专利名称：双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析方法
技术领域：
本发明涉及双膦酸盐类药物(包括阿伦膦酸钠、依替膦酸钠、利塞膦酸钠、 唑来膦酸等)的分析方法，特别涉及采用梯度淋洗分离、抑制电导检测器进行 检测的双膦酸盐药物的离子色谱分析方法。
背景技术：
双膦酸盐类药物是八十年代研究开发出的新型骨吸收抑制剂，目前已成功地 用于骨钙代谢疾病和一些骨相关疾病的治疗。双磷酸盐类药物含量测定方法常 用酸碱电位滴定法、钼黄或钼蓝比色法、电感耦合等离子体法，但是这些方法 不能用来测定药物中阴离子杂质；双膦酸盐类药物是一种沸点高的物质，运用 气相色谱分析时，需要对其进行衍生化；又由于该类药物分子结构中无生色团， 需经衍生后采用紫外检测器、荧光检测器检测等，操作十分烦琐。发明内容木发明针对现有技术、方法存在的不足，提供一种双膦酸盐类药物及其杂 质阴离子的离子色谱分离分析方法，此种方法既能保证分析效果，使双膦酸盐 药物与杂质阴离子分离，又能简化工艺流程，不需衍生就可进行测定。 本发明的技术方案是 一种双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分 析方法，包括以下步骤(1) 基线测绘将洗脱液用泵输送入色谱分离柱使其达到平衡，从色谱分离柱 输出的洗脱液经过抑制器后流入电导流通池，由电导检测器转化为电信 号，从而形成基线被测绘。(2) 进样和离子交换含有双膦酸盐类药物的被测试样在KOH洗脱液的推动下进入色谱分离柱产生离子交换，带负电荷的双膦酸盐类药物置换下色谱分 离柱上的氢氧根离子并保留在色谱分离柱上。4(3) 洗脱将洗脱液连续输送入色谱分离柱不断将双膦酸盐类药物和杂质阴离 子在色谱分离柱上展开，各种杂质阴离子和双膦酸盐类药物离子产生差速 迁移而相互分离，在不同的保留时间被洗脱。(4) 抑制电导检测分析从色谱分离柱输出的含双膦酸根离子的溶液通过抑制 器后，洗脱液KOH已被转变成电离很小的水，因此其电导值也很小，而样 品阴离子则变成其相对应的酸；样品流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号，从而形成谱图被记录。本发明具有以下有益效果1、 对4种常用双膦酸盐类药物和在生产过程中所带入的阴离子杂质能进行 良好的分离、分析，.保留时间、峰高、峰面积的相对标准偏差均小于5%，检测 限可达10—fig/L，在0.2 50mg/L浓度范围内，峰高对浓度、峰面积对浓度乘良 好的线性关系，相关系数在0. 9995以上。2、 分析时，将试样直接注入色谱分离柱并经抑制电导检测器就能获得谱图， 去除现有分析方法中的柱前或柱后衍生步骤，使工艺流程大为简化。3、 本方法可用于双膦酸盐类药物中杂质阴离子的检测，也可检测血浆中双 膦酸盐类药物，为双膦酸盐类药物的测定提供了有效的分析手段，扩大了本方 法的应用范围。
'图1是根据本发明提供的方法获得的阿伦膦酸钠与5种常见阴离子的标准离子色谱图，图中，i为r(o. i)， 2为cr(o. 1) ， 3为MV(O. l)， 4为S042—(0. 1)， 5为PO,(O. 1)， 6为阿伦膦酸钠(10.0);图2是根据本发明提供的方法获得的血浆样品中依替膦酸钠的色谱图，图 中，l为依替膦酸钠；图3是根据本发明提供的方法获得的生理盐水基质中利塞膦酸钠的样品色 谱图，图中，1为利塞膦酸钠(10.0);图4是根据本发明提供的方法获得的葡萄糖基质中唑来膦酸的样品色谱图， 图中，1为唑来膦酸(20.0mg/L)。
具体实施方式
