专利名称：：一种肾结石大鼠模型构建方法及实验方法
技术领域：
：本发明涉及一种肾结石大鼠模型构建方法，以及利用该肾结石大鼠模型进行肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法。(二)
背景技术：
肾结石是泌尿外科常见病、多发病，发病率高，且随着生活水平的提高，其发病率呈上升趋势。因此肾结石的发生机制和防治研究一直是泌尿外科医师关注的问题。近年来国际上的研究发现Tamm-Horsfall蛋白(Tamm-Horsfallprotein,THP)可能是一种抑制尿路结石形成的大分子有机物。但是THP抑制结石形成的机制及其所起的作用，不同的研究结果不同，仍存在争议。虽然国外有研究者报道了肾结石大鼠肾脏组织THP表达的研究结果，但还没有治疗因素干预下肾结石大鼠肾脏组织THP表达的研究报道。枸橼酸是研究最早最充分的结石抑制因子之一，但其确切的防石机制，与其他大分子抑制因子之间的关系还有待于进一步研究。因此，研究枸橼酸钾干预下肾结石大鼠肾组织内THP的表达，了解枸橼酸钾干预对肾组织THP表达的影响，进一步探讨枸橼酸钾抑制结石形成的机制，及枸橼酸钾与THP之间的相互关系，这不仅为解析肾结石发病机理提供实验依据，对临床寻求肾结石的防治途径也具有一定的指导意义。(三)
发明内容本发明目的是提供一种肾结石大鼠模型构建方法，以及利用该肾结石大鼠模型进行肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法。本发明采用的技术方案是一种肾结石大鼠模型构建方法，所述方法包括以含乙二醇0.5%和氯化铵0.5%的混合溶液为致石剂，用致石剂替代饮用水喂养SD大鼠至少2周，获得肾结石大鼠模型。一种肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法，所述方法包括选用雄性SD大鼠，饲养一周后，以含乙二醇0.5%和氯化铵0.5%的混合溶液为致石剂替代饮用水喂养SD大鼠2周，处死大鼠，解剖取肾脏，进行大鼠肾脏组织THP表达研究。具体的，所述方法分对照组、肾结石组、肾结石枸橼酸干预组进行，选用雄性SD大鼠，铜养一周后，分组喂养2周进行造模对照组以饮用水喂养，肾结石组以致石剂替代饮用水喂养，肾结石枸橼酸干预组以致石剂替代饮用水喂养、并用25%枸橼酸钾溶液以lmL/100g体重每天灌胃一次，2周后处死大鼠，解剖取肾脏，观察肾脏表面形态，再剖开肾脏，取肾组织用10%甲醛固定，于显微镜下观察。为使3组大鼠实验条件保持一致，在造模过程中，对照组和肾结石组除以饮用水或致石剂喂养外，同时用饮用水以lmL/100g体重每天灌胃一次。尿液中存在的与肾结石形成有关的物质，大致可以分为两类，一类是促进结石形成的物质，包括草酸、尿酸、4丐离子等成分；另一类是抑制结石形成的物质，如枸橼酸、镁离子及一些有机大分子物如骨桥蛋白等，这两类物质比例失衡被认为是引起肾结石形成的主要原因。乙二醇是草酸的前体，进人体内后转化成羟乙酸，后者经过一系列的酶促反应最终转化为草酸，经肾脏排泄，使得尿草酸浓度升高，从而促进结石形成。氯化铵可以减低尿pH值，有利于草酸4丐结晶结石形成。枸橼酸是尿液中作用最强的内源性结石抑制物之一，流行病学研究证实肾结石患者低枸橼酸尿发生率达到61%,而低枸橼酸尿是肾结石发病和复发的独立危险因素，研究表明枸橼酸可络合钙离子形成可溶性钙复合物，可直接抑制尿液中晶体的成核、生长和聚集，还可通过4^高尿液pH值，纠正尿液过度酸化，降低成石离子的饱和度，而抑制肾结石形成。因此临床上用枸橼酸钾治疗肾小管酸中毒、低枸橼酸性草酸钙结石及尿酸性结石。关于枸橼酸钾防治肾结石的机制，一般认为当口服枸橼酸钾后，胃肠道吸收的枸橼酸增加，血枸橼酸浓度上升，从而经肾小球滤过的枸橼酸增加，同时抑制肾小管重吸收，最终尿液中的枸橼酸浓度相应增加，从而抑制结石形成。