专利名称：利用紫外光谱法测定细胞周期的方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞周期测定方法，特别涉及一种利用紫外光谱法准确反映细胞周期 变化的方法。
背景技术：
细胞作为生命科学研究的基础， 一切生命的关键问题都要从细胞中寻找。生物的生殖 发育、遗传、神经(脑)活动等重大生命现象的研究都要以细胞为基础。植物与动物生长 发育是依靠细胞增殖、细胞分化与细胞凋亡来实现的， 一切疾病的发病机制也要以细胞病 变研究为基础。细胞分裂是生命起源最基本也最重要的过程。细胞生长和细胞分裂是所有 生物增殖的基本形式，细胞生长和细胞分裂的周期即为细胞增殖周期简称细胞周期(cell cycle)。对于真核细胞而言，其细胞周期由G1期、S期、G2期和M期组成，它是细胞全 部生理过程的综合体现，普遍存在于高等生物中。目前，细胞周期及其调控机制已在肿瘤、 干细胞移植、衰老、生殖和遗传学等领域显示出巨大的指导意义。目前，对于细胞周期进行判定的研究方法主要有以下几种光学显微镜法、流式细胞 仪分析法(DNA含量分析)、3H-TdR标记法等。光学显微镜法主要是通过显微镜对细胞 的形态进行观察以判断细胞所处细胞周期，该方法是通过人眼观察，判断速度慢；流式细 胞仪分析法在细胞周期研究中应用广泛，但价格昂贵。从DNA含量入手，G1期和G2/M 期含有固定的DNA含量，分别为1倍和2倍，S期细胞的DNA含量介于1倍和2倍之间， 应用流式细胞仪就可通过监测细胞DNA含量的变化确定细胞周期的长短。但是由于G2 期和M期细胞的DNA含量都是2倍，故流式细胞仪无法区分G2期和M期细胞。3H-TdR 标记法是测定细胞的一种经典方法。但其测量中使用的放射性同位素要求专门设备，很容 易对操作者造成伤害和对环境造成污染，同时放射性同位素本身对细胞周期也有干扰且不 可避免。细胞在细胞周期的变化过程中，细胞内部的氨基酸、蛋白质、酶和辅酶、嘌呤、嘧啶、 核酸等物质都将随着细胞的生长变化发生巨大的变化。紫外-可见光吸收光谱的变化对应细 胞周期的变化主要有蛋白质中的肽基团、芳香族氨基酸和某些辅基引起。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，苯丙氨酸在257nm处有一吸收峰；酪氨酸在274nm处有 一强跃迁；色氨酸的吸收谱较复杂，在240 2卯nm范围内至少存在3种电子跃迁。这些 氨基酸光谱均对pH变化敏感，也对溶剂极性敏感，所以可以用它们的谱线进行细胞周期 变化研究。利用紫外-可见光吸收光谱和荧光光谱可以对这个过程中的蛋白质和核酸的变化 进行精确的跟踪进而得出在细胞周期不同时相的特征光谱，并以此作为建立细胞周期光谱 信息模型的依据。同时，它还具有设备简单、价格低廉、操作方便、灵敏度高等优点。利 用光谱技术对细胞进行研究也是对细胞内的各种有机物分子的变化进行跟踪，以对细胞的 生理行为进行解释。目前，国内外通过建立细胞紫外可见光光谱模型以对细胞的细胞周期进行判断还未见 报道。发明内容针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的是提供一种能够对真核细胞的细胞周 期各阶段(Gl期、S期、G2期和M期)进行判断的简便方法，将细胞的紫外光谱信息同 细胞生长行为以及细胞增殖过程中生物化学反应联系起来对细胞周期进行判断。本发明的目的是这样实现的利用紫外光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于包括 如下步骤1)将某种细胞的单个细胞作为一个变化体系，用处于正常生长状态下的细胞 周期G1期、S期、G2期和M期的单个细胞制成标准样品，利用紫外分光光度计测量所述 细胞标准样品在190nm 400nm的吸光度；对于在该范围(190nm 400nm)内只有一个吸收峰的情况，则直接利用该吸收峰强度 与细胞周期的关系建立模型通过吸收峰强度对细胞周期进行判别；对于在该范围(190nm 400nm)内有多个吸收峰的情况，则建立多条吸收峰强度与细胞周期的关系曲线，再利用 该关系对细胞周期进行判别；2)利用紫外可见光分光光度计在190 400mi范围内，对被测样品进行扫描，对所得 光谱曲线进行预处理后，将被测样品光谱曲线的吸收峰强度与所述某种细胞周期的紫外光 谱模型的吸收峰强度对比，即可判断出被测细胞处于细胞周期的哪一阶段。本发明方法制样简单、操作方便、仪器设备普遍、准确性高、测量速度快，应用细胞 吸收峰强度随细胞周期变化的关系，可很方便的对细胞的细胞周期进行判断，有利于在生 物医学研究过程中推广应用。
图1为吸收峰强度和细胞周期的关系图；图2为Hela细胞细胞周期各阶段光谱曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明作进一步说明。实施例利用紫外光谱法对Hda细胞进行细胞周期测量的方法1、 首先，建立Hela细胞周期的紫外光谱模型，每一时相的细胞标准光谱曲线按以下 步骤获取① 样品的获得。为获取准确的光谱数据，首先要保证细胞样品处于自然生长状态下， 采用光学显微镜观察根据形态变化，获取处于细胞周期不同时相(Gl期、S期、G2期和 M期)的细胞，将其制成标准样品。② 各时相细胞光谱的测量。在生理温度(36.5土0.5'C)下利用紫外可见光分光光度 计，进行标准样品的紫外光谱测量，设定分光光度计的扫描范围190 400nm，扫描步长 0. lnm，扫描次数5次。(测量结果曲线如图l所示)。