双膦酸盐药物在水中可以电离产生有电导响应的阴离子，运用阴离子柱分 离、抑制电导检测器进行检测。工艺步骤依次包括基线测绘、进样和离子交换、 洗脱、抑制电导检测分析。1、 基线测绘将洗脱液用泵输送入色谱分离柱使其达到平衡，从色谱分离柱输出的洗脱液 经过抑制器后流入电导流通池，由电导检测器转化为电信号，从而形成基线被测绘。2、 进样和离子交换含有双膦酸盐类药物的被测试样在K0H洗脱液的推动下进入色谱分离柱产 生离子交换，带负电荷的双膦酸盐类药物置换下色谱分离柱上的氢氧根离子并 保留在色谱分离柱上。3、 洗脱将洗脱液连续输送入色谱分离柱不断将双膦酸盐类药物和杂质阴离子在色 谱分离柱上展开，各种杂质阴离子和双膦酸盐类药物离子产生差速迁移而相互 分离，在不同的保留时间被洗脱。4、 抑制电导检测分析 从色谱分离柱输出的含双膦酸根离子的溶液通过抑制器后，洗脱液K0H已被转变成电离很小的水，因此其电导值也很小，而样品阴离子则变成其相对应的 酸；样品流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号，从而形成谱图被记录。 根据不同双膦酸盐类药物在阴离子柱中保留强度不同，采用K0H溶液作为洗 脱液并采用不同的梯度淋洗方案。① 、分析阿伦膦酸钠药片中阿伦膦酸钠药物及杂质离子时，梯度淋洗方案 是0 2min时，浓度选用1 mmol/L的氢氧化钾；2 12 min时，浓度选用 lmmol/L 18 mmol/L的氢氧化钾；12. 01 17. OOmin，采用浓度为1 mmol/L的 氢氧化钾。② 、分析小白兔血浆中依替膦酸钠药物含量时，梯度淋洗方案是0 2min 时，浓度选用3 mmol/L的氢氧化钾；2 12 min时，浓度选用lmmol/L 30ramol/L 的氢氧化钾；12.01 17.00min，采用浓度为3 ramol/L的氢氧化钾。③ 、分析生理盐水基质中利塞膦酸钠药物及杂质离子时，梯度淋洗方案是 0 3min时，浓度选用20mmol/L的氢氧化钾；3. 01 8. 00min时，浓度选用 45,ol/L; 8.01 15.00min，采用浓度为20mmol/L的氢氧化钾。④ 、分析葡萄糖基质中唑来膦酸及杂质离子时，梯度淋洗方案是0 3min时，浓度选用20mmol/L的氢氧化钾；3. 01 8. OOmin时，浓度选用45mmol/L的 氢氧化钾；8. 01 15. OOmin，采用浓度为20mmol/L的氢氧化钾。分析上述4种双膦酸盐类药物和杂质阴离子时，分离柱是美国Dionex IonPac ASll，尺寸为250 mmX2 mm;保护柱是IonPac AGll，尺寸为50 mmX2 mm;进样量为25 u L;淋洗液发生器为EG50;电导检测器为DS6; 但在分析阿伦膦酸钠药物、依替膦酸钠药物药物时所用的抑制器为Dionex AAES 自再生抑制器；分析利塞膦酸钠药物、唑来膦酸时所用的抑制器为Dionex ASRS-ULTRA自再生抑制器下面根据附图和具体实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得 更加明显。实施例1:本实施例是对阿伦膦酸钠药片中阿伦膦酸钠和5种常见阴离子进行分析 使用的仪器Dionex ICS 2000离子色谱仪(美国Dionex公司)；EG50淋 洗液发生器；DS6电导检测器；Chromeleon 6.5色谱工作站；IonPac AGll保 护柱(50 mmX2 mm); IonPac ASll分离柱(250 mmX2 mm); 25 y L进样量。 抑制器Dionex AAES自再生抑制器；洗脱液K0H溶液，采用梯度淋洗。0 2min时，浓度选用1 mmol/L的氢 氧化钾；2 12min时，浓度选用lmmol/L 18 mmol/L; 12. 01 17. OOmin，采用浓度为1 mmol/L的氢氧化钾。 分析步骤① 、基线测绘将洗脱液用泵输送入色谱分离柱使其达到平衡，从色谱分离柱输出的洗脱 液进抑制器后，流入电导流通池时由电导检测器转化为电信号，从而形成基线被测绘。② 、谱图测绘含有双膦酸盐类药物的被测试样在洗脱液的推动下进入色谱分离柱产生离 子交换，带负电荷的双膦酸盐类药物置换下色谱分离柱上的氢氧根离子并保留 在色谱分离柱上。将洗脱液连续输送入色谱分离柱不断将双膦酸盐类药物和杂质阴离子在色 谱分离柱上展开，各种杂质阴离子和双膦酸盐类药物离子产生差速迁移而相互 分离，在不同的保留时间被洗脱；从色谱分离柱输出的含双膦酸根离子的溶液 通过抑制器后，洗脱液KOH已被转变成电离很小的水，因此其电导值也很小，而样品阴离子则变成其相对应的酸；样品溶液流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号，从而形成谱图被测绘。