专利名称：：一种检测金葡菌肠毒素a的免疫胶体金试纸条及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的免疫胶体金试纸条，同时还涉及免疫胶体金试纸条的制备方法，可实现金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速诊断，适用于大量样品的现场检测、食物中毒和院内感染的快速诊断和应急处理。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(Step/7y/ococcwsa〃/"eus),简称金葡菌，是常见的食物中毒和医院污染的主要病原菌之一，广泛分布于皮肤、粘膜，特别是鸟及哺乳动物的鼻咽部。当动物机体的抵抗力下降或皮肤粘膜破损时，病菌便可乘虚而入，引起畜禽各种化脓性疾病。近年来，金葡菌感染在畜牧业中流行严重，造成极大的经济损失。金葡菌在水分、蛋白质和淀粉较多的食品中极易繁殖并分泌多种体外毒性蛋白，其中金葡菌肠毒素(Staphylococcalenterotoxins,SEs)是引起细菌性食物中毒及肠胃炎的重要致病因子，也是生物战剂中的主要毒素。人体如果食入被肠毒素污染的食物，很快(2~6小时)就会出现恶心、呕吐、腹部疼痛、腹泻等典型的食物中毒症状，重者，尤其是年老患者会发生休克样症状乃至死亡。金葡菌肠毒素是一组分子量小(26kD30kD)、结构相似、血清型不同的可溶性蛋白质，对热稳定，在1CKTC、30min的情况下不能被灭活。根据血清型已鉴定的SEs有SEASEE,由它们引起的食物中毒占金葡菌食物中毒的95%,其中又以SEA居多(77.8%),D型次之(37.5。/。)。近年来，许多新的肠毒素血清型SEG~SER也相继被分离。由金葡菌肠毒素引起的食物中毒一直是世界性的卫生问题，据美国疾病预防控制中心统计，该事件居细菌性食物中毒的第二位，占33%。加拿大占45%,匈牙利、芬兰等欧洲国家占50%以上，我国每年发生的此类中毒事件也非常多，全国各地均有报道。在目前条件下，要完全避免肠毒素对食品及饲料的污染非常困难。除了在粮食收获、储存、加工各个环节科学作业、注意防霉去毒外，唯一有效的办法是加强对食品及祠料等的监控检测，及时发现污染的食品和饲料，并立即剔除，防止肠毒素超标污染的食品进入人类的食物链。自上世纪60年代利用免疫学方法作为金葡菌肠毒素中毒的诊断手段以来，免疫血清学技术这方面的应用发展迅速，现行金葡菌肠毒素的检测方法主要依靠免疫学技术，例如反向间接血凝法(RPHA)、反向被动乳胶凝集实验(RPLA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)。RPHA是将各型肠毒素抗血清吸附或偶联于绵羊、鸡和人红血球表面，再加人被检的含有相应肠毒素的标本，出现血细胞凝集即为阳性。该试验简单、快速，检出灵敏度高，可达1ng/ml，1~3小时即可判定结果。RPLA方法的原理同RPHA,不同之处是将抗体吸附于乳胶颗粒上。RPHA和RPLA敏感性较高，但操作较复杂，需要细菌纯培养和制备肠毒素，实验周期长，从培养到诊断结果需要一个星期，因此不能实现快速诊断，且非特异性反应和假阳性较多。近十几年来，ELISA开始广泛用于肠毒素的检测。此法是利用酶反应测定抗体抗原特异性反应方法，敏感、快速、简便，应用较广。EIISA的缺陷是(1)需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用；(2)操作人员需要经过专门培训；(3)操作过程相对较为复杂；检测所需时间比较长；(4)检测过程局限在实验室内，不适合应用于现场样品的分析。随着经济的发展，尤其是中国加入WTO后，农副产品进出口贸易的扩大，发展并推广筒便、快速、灵敏、适用于样品实地检测的方法势在必行。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种检测金葡菌肠毒素A的免疫胶体金试纸条,结构简单，操作方便，检测快速，灵敏度高，成本低廉，安全简便。