专利名称：豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法
技术领域：
本发明涉及到蔬菜作物盐胁迫下其耐盐程度的高低，具体来说是涉及豇豆耐盐能力的鉴定方法。
背景技术：
盐害是影响豆类生产最严重的非生物胁迫因素之一，严重影响作物的生长发育，引起干物质和产量都下降，因而作物的耐盐性倍受关注。众所周知，耐盐性受多基因调控且与多种蛋白相关。因此盐害几乎影响了植物的所有功能，如对水分吸收的减少、引起钠离子累积以及矿物离子的不平衡，由钠离子渗入而引发的细胞内生化物质紊乱，以及由此而产生的新陈代谢、生理、光合等各方面的复杂反应，此外，还包括形态如种子发芽率下降、芽长度减少等。因此，在选育优质高产蔬菜品种的同时，抗盐性也受到人们的关注。
豇豆是一种耐盐性中等的蔬菜，目前对豇豆耐盐性方面已经开展了形态、生理生化、分子方面的研究，但对抗性遗传方面研究甚少，且都只限于表型值的遗传分析，但对豇豆基因型耐盐遗传多样性和基因型鉴定等的研究未见报道。目前豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定存在指标多需要测定盐害指数、株高、单株鲜重、茎粗、真叶面积、叶片数、平均净同化率、叶绿素含量、叶绿素a/b值、类胡萝卜素含量、可溶性蛋白质含量、丙二醛含量、相对膜透性、伤害率、APX活性、SOD活性、CAT活性、POD活性共18个指标但不集中、综合性差、鉴定效果不准确，不能进行耐盐预测等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法操作简便，适应性广的豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法，以解决上述问题。
本发明的技术方案为豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法，它是对培养的豇豆幼苗进行盐胁迫处理后，取其复叶叶片对幼苗叶片的株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT活性指标的测定，利用D＝-0.40+0.42X3+0.11X8+0.29X11+0.31X14+0.22X17计算出耐盐综合评价值D，从而得到豇豆基因型耐盐能力；其中X3、X8、X11、X14、X17分别代表株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT的SRI值，SRI＝(盐胁迫处理下性状表型值/自然条件下性状表型值)×100％。盐胁迫处理下性状表型值为盐胁迫处理后，分别是所检测到的株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率；自然条件下性状表型值分别是自然条件下所检测到的株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率。
该方法克服了传统的签定方法指标多但不集中、综合性差、鉴定效果不准确，不能进行耐盐预测等缺点。而用SRI相对比值法能较客观地反映植物的受害程度，消除品种间存在的生态发育差异。但因品种和各单项指标间的变幅不同，故用单项指标SRI值来评价品种耐盐性则结果各异。因此该方法很好的解决了豇豆耐盐能力鉴定比较困难的问题。本方法系统性、综合性强。方法操作简便，适应性广，可资其他植物耐盐能力鉴定借鉴。能判别未知豇豆基因型的耐盐性。预测豇豆种质耐盐能力的准确性高。
具体实施例方式 1、上述的幼苗培养具体步骤为用70％的酒精表面消毒2min，并用去离子水充分冲洗后，放于消毒的培养皿内湿润滤纸上，在恒温培养箱(28℃±1℃，80％相对湿度)中萌发1天，将萌动后的种子播种到装入相同重量和肥力土壤的育苗盆(9cm×15cm)内，放置温室内培养。出苗后适时均匀浇水，保证幼苗生长条件一致。
2、盐胁迫处理培养14天后，选择生长健壮，长势一致的幼苗进行盐胁迫处理。此时长豇豆幼苗处于两片真叶期，去掉子叶，洗净根系，用黑色牛皮纸固定并水培于含有100ml营养液(pH6.5，经0.1M KOH或者0.1M HCl调节)的干净塑料杯中。营养液采用Hoagland完全配方，处理浓度为75mM NaCl(用Hoagland营养液配制，EC 2.2～2.5ms/cm)，设置4次重复，每次重复10株。培养条件为昼夜平均温度分别为30℃和20℃，相对湿度80％，自然光照(日长13小时，日间平均光照强度180μmol·m-2·s-1)。为防止吸收和水分蒸发引起盐浓度的改变，每3天换一次营养液，每天摇动塑料杯以保证植株根系通气。