所测绘的谱图见图l。分析结果药片中F—的含量为0. 155 mg/g; Cl—的含量为0.222 mg/g; N(V 的含量为0. 0585 mg/g; SO/—的含量为0. 277 mg/g; P043—的含量为0. 0195mg/g;阿伦膦酸钠的含量为55. i mg/g;阿伦膦酸钠与r、 cr、 NCV、 SO广、P043—的加标回收率在87。％到104%之间。 实施例2:本实施例是对小白兔血浆中依替膦酸钠含量进行分析。使用的仪器与实施例l相同。 抑制器同实施例l相同。洗脱液K0H溶液。梯度淋洗方案是0 2min时，浓度选用3 mraol/L的 氢氧化钾；2 12 min时，浓度选用lmmol/L 30mmol/L的氢氧化钾；12.01 17,00min，采用浓度为3訓ol/L的氢氧化钾。分析步骤同实施例1。所测绘的谱图见图2。分析结果是小白兔服药1小时后采集的血浆样品中依替膦酸钠的含量为5. 0 PgM实施例3:本实施例是对利塞膦酸钠在生理盐水中的含量进行分析。使用的仪器与实施例l相同。抑制器Dionex ASRS-ULTRA自再生抑制器。洗脱液KOH溶液。梯度淋洗方案是0 3min时，浓度选用20證ol/L的 氢氧化钾；3.01 8. OOmin时，浓度选用45mmol/L; 8. 01 15. OOmin，采用浓 度为20咖ol/L的氢氧化钾。分析步骤同实施例1。所测绘的谱图见图3。 分析结果如下生理盐水基质对利塞膦酸钠的测定没有产生干扰，样品色谱峰 峰形很好；利塞膦酸钠回收率平均值为106.4% 实施例4:本实施例是在葡萄糖溶液介质中对唑来膦酸的含量进行分析。使用的仪器与实施例l相同。 抑制器与实施例3相同。洗脱液KOH溶液。梯度淋洗方案是0 3min时，浓度选用20mmol/L的 氢氧化钾；3. 01 8. OOrain时，浓度选用45mmol/L的氢氧化钾；8. 01 15. OOmin，采用浓度为20mmol/L的氢氧化钾。分析步骤同实施例l。所测绘的谱图见图4。分析结果如下葡萄糖基质对唑来膦酸的测定没有产生干扰，样品色谱峰峰形很好；唑来膦酸回收率平均值为97. 07%。上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的 精祌和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发 明的保护范围。
权利要求
1.一种双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析方法，其特征在于，包括以下步骤(1)基线测绘将洗脱液用泵输送入色谱分离柱使其达到平衡，从色谱分离柱输出的洗脱液经过抑制器后流入电导流通池，由电导检测器转化为电信号，从而形成基线被测绘。(2)进样和离子交换含有双膦酸盐类药物的被测试样在KOH洗脱液的推动下进入色谱分离柱产生离子交换，带负电荷的双膦酸盐类药物置换下色谱分离柱上的氢氧根离子并保留在色谱分离柱上。(3)洗脱将洗脱液连续输送入色谱分离柱不断将双膦酸盐类药物和杂质阴离子在色谱分离柱上展开，各种杂质阴离子和双膦酸盐类药物离子产生差速迁移而相互分离，在不同的保留时间被洗脱。(4)抑制电导检测分析从色谱分离柱输出的含双膦酸根离子的溶液通过抑制器后，洗脱液KOH已被转变成电离很小的水，因此其电导值也很小，而样品阴离子则变成其相对应的酸；样品流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号，从而形成谱图被记录。
2. 根据权利要求1所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析 方法，其特征在于，所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子为阿伦膦酸钠药片 中阿伦膦酸钠药物及杂质离子、血浆中依替膦酸钠药物及杂质离子、生理盐水 棊质中利塞膦酸钠药物及杂质离子或葡萄糖基质中唑来膦酸及杂质离子。