本发明的另一个目的是在于提供了一种免疫胶体金试纸条的制备方法，它包括SEA、抗SEA特异性抗体的制备、SEA免疫胶体金检测试纸条的制备。该试纸条操作简便、快速、准确，全过程只需10分钟，不受环境条件的干扰，特异性好，且;f全测灵敏度高，最低检测限为1ng/ml。本发明适用于海关、医院、检验检疫单位等，可实现食品或临床标本中金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测。胶体金免疫层析技术是近年来继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展迅速的一种简便、快速的免疫学检测方法，它解决了目前肠毒素检测方法的弊端，使得检测方法的方便和快速两个优点得以同时实现，顺应了快速检测的发展方向。该技术利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物。其基本原理是以微孔滤膜为栽体，包被已知抗原或抗体，加入待测样品后，经-徵孔膜的毛细管虹吸作用或渗滤作用，使样品中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。目前常用的是胶体金快速免疫层析法(colloidalgoldenhancedimmunochromatographyassay)和'决速扭王点免疫金渗滤法(Dot-immunogoldfiltrationassay)。本发明的检测SEA免疫胶体金试纸条由样品垫、涂覆胶体金标记的抗SEA抗体的金标垫、在检测线和质控线包被有抗SEA抗体的和羊抗鼠IgG的辨酸纤维素膜、吸水垫依次构成(见图1)。在该PVC底板1的两端，分别设有样品垫3和吸收垫7;在该PVC底板1中部设有硝酸纤维膜检测层2，在硝酸纤維膜检测层2与样品垫3交界处，设有包被金标标记抗SEA抗体的金标垫4，在金标垫4一端部分设置在样品垫3之下，其另一端部分设置在检测层2之上；在与样品垫3延续的检测层2上设有检测线5和质控线6，在该检测线5和质控线6上分别包被有抗SEA抗体和羊抗鼠IgG。一种制备检测SEA免疫胶体金试纸条，其步骤是1.SEA的制备通过PCR法筛选出产肠毒素A金黄色葡萄球菌，提取产肠毒素A金葡菌标准抹的基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增产物，PCR产物经纯化后，与pGEM-TEasy(Promega公司购置)克隆载体进行连接、转化、测序，含SEA正确序列的重组质粒经M7el和EcoRI双酶切，与经同样双酶切的pET28a(Novagen公司购置)表达载体进行连接和转化，重组质粒pET-SED转化大肠杆菌8Z_27产DE3人Novagen公司购置)，30°C0.5mMIPTG诱导过夜，离心收集菌体。按菌体重1(g):10(ml)的量加入50mMpH8.0Tris-HCIbuffer。在冰水上进行超声波破菌。4°C,5OOOrpm,离心10min,分别收集上清液和沉淀，进行12%SDS-PAGE电泳分析。安装XK26柱子(PharmaciaBiotech),进行清洗、装镍、平衡程序，上清液经过0.45|jm滤器过滤后开始上样，用含40mM咪唑的Washingbuffer清洗Ni离子层析柱，用250mM咪唑的曰utionbuffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液，即为纯化的SEA,4°CPBS透析过夜，以BCA法测定蛋白浓度，2mg/ml分装，冰冻干燥呈干粉保存。12%SDS-PAGE电泳检测纯化的SEA。2.抗SEA特异性抗体的制备选用6~8w的雌性Ba旧/c小鼠。初次免疫将SEA与弗氏完全佐剂(Sigma)混合，乳化完全，皮下多点注射，50ijg/只。每隔2周，用相同剂量的SEA与弗氏不完全佐剂(Sigma)进行加强免疫，共加强免疫2次。最后一次免疫后8~10天小鼠尾部取血，通过间接ELISA测抗血清效价，如效价理想，则摘小鼠眼球放血。