THP是尿液中含量最多的蛋白之一，属于糖基磷脂酰肌醇锚定家族成员，由糖基磷脂酰肌醇锚定在肾小管亨氏攀升支粗段及远曲小管近端的尿路上皮细胞膜上，通过磷酸脂酶C分解释放入小管液，其膜固定型分子量约120kD,自由(尿)型单体分子量约85kDa,结构上，THP的70。/。由肽链组成，30%是糖基。有报道认为THP能阻止大肠杆菌1型黏附于尿路上皮分化特异糖蛋白(Uroplakins)的Ia和Ib受体，可能起阻滞上尿路的感染的作用。通过免疫化学方法在草酸钙结晶体外形成试验的草酸钙有机质中，及乙二醇诱导的大鼠肾模型试验草酸钙结晶中均发现有THP的存在，而在乙二醇诱导的草酸4丐尿路结石大鼠模型的肾组织及尿液中THP表达量均减少，因此THP被认为是尿路中结石形成的重要抑制因子。另外有报道发现，与分离自正常人的THP相比，从反复发生草酸钙结石的患者尿液中分离的THP,更大程度上倾向于自我聚集，而抑制草酸钙结晶、聚合的作用则相对较差。在妊娠及某些病理状态下，THP的糖基部分发生了改变，但还不清楚在草酸钙尿路结石中是否也存在着这种改变。因此除了提高肾组织中THP的表达量外，枸橼酸的干预也可能使得由于结石而结构异常的THP结构重新改变，使其自我聚集倾向减弱，而抑制草酸4丐结晶成核、生长、聚集的作用加强。这些只是一种假设，还有待进一步的研究"i正实。本发明的有益效果主要体现在以含乙二醇0.5%和氯化铵0.5%的混合溶液为致石剂，效果明显可靠，且作用强烈，得到肾结石大鼠模型用于后续实—睑研究或药物筛选，观察明显、方法筒单。(四)图1为三组大鼠肾脏表面结石形成比较；图2为三组大鼠肾剖面结石形成比较(解剖显微镜下观察)；图3为三组大鼠肾组织THP表达的免疫组化染色图(400x);图4为三组大鼠肾脏成石程度与THP表达强度对照图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:一、材料1.主要试剂含0.5%(w/w)乙二醇和0.5%(w/w)氯化铵的混合溶液；25%(w/w)的枸橼酸钾溶液；10%(w/w)曱醛；SANTACRUZ公司兔抗人THP蛋白291425序列氨基酸多克隆抗体及羊抗兔ABC染色系统试剂盒。2.动物选择20只雄性SD大鼠，体重约350g,邵逸夫医院动物实验室祠养。二、方法1、动物和组织准备选择20只雄性SD大鼠(由浙江大学附属邵逸夫医院动物实验室提供)，体重约350g左右，以含有0.5%乙二醇和0.5%氯化铵的混合溶液为致石剂。先将大鼠正常条件下饲养一周，使其充分适应环境后，随机分成3组对照组4只喂普通净化々欠用水；结石组8只，以致石剂代替々大用水；枸橼酸钾干预组8只，除以致石剂代替饮用水外，同时用25Q/。枸橼酸钾溶液以lml/100g体重每天灌胃一次。为使三组大鼠实验条件保持一致，结石组和对照组用净化水以lml/100g体重每天灌胃一次。喂养两周后处死大鼠，解剖取肾脏，肉眼下观察肾脏表面形态，再沿肾门长轴剖开，部分肾组织用10%曱醛固定、于解剖显微镜下观察肾剖面结石形成情况。2、肾结石形成观察先肉眼观察肾脏表面，再将剖开的肾脏置于解剖显微镜下，观察肾剖面结晶结石的形成情况。以肾脏表面和剖面有无明显结晶沉淀物、游离结石作为判断有无结石形成的标准。并根据结晶结石形成的量及肾脏损伤的程度分为四级(具体分级标准见表l)。表l:大鼠肾结石形成分级标准表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>++肾剖面可见结晶沉淀物，有时可见小的游离结石；肾脏外形无明显变化或稍肿胀，表面可有钓化斑。+++肾剖面皮质、髓质嵌有大量的结晶，并有游离结石形成；肾脏外形明显肺胀，表面可见大量4丐化斑，可融合。3、免疫组织化学染色使用SANTACRUZ公司兔抗人THP蛋白291-425序列氨基酸多克隆抗体及羊抗兔ABC染色系统试剂盒。先将曱醛固定的肾脏组织脱水浸蜡包埋，3um厚切片，再脱蜡水化后，1。/。