3. 根据权利要求2所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析 方法，其特征在于，所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子为阿伦膦酸钠药片 中阿伦膦酸钠药物及杂质离子，洗脱液为K0H溶液，采用梯度淋洗。0 2min时， 浓度选用1 mmol/L的氢氧化钾；2 12 min时，浓度选用l咖ol/L 18 mmol/L; 12. 01 17. 00min，采用浓度为1 mmol/L的氢氧化钾。
4. 根据权利要求2所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析 方法，其特征在于，所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子为血浆中依替膦酸 钠药物及杂质离子，洗脱液为KOH溶液，采用梯度淋洗。0 2min时，浓度选 用3 mmol/L的氢氧化钾；2 12 min时，浓度选用lmmol/L 30mmol/L; 12.01 17.00min时，采用浓度为3 mmol/L的氢氧化钾。
5. 根据权利要求2所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析方法，其特征在于，所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子为生理盐水基质中利塞膦酸钠药物及杂质离子，洗脱液为KOH溶液，采用梯度淋洗。0 3min时， 浓度选用20mmol/L的氢氧化钾；3.01 8.00min时，浓度选用45mmol/L; 8.01 15.00min时，采用浓度为20mmol/L的氢氧化钾。
6. 根据权利要求2所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析 方法，其特征在于，所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子为葡萄糖基质中唑 来膦酸及杂质离子，洗脱液为KOH溶液，采用梯度淋洗。0 3min时，浓度选 用20mmol/L的氢氧化钾；3.01 8.00min时，浓度选用45mmol/L; 8.01 15.00min 时，采用浓度为20mmol/L的氢氧化钾。
7. 根据权利要求1所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析 方法，其特征在于，分离柱是IonPac ASll，尺寸为250 mmX2 mm;保护柱是 IonPac AGll，尺寸为50 mmX2 mm;进样量为25 P L;淋洗液发生器为EG50; 电导检测器为DS6。
8、 根据权利要求3或4所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离 分析方法，其特征在于，所用的抑制器为Dionex AAES自再生抑制器。
9、 根据权利要求5或6所述的双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离 分析方法，其特征在于，所用的抑制器为Dionex ASRS-ULTRA自再生抑制器。
全文摘要
本发明公开了一种双膦酸盐类药物及其杂质阴离子的离子色谱分离分析方法，该方法由基线测绘、进样和离子交换、洗脱和抑制电导检测分析这几个步骤组成；该方法可应用到双膦酸盐类药片、血浆、生理盐水基质和葡萄糖基质中的双膦酸盐的含量测定和阴离子杂质的含量测定。
文档编号G01N30/00GK101251520SQ20081006001
公开日2008年8月27日 申请日期2008年2月29日 优先权日2008年2月29日
发明者张培敏, 岩 朱, 霞 焦 申请人:浙江大学