通过ProteinG亲和层析法纯化抗SEA抗体，具体步骤如下轻轻将抗血清置于ProteinG亲和层析柱(KPL)柱吸附琼脂的表面，用10倍柱体积的1xWashing/BindingBuffer(0.1M磷酸钠缓冲液，0.15MNaCI，pH7.4)洗吸附柱，用4倍柱体积的1xElutionBuffer(0.2M甘氨酸，pH2.85)洗脱，得到SEA特异性抗体。3.金黄色葡萄球菌肠毒素A胶体金检测试纸条的制备3.1空白胶体金的制备采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在烧瓶加入1000ml双蒸水和10ml1%氯金酸，加热至沸腾(约IO(TC)，加入20ml1。/。杵檬S吏钠，继续煮沸约10~20分钟，直到液体呈亮红色即停止加热。将烧杯置于室温(20~25°C，以下相同)水浴中冷却。4'C冷藏保存，注意避免污染及强光照射。在标记前，1500rpm离心去沉淀。3.2胶体金标记抗体的制备取空白胶体金，用0.1MK2C03将pH值调至7.4。在磁力搅拌下緩慢滴入稀释好的抗体，每ml胶体金加入20|jg抗体，继续搅拌30分钟。4°C,10000rpm高速离心40分钟，轻轻吸除上清，用金标抗体保存液重悬松散的胶体金沉淀。3.3金标垫的制备调试二维喷动仪(BIODOT),将标记好胶体金的抗SEA抗体均匀地喷在玻璃纤维膜上，喷液量为0.6微升/厘米，37'C烘干过夜，封袋备用。3.4包#皮"荑的制备调试二維喷动^f义(BIODOT),将稀释好的抗SEA抗体(1.5mg/ml)均勾地喷在硝酸纤维膜上，得到检测线(T线)；将稀释好的羊抗鼠二抗(2mg/ml)均匀地喷在硝酸纤维膜上，得到质控线(C线)，喷液量均为0.6微升/厘米，37'C烘干过夜，封袋备用。本发明试剂的工作原理采用胶体金免疫层析技术，选用SEA特异性抗体作为固相物，利用双抗夹心法原理检测样品中是否含有SEA。当待检标本中含有SEA时，抗原先和胶体金标记的抗SEA抗体结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的抗SEA抗体时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。免疫胶体金快速检测技术之所以能在检测工业中迅速崛起，主要是因为与其他检测方法比较具有以下独特的优点(l)迅速，在15分钟之内可出结果，这是目前其它快速检测方法所无法达到的，ELISA法出结果要1~2h,以灵敏度高见长的PCR也步骤繁瑣，耗时甚长。这与胶体金本身显色特点有关，也与免疫层析法和斑点免疫渗滤的"免疫浓缩"(lmmunoConcentation，ICON)有关；(2)灵敏度高，达到和ELISA相似的灵敏度，如果加入增敏试剂，多用银加强剂，可超过ELISA1~2个数量级。此外，由于胶体金标记蛋白质是一物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试剂非常稳定，不受温度等外界因素影响，可在办公室、家中甚至野外进行检测，实验结果也可长期保存；(3)成本低廉，所需试剂和样本量少。因为"免疫浓缩"，所需试剂和样本量都非常少，样本量可低至1~2|jl;再加上无需任何仪器和设备,并且可单份标本检测，使成本大幅下降；(4)安全筒便，不需任何仪器和设备，只需制备好的试纸条或试剂盒即可。更由于胶体金本身具有颜色，比ELISA省略了加显示剂和终止液的步骤，大大筒化了操作，更适合于野外或床边的现场应用。因为没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与，所以也不会污染环境，具有放射性同位素或酶标等4企测方法所无法比拟的安全性。本发明与现有技术相比具有如下优点(1)检测速度快，全过程只需10分钟，可以实现单个样品或大量样本的检测；(2)灵敏度高，最低检测限为1ng/ml;(3)操作简便，操作人员无需经过专业培训，按说明书即可完成操作，易于推广使用；(4)不需要任何仪器，特别适合现场检测；(5)不需要细菌的纯培养和制备肠毒素，检测样本无需浓縮，所需试剂和样本量少，样本量可低至1~2|jl。在食物中毒的应急处理过程中，快速检测是控制食物中毒的主要手段和措施。