专利名称：一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法
技术领域：
本发明涉及一种用于鉴定白粉病病原菌的染色方法。
技术背景甜瓜白粉病是一种广泛发生的世界性病害，主要是由Sp^^ra^e^ /w/^/wefl(Schltdl.:Fr.)Pollacci.侵染引起的一种潜育期短、再侵染频繁、流行性 强的叶斑病。病菌侵染先是在叶片表面产生分散的褪绿斑点，在褪绿斑点上很 快长出成堆的白粉状霉层，然后霉层相连，使受侵叶片完全被白粉状霉层所覆 盖。这不但降低植株的光合效能和增加植株蒸腾效能，同时可使叶片变脆硬， 使植株提早萎黄枯干、早衰死亡，进而使植株产量和果实品质下降。该菌为典 型的专性寄生菌，不能进行离体组织培养，需要活体培养才能保存菌体的活力。 所以鉴定甜瓜白粉病病原菌必须在它的寄生组织中进行观察，一般采用染色的 方法来观察甜瓜白粉病病原菌，而现有染色的方法存在染色时间长、染色后效 果不明显的缺陷。发明内容本发明是为了解决现有用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法存在染色 时间长、染色后效果不明显的缺陷，而提供一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的 染色方法。本发明用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按如下步骤进行 一、将待 检测的甜瓜叶片浸泡在质量浓度为0.15%的脱色液中，在70。C的条件下保温 30min，将叶片从脱色液中取出并用水冲洗1~5次，得到脱色叶片；二、将步 骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡5 30min，再将叶片从染色液中取出并 用水冲洗1 5次，以水为浮载剂，并在光学显微镜下将叶面朝上观察染色后的 叶片；即能够鉴别甜瓜叶片是否感染甜瓜白粉病；其中步骤一中的脱色液为三 氯乙醇和三氯甲烷按照体积比为3 : 1的比例混合的溶液；步骤二中的染色液 由质量浓度为0.15%的三氯乙酸水溶液和质量浓度为0.6。/。的考马斯亮蓝R-250 甲醇溶液按照体积比为1 : 1的比例混合组成。本发明具有以下优点1、操作简便、快速，现有染色方法染色的时间长 达24小时，而本发明从脱色到染色的时间不超过1小时；2、染色效果明显， 在光学显微镜下观察染色后的叶片组织；3、本发明的染色方法不破坏菌体结 构，观察更清晰和客观。
图1为具体实施方式
十染色后观察感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织的照 片；图2为现有方法染色的感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织的照片；图3为具 体实施方式十一染色后观察感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织的照片；图4为现 有方法染色的感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织的照片；图5为具体实施方式
十 二染色后观察感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织的照片；图6为现有方法染色的 感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织的照片；图7为具体实施方式
十三染色后观察 未感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织的照片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按如 下步骤进行 一、将待检测的甜瓜叶片浸泡在质量浓度为0.15%的脱色液中， 在70'C的条件下保温30min,将叶片从脱色液中取出并用水冲洗1 5次，得到 脱色叶片；二、将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡5 30min，再将叶 片从染色液中取出并用水冲洗1 5次，以水为浮载剂，并在光学显微镜下将叶 面朝上观察染色后的叶片；即能够鉴别甜瓜叶片是否感染甜瓜白粉病；其中步 骤一中的脱色液为三氯乙醇和三氯甲烷按照体积比为3 : 1的比例混合的溶 液；步骤二中的染色液由质量浓度为0.15%的三氯乙酸水溶液和质量浓度为 0.6。/。的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液按照体积比为1 : 1的比例混合组成。本实施方式中考马斯亮蓝R-250甲醇溶液是将考马斯亮蓝R-250溶解到纯 度为99%以上的甲醇所形成的溶液。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤一中将将叶片从脱色液中取出并用水冲洗2 4次。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤一中将将叶片从脱色液中取出并用水冲洗3次。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤二中将 步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡10 25min。其它与具体实施方式
一 相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤二中将 步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡15 20min。其它与具体实施方式
