浓度乙醇脱水的猪肾组织切片图HE X 100 图4使用超声波从低浓度至高浓度乙醇脱水的猪肾组织切片图HE X 400 图5只在无水乙醇脱水中使用超声波的猪肾组织切片图HE X 100 图6只在无水乙醇脱水中使用超声波的猪肾组织切片图HE X 400具体实施方式
以下列举具体实例进一步说明本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的范围。 实施例1组织块超声波脱水实验研究 1材料与方法标本为猪肾组织。试剂为10%甲醛0^%)、不同浓度乙醇。CSF-1B型超声波清洗器(上 海超声波仪器厂)，工作频率为27士3KHZ，输出直流电功率不大于250W。切取猪肾组织块，每块大小为1.5cmX1.5cmX0.2cm，均用常规方法固定(在2(TC下， 用10%甲醛固定24小时)。分三个实验组l组，为常法对照组。取经固定的5块组织，在20卩下依次用70%乙醇和80%乙醇各 脱水一次，每次3小时。再用95%乙醇脱水二次，最后用无水乙醇脱水二次，每次脱水时 间均为3小时。经上述脱水过程后，将组织块置入20'C的二甲苯中透明二次(每次1小时)。 放入60'C的石蜡中浸蜡二次(每次2.5小时)。然后制成组织蜡块切片，HE染色(图l、图 2)2组，为使用超声波从低浓度至高浓度乙醇脱水组。取经固定的100块猪肾组织，分 20个实验小组(2分钟组、4分钟组、6分钟组……，至40分钟组共20个小组，每实验小 组递增2分钟每次超声波脱水的时间)。每实验小组均为5块猪肾组织，在2(TC下，经70 %乙醇短暂常法脱水(至少30分钟)，而后依次在80%乙醇中超声波脱水一次，在95%乙 醇中超声波脱水二次，在无水乙醇中超声波脱水二次。脱水后，用1组常法透明、浸蜡、 染色制成组织切片(图3、图4)。3组，为只在无水乙醇脱水中使用超声波组。取经固定的100块猪肾组织，分20个实 验小组。每实验小组为5块猪肾组织，均在20'C下，经过70%乙醇常法短暂脱水(至少30 分钟)，80%乙醇常法脱水(3小时)，95%乙醇常法短暂脱水二次(每次至少30分钟)。再 使用超声波直接无水乙醇脱水二次(每次时间相同)，每实验小组递增2分钟每次超声波脱 水时间(从2—40分钟，分为20个小组)，脱水后，用l组常法透明、浸蜡、染色制成组 织切片(图5、图6)。2结果与讨论2.1结果表明，2组的组织块脱水程度随着使用超声波时间不断增多而不断提高。从 20分钟实验小组开始，全部组织块完全脱水(包括完全脱脂)。组织块总的脱水时间最短约 为2小时。与1组常法脱水时间(10_20小时)相比，可縮短8 — 18小时。用20分钟实验 小组至40分钟实验小组的组织块制成组织切片的质量，从组织收縮程度、染色清晰程度、 肾小球大小、肾小球结构完整程度、肾小球毛细血管中红细胞完整程度、肾小管大小、肾 小管上皮细胞完整程度和肾间质血管内红细胞完整程度等8方面与1组比较，均无明显差 异。说明使用超声波从低浓度至高浓度乙醇梯度脱水方法的可行性，没有因为超声波的使 用，而使组织和细胞收到显著破坏。2.2 3组结果表明，组织块脱水程度同样随着使用超声波时间不断增多而不断提高。 从4分钟实验小组开始，全部组织块完全脱水(包括完全脱脂)。组织块总的脱水时间最短 约为4一6小时。与1组常法脱水时间(10—20小时)相比，可縮短6—14小时。用4分钟 实验小组至40分钟实验小组的组织块制成组织切片的质量，从按上述8方面标准进行检测， 其结果亦与1组无明显差异。