检测水平的滞后将会导致食物中毒和院内感染无法得到快速的检测和应急处理，是一个重大的公共卫生问题，严重影响人民身体健康和经济建设。通过该方法可满足以下需求(1)疾病控制方面适用于流行病学调查，可实现在食物中毒的应急处理过程中的快速^r测，从而及早预防疫情的扩散；(2)卫生检验方面特别适合大量样品的现场检测，为进出口食品卫生质量的有效监控提供技术支持，保证食品安全，維护人类健康；(3)临床检验方面为食品中毒的病人实现快速、准确的病情;险测。因此，本发明具有非常广阔的应用前景。图1为一种金葡菌肠毒素A免疫胶体金试纸条的结构示意图；1—PVC底氺反；2—^肖酸多f维月莫斗企观寸层；3—才羊品^s4—金才示垫；5—冲全测《戋；6—质4空线；7-吸水垫。图2是金黄色葡萄球菌肠毒素A的SDS-PAGE分析，M为蛋白Marker(Fermentas),泳道1为纯化前的SEA,泳道2为纯化后的SEA;图3是金黄色葡萄球菌肠毒素A胶体金快速检测试纸条的阳性结果，样品液为金黄色葡萄球菌肠毒素A;图4是金黄色葡萄球菌肠毒素A胶体金快速检测试纸条的阴性结果，样品液为PBS緩冲液。具体实施方式实施例1:金葡菌肠毒素A免疫胶体金试纸条的连接关系是根据图1可知，它包括样品垫3，涂覆胶体金标记的抗SEA抗体的金标垫4、在检测线5和质控线6包被有抗SEA抗体的和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、吸水垫7,—种金葡菌肠毒素A免疫胶体金试纸条其连接关系是适当尺寸的PVC底板1;在该PVC底板1的两端，分别设有样品垫3和吸收垫7;在该PVC底板1中部设有硝酸纤維膜检测层2,在硝酸纤维膜检测层2与样品垫3交界处，设有包被金标标记抗SEA抗体的金标垫4,在金标垫4一端部分设置在样品垫3之下，其另一端部分设置在检测层2之上；在与金标垫4延续的检测层2上设有检测线5和质控线6,该检测线5和质控线6上分别包被有抗SEA抗体和羊抗鼠|gG。检测样品依次由样品垫3到金标垫4,再经过检测线5和质控线7,完成整个纟企测过程。实施例2:产SEA金葡菌标准抹的分离本实施例选用金黄色葡萄球菌(张文利.，等不同培养方法对金黄色葡萄球菌肠毒素结果得影响.中国卫生检验杂志,2004，14(1):108)作为筛选菌抹。根据已知金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因序列(GenBank登陆号M28521),利用Primer5.0设计上游引物seaF:5'GCCGCTAGCATGAAAAAAACAGCATTTACATTAC3',(下划线为A/heI酶切位点)；下游引物seaR:5'CGCCGTCGACTTAACTTGTATATAAATATATATCAA3',(下划线为Sa/1酶切位点)。接种金葡菌(张文利.,等不同培养方法对金黄色葡萄球菌肠毒素结果得影响.中国卫生检验杂志，2004,14(1):108)于7.5。/。氯化钠肉汤，37。C振荡培养24h，采用金黄色葡萄球菌检测试剂盒(购自华美生物工程公司)提取金葡菌核酸，具体操作为取1.5ml菌液，4°C13000rpm离心2min，弃上清。沉淀加入200iJlEDTA和50|jlElution充分混匀，13000rpm离心1min，去上清。加入450|jl生理盐水和50|jl样品裂解液l,离心1min，去上清。加入1ml生理盐水洗涤，离心1min，去上清。加入50|jl样品裂解液ll,55。C反应30min。95。C灭活15min,13000rpm离心5min,取上清作为模板，seaF、seaR为引物进行PCR扩增，程序为94。C预变性3min;94°C1min,55°C1min，72°C1min循环25次；72。C延伸10min。凝胶电泳分析显示，从野生型金黄色葡萄球菌中得到大小约773bp的扩增产物，与SEA基因预期大小一致(金黄色葡萄球菌检测试剂盒，华美生物工程公司)。