H202-PBS溶液封闭内生过氧化物酶，枸橼酸盐修复抗原，1.5%血清阻断1小时，THP—抗(浓度2ug/ml)室温下孵育30分钟，生物素化羊抗兔二抗中孵育30分钟，卵白素和生物素化辣根过氧化物酶中孵育30分钟，DAB显色5分钟，再苏木素复染，乙醇二曱苯脱水透明，中性树脂封片。同时设立阴性对照组，以PBS代替THP—抗。最后于光学显微镜下观察，按"+++"表示明显染色(深棕黄色)，"++"表示中度染色(黄色)，"+"表示轻度染色(浅黄色)对切片染色程度进行分级，并统计分析。4、数据处理所有数据均使用SPSS13.0forwindows专业统计软件，采用Kruskal-Walls非参数检验对三组大鼠肾脏成石程度和THP表达强度进行统计分析，采用Mann-Whitney非参数检验对三组大鼠肾脏成石程度和THP表达强度进行两两比较。三、结果1、结石形成肉眼观察可见对照组大鼠肾脏外形无明显异常，质软，未见钩化斑(如图la);结石组大鼠肾脏明显肿胀、质地变硬，肾表面可见大量浅黄色钓化斑，部分融合(见图lb);枸橼g吏钾干预组大鼠肾脏稍肺胀，表面亦可见浅黄色钙化斑，但融合不明显(见图lc)。解剖显微镜下观察，对照组大鼠肾剖面皮质、髓质均无可见的结晶结石沉淀物(见图2a);结石组大鼠肾剖面皮质、髓质嵌有大量的结晶，并可见游离结石形成图(见图2b);枸橼酸干预组大鼠肾剖面皮质、髓质可见少量结晶沉淀，未见游离结石形成(见图2c),cl结晶形成较少(+)，c2结晶形成较多(++)。按上述成石分级标准对三组大鼠进行成石程度分级如表2。采用Kruskal-Walls检验对三组大鼠肾脏成石情况进行统计学分析，三组大鼠之间成石程度存在显著差异(PO.01),采用Mann-Whitney检验对三组大鼠肾脏成石程度进行两两比较，发现对照组与结石组之间、对照组与枸橼酸钾干预组之间及结石组与枸橼酸钾干预组之间均有显著差异(见表2)。表2、三组大鼠肾脏成石程度分级表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、肾组织THP表达强度三组大鼠肾脏组织THP免疫组化染色均显示THP定位于肾小管亨氏攀和远曲小管，但是在相同稀释度的一抗和相同的实验条件下，三组大鼠肾脏组织免疫组化染色强度差别很大，即肾组织内的THP表达强度差别很大。对照组染色很深，而结石组染色很浅，枸橼酸钾干预组则介于两者之间(见图3):a、对照组肾组织THP表达最强，免疫组化染色最深；b、结石组肾组织THP表达最弱，免疫组化染色最浅；c、枸橼酸钾干预组肾组织THP表达介于两者之间；d、阴性对照未见任何组织染色阳性。按上述标准，对三组大鼠THP表达强度进行分级(见表3),采用Kruskal-Walls检验对三组大鼠肾组织THP表达强度进行分析，结果显示三组大鼠之间肾组织THP表达强度存在显著差异CP<0.01),采用Mann-Whitney检验对三组大鼠肾组织THP表达强度进行两两比较，发现对照组与结石组之间、对照组与枸橼酸钾干预组之间及结石组与枸橼酸钾干预组之间均有显著差异(见表3)。表3、三组大鼠肾组织免疫组化染色示THP表达强度表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与对照组比丰支i5〈0.05、PO.01;与结石组比较#P<0.053、肾脏成石程度与THP表达强度的关系在结石形成强度为"+++"的结石组大鼠肾组织中111表达明显减弱为"+";而对照组大鼠及一只结石为"+"的枸橼酸钾干预大鼠，其THP表达则均成强阳性"+++"。将每只大鼠的成石程度与THP表达强度相对应，可以发现肾脏内结石形成越明显，则肾组织内THP表达越弱，反之肾脏内结石形成越少，则肾组织内THP表达越强(见图4)。四、结论实验结果表明，给予0.5%乙二醇和0.5%氯化铵的混合溶液两周后，6只(75%)结石组大鼠的肾脏内有明显的结石形成，其成石程度为"十++",另2只(25%)则有"++"的结石形成，说明以0.5%乙二醇和0.5%氯化铵的混合溶液为致石剂，效果明显可靠，且作用强烈。