说明组织块经短暂前期常法脱水，在一定时间范围内使用超 声波直接无水乙醇脱水，同样是可行性，没有因为超声波的使用，而使组织和细胞收到显 著破坏。2.3加用超声波，从总的脱水时间来看，3组比2组时间长(3组最短为4一6小时；2 组最短约为2小时)。但3组需要使用超声波的时间大大减少。这对减化组织切片制作手续、 减少超声波可能对组织的破坏是有意义的。因此，认为组织块按常法脱水顺序作短暂脱水 后，再用超声波加无水乙醇脱水，是更好的方法。为确保超声波无水乙醇脱水的质量，可 选定二次使用超声波时间各为20_30分钟的最佳时间范围。2.4通过本实验的教导，本领域的技术人员可以明了，再其它组织切片的制作中，本 发明的方法也是可行的。2.5本实验大多数切片重量和常法制作的切片基本相同，有的地方还显得更好一些， 如脱水脱脂更彻底，切片染色更为清晰，组织和细胞收縮更少，血管和致密组织结构更清 晰等就说明了这一点。
权利要求
1.一种组织块超声脱水方法，包括下列步骤室温下，将固定后的组织块采用体积百分比为70％-100％的乙醇水溶液梯度脱水，在乙醇水溶液梯度脱水过程中，使用超声波2-5次，每次4-40分钟。
2. 如权利要求1所述组织块超声脱水方法，其特征在于，所述室温为20±5°C，超声波 的频率范围在20—30KHZ。
3. 如权利要求1或2所述组织块超声脱水方法，其特征在于，所述乙醇水溶液梯度脱水 是指，依次采用体积百分比70%、 80%、 95%和100%的乙醇水溶液脱水。
4. 如权利要求3所述组织块超声脱水方法，其特征在于，所述步骤2为，在室温下，组 织块先采用70%的乙醇水溶液脱水，而后分别在80%、 95%和100%的乙醇水溶液中超 声波脱水，每次超声波脱水时间为20—40分钟。
5. 如权利要求4所述组织块超声脱水方法，其特征在于，所述超声波脱水时，在80%的 乙醇水溶液中超声波脱水一次，在95%和100%的乙醇水溶液中各超声波脱水两次。
6. 如权利要求3所述组织块超声脱水方法，其特征在于，所述步骤2为，在室温下，组 织块先采用70%的乙醇水溶液脱水，再用80%乙醇水溶液脱水，95%的乙醇水溶液脱 水，再用超声波无水乙醇脱水。
7. 如权利要求6所述组织块超声脱水方法，其特征在于，所述70%的乙醇水溶液脱水时 间在30分钟以上，80%乙醇水溶液脱水时间为2—4小时，95%的乙醇水溶液脱水时间 为每次30分钟以上，脱水两次，再用超声波无水乙醇脱水两次。
8. 如权利要求1—7中任一权利要求所述组织块超声脱水方法，其特征在于，所述每次超 声波脱水时间为20—30分钟。
9. 一种组织切片制备方法，包括固定、脱水、透明、浸蜡、切片和染色，其中，脱水即 采用前述权利要求l一8中任一权利要求所述组织块超声脱水方法进行。
10. 如权利要求9所述组织切片制备方法，其特征在于，所述浸蜡工序在6(TC下进行。
全文摘要
本发明涉及组织切片的制作，公开了一种组织块脱水方法，包括下列步骤室温下，将固定后的组织块采用体积百分比为70％-100％的乙醇水溶液梯度脱水，在乙醇水溶液梯度脱水过程中，使用超声波2-5次，每次4-40分钟。本发明还进一步公开了上述组织块超声脱水方法在制备组织切片上的应用。本发明即缩短了组织块脱水时间，又不降低组织切片的制片质量，特别适合快速制作高质量的组织切片。
文档编号G01N1/28GK101241054SQ20081004317
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月17日 优先权日2008年3月17日
发明者熊义田 申请人:上海市浦东新区知识产权保护协会