一 相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤二中将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡18min。其它与具体实施方式
一相 同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤二中将 叶片从染色液中取出并用水冲洗2 4次。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤二中将 叶片从染色液中取出并用水冲洗3次。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一的不同点为步骤二中将 叶片从染色液中取出并用水冲洗后，放入贮存液中贮存；其中贮存液为冰乙酸、 甘油和水按照体积比为5:20:75的比例混合而成的。其它与具体实施方式
一相 同。本实施方式中的贮存是针对染色后不能立即进行检测的叶片需要放入贮 存液中进行贮存，染色后能够立即检测的叶片不需要放入贮存液中进行贮存。
具体实施方式
十本实施方式用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按如下步骤进行 一、将接种甜瓜白粉病菌的甜瓜叶片浸泡在质量浓度为0.15%的脱色液中，在7(TC的条件下保温30min，将叶片从脱色液中取出并用水冲洗2 次，得到脱色叶片；二、将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡30min， 再将叶片从染色液中取出并用水冲洗3次，以水为浮载剂，并在光学显微镜下 将叶面朝上观察染色后的叶片；即观察出感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织中的 甜瓜白粉病菌；其中步骤一中的脱色液为三氯乙醇和三氯甲烷按照体积比为3 :1的比例混合的溶液；步骤二中的染色液由质量浓度为0.15%的三氯乙酸水 溶液和质量浓度为0.6%的考马斯亮蓝11-250甲醇溶液按照体积比为1 : 1的比5例混合组成。本实施方式中考马斯亮蓝R-250甲醇溶液是将考马斯亮蓝R-250溶解到纯 度为99%以上的甲醇所形成的溶液。将同一叶片分成两部分， 一部分采用本实施方式的方法进行染色，另一部 分采用现有方法(采用苯胺蓝染色24小时)进行染色；将本实施方式染色后 的叶片放在光学显微镜下观察，观察到的叶片组织的照片如图l所示，从图l 可以看出，本实施方式的方法可以清楚的观察到甜瓜白粉病菌的病原菌孢子及 萌发的芽管。而采用现有方法染色的叶片放在光学显微镜下观察的结果如图2 所示，从图2与图1的对比可以看出本实施方式的方法染色效果明显优于现有 方法。
具体实施方式
十一本实施方式用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按 如下步骤进行 一、将接种甜瓜白粉病菌的甜瓜叶片浸泡在质量浓度为0.15% 的脱色液中，在7(TC的条件下保温30min，将叶片从脱色液中取出并用水冲洗 2次，得到脱色叶片；二、将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡30min， 再将叶片从染色液中取出并用水冲洗3次，以水为浮载剂，并在光学显微镜下 将叶面朝上观察染色后的叶片；即观察出感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织中的 甜瓜白粉病菌；其中步骤一中的脱色液为三氯乙醇和三氯甲垸按照体积比为3 l的比例混合的溶液；步骤二中的染色液由质量浓度为0.15。/。的三氯乙酸水 溶液和质量浓度为0.6y。的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液按照体积比为1 : 1的比 例混合组成。本实施方式中考马斯亮蓝R-250甲醇溶液是将考马斯亮蓝R-250溶解到纯 度为99%以上的甲醇所形成的溶液。将同一叶片分成两部分， 一部分采用本实施方式的方法进行染色，另一部 分采用现有方法(采用苯胺蓝染色24小时)进行染色；将本实施方式染色后 的叶片放在光学显微镜下观察，观察到的叶片组织的照片如图3所示，从图3 可以看出，本实施方式的方法可以清楚的观察到甜瓜白粉病菌的病原胞间菌丝。而采用现有方法染色的叶片放在光学显微镜下观察的结果如图4所示，从 图4与图3的对比可以看出本实施方式的方法染色效果明显优于现有方法。
具体实施方式
十二本实施方式用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按如下步骤进行 一、将接种甜瓜白粉病菌的甜瓜叶片浸泡在质量浓度为0.15%的脱色液中，在7(TC的条件下保温30min，将叶片从脱色液中取出并用水冲洗 2次，得到脱色叶片；二、将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡30min， 再将叶片从染色液中取出并用水冲洗3次，以水为浮载剂，并在光学显微镜下 将叶面朝上观察染色后的叶片；即观察出感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织中的 甜瓜白粉病菌；其中步骤一中的脱色液为三氯乙醇和三氯甲烷按照体积比为3 :1的比例混合的溶液；步骤二中的染色液由质量浓度为0.15%的三氯乙酸水 溶液和质量浓度为0.6。/。的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液按照体积比为1 : 1的比 例混合组成。本实施方式中考马斯亮蓝R-250甲醇溶液是将考马斯亮蓝R-250溶解到纯 度为99%以上的甲醇所形成的溶液。将同一叶片分成两部分， 一部分采用本实施方式的方法进行染色，另一部 分采用现有方法(采用苯胺蓝染色24小时)进行染色；将本实施方式染色后 的叶片放在光学显微镜下观察，观察到的叶片组织的照片如图5所示，从图5 可以看出，本实施方式的方法可以清楚的观察到甜瓜白粉病菌的病原菌分生孢 子梗。而采用现有方法染色的叶片放在光学显微镜下观察的结果如图6所示， 从图6与图5的对比可以看出本实施方式的方法染色效果明显优于现有方法。