实验中枸橼酸钾干预组大鼠用25%枸橼酸钾以lml/100g的量每天灌胃一次，2周以后尽管仍1只(12.5%)大鼠有明显的结石形成，但7只(87.5%)大鼠的结石形成减少，其中4只(50%)明显减少为"+",这说明枸橼酸钾确实是抑制肾结石形成的有效物质。本发明结果表明正常的大鼠肾脏表达THP,并主要定位于肾小管亨氏攀及远曲小管，没有观察到在肾小球、间质组织或肾小管近曲小管的局限定位，在肾结石组大鼠肾组织中，虽然有THP表达，但其表达强度明显减弱，这与文献一致。本实验中使用枸橼酸钾干预后，8只干预组大鼠除1只(12.5%)大鼠THP表达量仍很弱外，另外7只大鼠(87.5%)的THP表达量都得到不同程度的恢复，其中2只(25%)THP表达量与正常大鼠相似。将每只大鼠的成石程度与THP表达强度相对应，可以发现在成石程度为"+++"的结石组大鼠肾组织中THP表达明显减弱；而对照组大鼠及一只成石程度为"+"的枸橼酸钾干预大鼠，其THP表达则成强阳性。从图4中，可以更明显地发现肾脏内结石形成越明显，则肾组织内THP表达越弱，肾脏内结石形成越少，则肾组织内THP表达越强。有研究发现与其他糖基磷脂酰肌醇锚定家族成员一样，THP可自我聚集成较大的复合物，但聚集的程度高度依赖于外界的pH值及离子浓度，低pH或高离子强度时趋向于自我聚集，并可能促进草酸钙结晶的聚集，高pH或低离子强度时则相反，而在枸橼酸的存在下，THP自我聚集的倾向明显减弱，尿液中结晶的成核、生长、聚集速度均被抑制。因此设想枸橼S臾抑制尿路结石形成的机制，除了络合钙离子形成可溶性钙复合物，抑制尿液中晶体的成核和聚集，提高尿液pH值外，其有可能通过恢复由于结石形成而受抑制的THP的表达量，而表达量得到恢复的THP则抑制了尿液中结晶的成核、生长、聚集。另外在枸橼酸的存在下，THP自聚集减少，两者的相互作用也可能使得尿路中结晶的成核、生长、聚集的速度得到进一步抑制。权利要求1.一种肾结石大鼠模型构建方法，所述方法包括以含乙二醇0.5％和氯化铵0.5％的混合溶液为致石剂，用致石剂替代饮用水喂养SD大鼠至少2周，获得肾结石大鼠模型。2.—种肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法，其特征在于所述方法包括选用雄性SD大鼠，詞养一周后，以含乙二醇0.5%和氯化铵0.5%的混合溶液为致石剂替代饮用水喂养SD大鼠2周，处死大鼠，解剖取肾脏，进行大鼠肾脏组织THP表达研究。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法分对照组、肾结石组、肾结石枸橼酸干预组进行，选用雄性SD大鼠，飼养一周后，分组喂养2周进行造模对照组以饮用水喂养，肾结石组以致石剂替代饮用水喂养，肾结石枸橼酸干预组以致石剂替代饮用水喂养、并用25%枸橼酸钾溶液以lmL/100g体重每天灌胃一次，2周后处死大鼠，解剖取肾脏，观察肾脏表面形态，再剖开肾脏，取肾组织用10%曱醛固定，于显微镜下观察。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于造才莫过程中，对照组和肾结石组同时用饮用水以lmL/100g体重每天灌胃一次。全文摘要本发明提供了一种肾结石大鼠模型构建方法，以及利用该肾结石大鼠模型进行肾结石大鼠肾脏组织THP表达研究的实验方法。所述肾结石大鼠模型构建方法包括以含乙二醇0.5％和氯化铵0.5％的混合溶液为致石剂，用致石剂替代饮用水喂养SD大鼠至少2周，获得肾结石大鼠模型。本发明以含乙二醇0.5％和氯化铵0.5％的混合溶液为致石剂，效果明显可靠，且作用强烈，得到肾结石大鼠模型用于后续实验研究或药物筛选，观察明显、方法简单。文档编号G01N33/48GK101313870SQ20081006222公开日2008年12月3日申请日期2008年6月16日优先权日2008年6月16日发明者李新德,许力为申请人:浙江大学