③ 细胞光谱的预处理。将每一细胞周期的5组光谱数据取平均作为该样品组细胞的标 准光谱曲线，将平均所得光谱曲线进行平滑滤波处理，以降低消除测量中各种原因引起的 光谱畸变。④ 细胞紫外光谱模型的建立。完成细胞周期各阶段样品的光谱曲线的测量后，利用同 一波长处的吸收峰强度与细胞所处细胞周期相应阶段的关系建立对应模型(如图2所示)。2、 完成细胞周期各阶段的光谱模型建立后，就可对细胞所处周期进行判断了。首先， 利用紫外可见光分光光度计在190 400nm范围内，对被测Hela细胞样品进行扫描，对所 得光谱曲线进行平滑滤波等处理后，将光谱曲线建立模型所用波长对应的吸收峰强度与模 型对比，即可判断出被测细胞处于细胞周期的哪一阶段。本发明方法将某种细胞的单个细胞作为一个变化体系，用处于正常生长状态下的细胞 周期Gl期、S期、G2期和M期的单个细胞制成标准样品，利用紫外分光光度计测量各细 胞样品在190nm 400nm的吸光度。在该范围内的主要吸收波长处，吸收峰的强度会随着 细胞周期变化中胞内物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的不断变化的有明显的变化。对 于在该范围内只有一个吸收峰的情况，则直接利用该吸收峰强度与细胞周期的关系建立模 型通过吸收峰强度对细胞周期进行判别。对于在该范围内有多个吸收峰的情况，则需通过相关系数来判断哪个吸收峰更利于对细胞周期进行判别，选择相关系数最大的吸收峰，建 立其强度与细胞周期的关系模型。完成模型的建立后，当要对该种细胞所处的细胞周期进 行测定时，只需测量其在190nm 400nra的吸光度，将所得吸收峰强度与相关模型对比即 可判断其所处细胞周期。本发明所提供的细胞紫外光谱法是可反映真核细胞在细胞周期过程中各个阶段Gl期、 S期、G2期和M期的变化趋势。细胞的生长、增殖过程都和细胞周期密不可分，在细胞 周期的各个时相中，由于细胞内氨基酸、蛋白质等物质随细胞周期变化而在各时相中的不 均匀分布以及浓度变化，造成了细胞在各时相中紫外可见光吸收光谱的峰值及其强度的差 异，这种差异几乎不受细胞形态变化的影响。故可将这种差异作为紫外光谱方法测定细胞 周期的主要参数，从而准确地对细胞的生长行为进行描述和判断。
权利要求
1、利用紫外光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于包括如下步骤1)将某种细胞的单个细胞作为一个变化体系，用处于正常生长状态下的细胞周期G1期、S期、G2期和M期的单个细胞制成标准样品，利用紫外分光光度计测量所述细胞标准样品在190nm～400nm的吸光度；对于吸光度在190nm～400nm范围内只有一个吸收峰的情况，则直接利用该吸收峰强度与细胞周期的关系建立模型通过吸收峰强度对细胞周期进行判别；对于吸光度在该范围内有多个吸收峰的情况，则建立多条吸收峰强度与细胞周期的关系曲线，再利用该关系对细胞周期进行判别；2)利用紫外可见光分光光度计在190～400nm范围内，对被测样品进行扫描，对所得光谱曲线进行预处理后，将被测样品光谱曲线的吸收峰强度与所述某种细胞周期的紫外光谱模型的吸收峰强度对比，即可判断出被测细胞处于细胞周期的哪一阶段。
2、 根据权利要求1所述利用紫外光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于所述标准 样品的获得，要保证细胞样品处于自然生长状态下，采用光学显微镜观察根据形态变化， 获取处于细胞周期不同时相的细胞，将其制成标准样品。
3、 根据权利要求1所述利用紫外光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于所述步骤1) 中吸光度的测量是在生理温度(36.5士0.5'C)下利用紫外可见光分光光度计，进行标准 样品的紫外光谱测量，设定分光光度计的扫描范围190 400nm，扫描步长0. lnm，扫描次 数5次。
4、 根据权利要求1所述利用紫外光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于所述细胞 光谱的预处理是将每一细胞周期的5组光谱数据取平均作为该样品组细胞的标准光谱曲 线，将平均所得光谱曲线进行平滑滤波处理。
全文摘要
本发明公开一种利用紫外光谱法测定细胞周期的方法。该方法利用细胞在细胞周期(G1期、S期、G2期和M期)变化过程中胞内物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的不断变化对其紫外光谱的峰位、谱峰及峰强造成的影响，找出这些参数与细胞所处周期的对应关系，建立特定细胞的细胞周期紫外光谱模型，最终利用该模型实现对单个细胞周期的准确测定。该方法将一种常规方法用于对细胞周期的测量，解决以往依赖流式细胞仪对细胞周期进行测定的较为繁琐的判别方法，而且能够对细胞周期G2期和M期的细胞进行区分，这是流式细胞仪无法实现的。本发明制样简单、操作方便、仪器设备普遍、准确性高、测量速度快，应用细胞吸收峰强度随细胞周期变化的关系可很方便的对细胞的细胞周期进行判断，有利于在生物医学研究过程中推广应用。
文档编号G01N21/31GK101329270SQ200810069990
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月18日 优先权日2008年7月18日
发明者林晓钢, 潘英俊, 郭永彩, 潮 高 申请人:重庆大学