3、测定五个典型指标在盐胁迫后的第15天早上8点，取其复叶叶片用于幼苗叶片的盐害指数、株高、单株鲜重、茎粗、真叶面积、叶片数、平均净同化率、叶绿素含量、叶绿素a/b值、类胡萝卜素含量、可溶性蛋白质含量、丙二醛含量、相对膜透性、伤害率、APX活性、SOD活性、CAT活性、POD活性共18个指标的测定。
4、上述的逐步回归建立优化回归方程，并对其有效性进行验证的具体步骤为(1)各单项指标盐反应指数(SRI)的主成分分析通过对盐害指数等这18个单项指标的盐反应指数(SRI)进行主成分分析，得出株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT这5个综合指标的累计贡献率达82％，说明这5个主成分所代表的指标进行耐盐性评价具有代表性。(2)豇豆基因型耐盐能力的综合评价在主成分分析的基础上，将原来个数较多的指标转换成为新的个数较少且彼此独立的综合指标，求出各品种的每一个综合指标值[CI(x)]及相应的隶属函数值[u(x)]后，依据各综合指标的权重(0.55，0.17，0.12，0.09，0.07)进行加权，便可得到各品种抗逆性的综合评价值(D值)。各品种耐盐性的综合评价值(D值)是一个
闭区间上的纯数，使其间差异有可比性。
5、上述基因行综合评价值(D)确定的具体步骤为通过逐步回归方法所建立的最优回归方程包含了对因变量有显著影响的自变量，不包含对因变量没有显著影响的自变量。把耐盐综合评价值(D值)作因变量，结合各单项指标的类型和测定难易程度，经逐步回归筛选出与因变量有显著效应的自变量，再把各单项指标的盐反应指数(SRI)作自变量建立最优回归方程 D＝-0.40+0.42X3+0.11X8+0.29X11+0.31X14+0.22X17 式中X3、X8、X11、X14、X17分别代表株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT的SRI值。方程R＝0.95，F＝24.7，方程极显著。另外为了检验这5项指标对18项指标的代表性及其相对重要性，在逐步回归的基础上，对与耐盐综合评价值(D值)显著相关的5个单项性状进行了通径分析，利用相关系数矩阵得通径系数。通径分析表明5个性状对耐盐综合评价值的相对重要性依次为CAT＞株重＞可溶性蛋白质＞伤害率＞叶绿素。
6、上述利用回归方程对豇豆耐盐能力进行预测的具体步骤为耐盐性预测方法可在相同条件下测定其它品种上述5项指标，求SRI值，用回归方程(D＝-0.40+0.42X3+0.11X8+0.29X11+0.31X14+0.22X17)计算耐盐综合评价值(D值)，来判断具体品种的耐盐性。其中D≥0.68以上，品种抗盐性高，0.48＜D＜0.68，则表示该品种抗盐性中等；D≤0.48，该品种抗盐性差。尽管该回归方程极显著，通径分析也表明5项指标对D值的决定系数很高，本研究仍从两个方面进一步检验该回归方程的可靠性。一是利用上述预测方法对23个豇豆品种依5项指标算出预测值，然后将各品种预测值与其耐盐性综合评价实测值进行相关分析，结果是二者的相关系数r＝0.99，达到极显著水平。说明这5项指标的代表性强，用此回归方程对品种耐盐性预测效果较好。二是实施增大NaCl浓度梯度的品种半致死时间和浓度实验。根据综合评价结果随机挑选了3个耐盐性等级的品种各2个。结果表明品种间对盐胁迫的反应存在着显著变异，在处理16天后，有一半植株被致死的浓度(见表1)和不同盐浓度梯度下的半致死时间(见表2)存在较明显的差异。通过18项指标综合评价为耐盐性强的鄂豇豆二号和青荚长有较高的半致死浓度(150mM NaCl)和较长的半致死时间，矮虎和茶罗米一与之相反，而它们正是综合评价为盐敏感的品种。该鉴定结果同综合评价结果一致，故通过18项指标综合评价基因型耐盐能力遗传多样性的结果是可靠的，而回归方程是对综合评价的有效简化，因此，通过逐步回归方法建立的回归方程可以预测长豇豆种质的耐盐能力。
本发明适合于豇豆的各种基因型。
表1不同长豇豆品种在NaCl浓度梯度下的植株死亡率(处理后第16d)
表2不同长豇豆品种在NaCl浓度梯度下植株的半致死时间
以鄂豇豆二号为例说明 根据前面的技术方案中所介绍的培养条件进行幼苗的培养及盐胁迫处理。测定该品种幼苗叶片的株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT，根据公式SRI＝(盐胁迫处理下性状表型值/自然条件下性状表型值)×100％，计算出其对应的SRI值，得出上述五指标的SRI分别为90.5％，70.4％，72.1％，41.1％，129.6％。