实施例3:SEA的制备提取产肠毒素A金葡菌标准抹的基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增产物，PCR产物经DNAExtractionKit(Fermentas公司)纯化后，与pGEM-TEasy克隆载体(Promega公司)进行连接、转化、测序，含SEA正确序列的重组质粒经A//7el和Sa/I双酶切，与经同样双酶切的pET28a(Novagen公司)表达载体进行连接和转化，重組质粒pET-SED转化大肠杆菌SL27r。E3义37°C1mMIPTG诱导6h，离心收集菌体。按菌体重1(g):10(ml)的量加入50mMpH8.0Tris-HCIbuffer,在冰水上进行超声波破菌。4°C,5OOOrpm,离心10min,分别收集上清液和沉淀，进行12%SDS-PAGE电泳分析。利用表达载体pET28a(Novagen公司)上带有的组氨酸标签纯化重组SEA蛋白，具体步骤如下安装XK26柱子(PharmaciaBiotech公司)，进行清洗、装镍、平衡程序，用含150mM咪唑的Washingbuffer清洗Ni离子层析柱，用500mM咪唑的Elutionbuffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液，即为纯化的SEA。将收集的目的蛋白緩慢稀释到复性緩冲液(2mol/L尿素，50mmol/LTris-HCI,1mmol/LEDTA,20mmol/L(3-ME,pH7.4)中，4。C搅拌3h,透析过夜(20mmol/LTris墨HC1，1mmol/LEDTA，pH7.4),离心后收集上清，以BCA法测定蛋白浓度，冰冻干燥呈干粉保存。12%SDS-PAGE电泳检测纯化的SEA为一条带，为电泳纯(见图2)。SEA纯化蛋白的免疫印迹结果显示，复性后的SEA蛋白能与兔抗SEA多克隆抗体(DENKASEIKEN公司)特异性结合，在相对分子质量31000处有一棕色条带，与SEA蛋白的预期大小一致，说明通过基因工程技术制备的SEA蛋白具有良好的免疫原性，得到SEA抗原。实施例4:抗SEA特异性抗体的制备抗SEA多克隆抗体的制备选用6~8w的雌性Ba旧/c小鼠。初次免疫将SEA与弗氏完全佐剂(Sigma)混合，乳化完全，皮下多点注射，50叩/只。每隔2周，用相同剂量的SEA与弗氏不完全佐剂(Sigma)进行加强免疫，共加强免疫2次。最后一次免疫后8~10天小鼠尾部取血，通过间接ELISA测抗血清效价，如效价理想，则摘小鼠眼球放血，分离血清。抗SEA单克隆抗体的制备选用6~8w的雌性Ba旧/c小鼠，免疫程序同多克隆抗体制备，最后一次免疫后8~10天小鼠尾部取血，通过间接ELISA测抗血清效价，如果效价理想(至少达到104),则取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以生成杂交瘤母克隆细胞，并对母克隆上清液进行ELISA检测。通过有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，并对亚克隆上清液进行ELISA检测。通过ProteinG亲和层析法纯化抗SEA多克隆抗体/单克隆抗体，具体步骤如下轻轻将抗血清/腹水置于ProteinG亲和层析柱(KPL)柱吸附琼脂的表面，用10倍柱体积的1xWashing/BindingBuffer(0.1M磷酸钠緩冲液，0.15MNaCI,pH7.4)洗吸附柱，用4倍柱体积的1x曰utionBuffer(0.2M甘氨酸，pH2.85)洗脱，得到SEA特异性抗体。实施例5:SEA胶体金检测试纸条的制备1.40nm空白胶体金的制备(1)1%氯金酸的配制用1000ml双蒸水溶解10g氯金酸，0.22ijm滤膜过滤，置4'C备用。(2)1%柠檬酸钠的配制用1000ml双蒸水溶解10g柠檬酸钠，0.22|jm滤膜过滤，置4'C备用。(3)方法采用柠檬酸盐还原法，在烧瓶加入1000ml双蒸水和10ml1%氯金酸，加热到沸腾(约IO(TC)。加入1%柠檬酸钠20ml,继续煮沸10~20分钟，直到液体呈亮红色即停止加热。将烧杯置于室温(20~25°C,以下相同)水浴中冷却(20~25°C),制成颗粒直径为40nm的胶体金颗粒。