具体实施方式
十三本实施方式用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按 如下步骤进行 一、将未感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片浸泡在质量浓度为0.15% 的脱色液中，在7(TC的条件下保温30min，将叶片从脱色液中取出并用水冲洗 2次，得到脱色叶片；二、将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡30mhi， 再将叶片从染色液中取出并用水冲洗3次，以水为浮载剂，并在光学显微镜下 将叶面朝上观察染色后的叶片；即观察出甜瓜叶片组织中没有甜瓜白粉病病原菌；其中步骤一中的脱色液为三氯乙醇和三氯甲烷按照体积比为3 : 1的比例混合的溶液；步骤二中的染色液由质量浓度为0.15%的三氯乙酸水溶液和质量 浓度为0.6%的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液按照体积比为1 : 1的比例混合组 成。本实施方式中考马斯亮蓝R-250甲醇溶液是将考马斯亮蓝R-250溶解到纯 度为99%以上的甲醇所形成的溶液。本实施方式染色的未感染甜瓜白粉病的甜瓜叶片组织照片如图7所示，图 7说明本实施方式的染色方法不伤害叶片的组织，图7和图1、图3和图5对 比说明通过本实施方式的染色方法可以准确判断叶片是否感染了甜瓜白粉病。
权利要求
1、一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法，其特征在于用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按如下步骤进行一、将待检测的甜瓜叶片浸泡在质量浓度为0.15％的脱色液中，在70℃的条件下保温30min，将叶片从脱色液中取出并用水冲洗1～5次，得到脱色叶片；二、将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡5～30min，再将叶片从染色液中取出并用水冲洗1～5次，以水为浮载剂，并在光学显微镜下将叶面朝上观察染色后的叶片；即能够鉴别甜瓜叶片是否感染甜瓜白粉病；其中步骤一中的脱色液为三氯乙醇和三氯甲烷按照体积比为3∶1的比例混合的溶液；步骤二中的染色液由质量浓度为0.15％的三氯乙酸水溶液和质量浓度为0.6％的考马斯亮蓝R-250甲醇溶液按照体积比为1∶1的比例混合组成。
2、 根据权利要求1所述的一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法， 其特征在于步骤一中将将叶片从脱色液中取出并用水冲洗2~4次。
3、 根据权利要求1所述的一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法， 其特征在于步骤一中将将叶片从脱色液中取出并用水冲洗3次。
4、 根据权利要求1所述的一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法， 其特征在于步骤二中将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡10 25min。
5、 根据权利要求1所述的一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法， 其特征在于步骤二中将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡15 20min。
6、 根据权利要求1所述的一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法， 其特征在于步骤二中将步骤一得到的脱色叶片放入染色液中浸泡18min。
7、 根据权利要求1所述的一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法， 其特征在于步骤二中将叶片从染色液中取出并用水冲洗2 4次。
8、 根据权利要求1所述的一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法， 其特征在于步骤一中将叶片从脱色液中取出并用水冲洗3次。
全文摘要
一种用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法，它涉及了一种用于鉴定白粉病病原菌的染色方法。本发明解决了用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法存在染色时间长、染色后效果不明显的缺陷。本发明用于鉴定甜瓜白粉病病原菌的染色方法按照如下步骤进行一、叶片脱色；二、叶片染色后观察；即能够鉴别甜瓜叶片是否感染甜瓜白粉病。本发明具有染色时间短、染色后效果明显的优点。
文档编号G01N1/30GK101324494SQ20081006499
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者崔喜波, 李桂英, 栾非时, 萍 王, 王学征, 盛云燕, 路绪强, 陈克农, 马鸿艳 申请人:东北农业大学