然后代入公式D＝-0.40+0.42X3+0.11X8+0.29X11+0.31X14+0.22X17式中X3、X8、X11、X14、和X17分别代表株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT的SRI值。最后得出D为0.68。根据上述D值的含义，可知该品种属于抗盐性强的品种。对新的豇豆种质通过控制在相同条件下的5项指标的测定，求出其D值，就可以判别其耐盐能力水平。
本发明的创新之处有五点第一，确定了豇豆基因型氯化钠敏感浓度。第二，以盐胁迫处理下性状表型值与自然条件下性状表型值的相对比值(Salt response index，SRI)作为耐盐指标。第三、利用逐步回归在抗逆性综合评价值与所测指标间建立最优回归方程，并确定了其有效性，从而大大提高了准确性，而且简便。第四，筛选出5个与耐盐性有显著相关性的指标(包括株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT)，同时进行综合评价。第五，对豇豆基因型耐盐能力进行预测。
权利要求
1、一种豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法，它是对培养的豇豆幼苗进行盐胁迫处理后，取其复叶叶片对幼苗叶片的株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT活性指标的测定，利用D＝-0.40+0.42X3+0.11X8+0.29X11+0.31X14+0.22X17计算出耐盐综合评价值D，从而得到豇豆基因型耐盐能力；其中X3、X8、X11、X14、X17分别代表株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT的SRI值，SRI＝(盐胁迫处理下性状表型值/自然条件下性状表型值)×100％。
2、如权利要求1所述豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法，其特征是所述培养的豇豆幼苗是这样培养的用70％的酒精表面消毒2min，并用去离子水充分冲洗后，放于消毒的培养皿内湿润滤纸上，在28℃±1℃，80％相对湿度的恒温培养箱中萌发1天，将萌动后的种子播种到装入相同重量和肥力土壤的育苗盆内，放置温室内培养。
3、如权利要求1所述豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法，其特征是所述盐胁迫处理在培养豇豆幼苗14天后，选择生长健壮，长势一致的幼苗，去掉子叶，洗净根系，用牛皮纸固定并水培于含有pH 6.5的营养液的干净塑料杯中；营养液采用Hoagland完全配方，处理浓度为75mM NaCl，采用Hoagland营养液配制，EC 2.2～2.5ms/cm；设置4次重复，每次重复10株；培养条件为昼夜平均温度分别为30℃和20℃，相对湿度80％，自然光照。
4、如权利要求1所述豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法，其特征是所述其中D≥0.68以上，品种抗盐性高，0.48＜D＜0.68，则表示该品种抗盐性中等；D≤0.48，该品种抗盐性差。
全文摘要
本发明公开了一种豇豆基因型耐盐能力的技术鉴定方法，它是对培养的豇豆幼苗进行盐胁迫处理后，取其复叶叶片对幼苗叶片的株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT活性指标的测定，利用D＝-0.40+0.42X3+0.11X8+0.29X11+0.31X14+0.22X17计算出耐盐综合评价值D，从而得到豇豆基因型耐盐能力；其中X3、X8、X11、X14、X17分别代表株重、叶绿素、可溶性蛋白质含量、伤害率和CAT的SRI值，SRI＝(盐胁迫处理下性状表型值/自然条件下性状表型值)×100％。本方法系统性、综合性强。方法操作简便，适应性广，可资其他植物耐盐能力鉴定借鉴。能判别未知豇豆基因型的耐盐性。预测豇豆种质耐盐能力的准确性高。
文档编号G01N33/00GK101320029SQ20081004842
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月17日 优先权日2008年7月17日
发明者陈禅友, 海 彭, 曾长立, 张凤银 申请人:江汉大学