4'C冷藏保存，注意避免污染及强光照射。在标记前，1500rpm离心去沉淀，得到40nm空白胶体金。2.胶体金标记抗体的制备(1)0.1M碳酸钾的配制用1000ml双蒸水溶解13.8g碳酸钾，0.22pm滤膜过滤，置4'C备用。(2)才示i己洗涂液的西己制10%BSA，0.01MpH7.4PB溶液，0.2g/LNaN3,0.22|jm滤膜过滤，置4。C备用。1000ml标记洗涤液的配方100gBSA，0.2gNaN3，1000mlPB溶液。(3)金冲示4元体4呆存液的西己制1%BSA,0.01MpH7.4PB溶液，0.2g/LNaN3，0.22pm滤膜过滤，置4。C备用。1000ml标记洗涤液的配方10gBSA，0.2gNaN3，1000mlPB溶液。(4)方法取空白胶体金，用0.1MK2C03将pH值调至7.4。在磁力搅拌下緩慢滴入稀释好的抗SEA抗体，每ml胶体金加入20|jg抗体，继续搅拌30分钟。4°C,lOOOOrpm高速离心40分钟，轻轻吸除上清，用标记洗涤液洗涤一次，离心，去上清，用金标抗体保存液重悬松散的胶体金沉淀，4'C冷藏保存，得到胶体金标记的抗SEA抗体。3.金标垫的制备调试BIODOT二维喷动仪，将标记好胶体金的抗SEA抗体均匀地喷在玻璃纤维膜上，喷液量为0.6微升/厘米，37。C烘干过夜，得到金标垫，封袋备用。4.包被膜的制备用0.01MpH7.2PB緩冲液将抗SEA抗体的浓度稀释为1.5mg/ml，将羊抗鼠二抗的浓度稀释为2mg/ml。调试BIODOT公司的二维喷动仪，将稀释好的抗SEA抗体均匀地喷在硝酸纤维膜上，得到检测线(T线)；将稀释好的羊抗鼠二抗均匀地喷在硝酸纤维膜上，得到质控线(C线)。喷液量为0.6微升/厘米，37。C烘干过夜，得到包被膜，封袋备用。5.SEA胶体金快速检测试纸条的组装与包装将样品垫、金标垫、包被膜、吸水纸粘贴在PVC底板上，用切条机将试纸裁剪成6cmx4cm规格，将试纸条装入外壳内。组装车间温度控制在25°C,湿度20%~30%。将试纸条与干燥剂封装在铝箔塑料袋内，于430'C避光保存，不得冻存。铝箔打开后应尽快使用试纸条，受潮后试纸条将失效，保质期一年。6.SEA胶体金快速检测试纸条的使用在检测前先将样本和试纸条在室温条件下放置，使其平衡至室温。取出检测试纸条，平放于操作台上，在加样孔内加入2滴(或100口l)待检样品，10分钟内可判定结果，超过30分钟的结果无效。结果判断1.阳性在观察孔内，检测线(T)及质控线(C)出现紫红色线(图3)。肠毒素浓度越高，检测线(T)颜色越深。2.弱阳性在观察孔内，检测线(T)及质控线(C)出现紫红色线，但检测线(T)出现的颜色很浅。3.阴性在观察孔内，只有质控线(C)出现一条紫红色线(图4)。4.失效在观察孔内，质控线(C)和检测线(T)都不出现色线；或仅检测线(T)出现色线。实施例6:SEA胶体金快速检测试纸条灵敏度与稳定性的检测特异性试验选用SEA、SEB、SED蛋白作为样品，采用实施例5制备的SEA免疫胶体金检测试纸条进行测试，结果SEA样品在检测线(T)及质控线(C)均出现紫红色线，显阳性；SEB和SED样品只在质控线(C)出现一条紫红色线，显阴性。稳定性试验将实施例5制备的SEA免疫胶体金检测试纸条分别放置于4。C室温(20~25°C)30天，取出后分别用SEA样品进行检测，测试的结果与特异性测试结果一致。灵敏度试验将实施例5制备的SEA免疫胶体金检测试纸条，加入用样品稀释液倍比稀释的SEA100|J|,平放于操作台上，10分钟判定结果，SEA免疫胶体金检测试纸条可检测出浓度低至1ng/ml的SEA,显示出较高的敏感性，见表1。表1SEA胶体金检测试纸敏感性的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1.一种检测金葡萄肠毒素A的免疫胶体金试纸条，它包括样品垫(3)、检测线(5)和质控线(6)，其特征在于在PVC底板(1)的两端分别设有样品垫(3)和吸水垫(7)，在PVC底板(1)中部设有硝酸纤维膜检测层(2)，在硝酸纤维膜检测层(2)与样品垫(3)交界处设有包被金标标记抗SEA抗体的金标垫(4)，在金标垫(4)一端设置样品垫(3)，另一端设置在硝酸纤维膜检测层(2)上，在与金标垫(4)延续的硝酸纤维膜检测层(2)上设有检测线(5)和质控线(6)，在检测线(5)和质控线(6)上分别包被有抗SEA抗体和羊抗鼠IgG。2、一种用于实现权利要求1所述的一种检测金葡萄肠毒素A的免疫胶体金试纸条的制备方法，它包括下列步骤A、SEA的制备通过PCR法筛选出产肠毒素A金黄色葡萄球菌，提取产肠毒素A金葡菌标准抹的基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增产物，PCR产物经纯化后，与pGEM-TEasy克隆载体进行连接、转化、测序，含SEA正确序列的重组质粒经M7el和EcoRI双酶切，与经同样双酶切的pET28a表达载体进行连接和转化，重组质粒pET-SED转化大肠杆菌8/_270)￡3,，30°C0.5mMIPTG诱导过夜，离心收集菌体，在冰水上进行超声波破菌，离心，分别收集上清液和沉淀，进行电泳分析，安装XK26柱子，进行清洗、装镍、平衡程序，上清液经过0.45|jm滤器过滤后开始上样，用含40mM咪唑的Washingbuffer清洗Ni离子层析柱，用250mM咪唑的Elutionbuffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液，测定蛋白浓度，冰冻千燥呈干粉保存；B、抗SEA特异性抗体的制备通过ProteinG亲和层析法纯化抗SEA抗体，首先是将抗血清置于ProteinG亲和层析柱柱吸附琼脂的表面；其次是用10倍柱体积的1xWashing-BindingBuffer洗吸附柱；第三是用4倍柱体积的1x曰utionBuffer洗脱，得到SEA特异性抗体；C、金黄色葡萄球菌肠毒素A胶体金检测试纸条的制备a、空白胶体金的制备采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在烧瓶加入1000ml双蒸水和10ml1%氯金酸，加热至沸腾，加入20mM。/。柠檬酸钠，继续煮沸约10-20分钟，直到液体呈亮红色，将烧杯置于室温，水浴中冷却，冷藏保存；b、胶体金标记抗体的制备取空白胶体金，用0.1MK2C03将pH值调至7.4,在磁力搅拌下滴入稀释好的抗体，每ml胶体金加入20ijg抗体，继续搅拌30分钟，离心，吸除上清，用金标抗体保存液重悬松散的胶体金沉淀；c、金标垫的制备调试二维喷动仪，将标记好胶体金的抗SEA抗体均匀地喷在玻璃纤维膜上，喷液量为0.6微升/厘米，37。C烘干过夜，封袋备用；d、包被膜的制备调试二维喷动仪，将稀释好的抗SEA抗体均匀地喷在硝酸纤维膜上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠二抗均勻地喷在硝酸纤维膜上，得到质控线，喷液量均为0.6微升/厘米，37'C烘干过夜，封袋备用。全文摘要本发明公开了一种检测金葡菌肠毒素A的免疫胶体金试纸条及制备方法，包括一种表达重组SEA蛋白的工程菌的构建，SEA蛋白的分离纯化，抗SEA特异性抗体的制备，SEA胶体金检测试纸条的制备。该试纸条由样品垫、涂覆金标标记抗SEA抗体的金标垫、在检测线和质控线包被有抗SEA抗体的和抗鼠IgG的硝酸纤维素膜构成，依次按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜，吸水垫粘附在PVC底板上。该试纸条操作简便、快速、准确，全过程只需10分钟，不受环境条件的干扰，特异性好，且检测灵敏度高，最低检测限为1ng/ml。本发明适用于海关、医院、检验检疫单位等，可实现食品或临床标本中金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测。文档编号G01N33/558GK101271110SQ20081004693公开日2008年9月24日申请日期2008年2月27日优先权日2008年2月27日发明者张仁利,茵甄,胡章立申请人:深圳大学;深圳市疾病预防控制中心