专利名称：一种鼻咽癌早期筛查、诊断试剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症诊断试剂，具体地，本发明涉及含有EB病毒裂解复制期 早期基因BALF1序列表达产物的诊断试剂及其应用。
背景技术：
EB (Epstein-Barr)病毒是一种Y疱疹病毒，全球接近95%的成人感染 有该病毒。EB病毒感染可分为潜伏感染期和裂解复制期两种状态，在初次 感染后，该病毒可在宿主体内建立起终身潜伏感染，持续性的EB病毒裂解 复制状态感染可导致一系列的人类恶性肿瘤(Rickinson et al., 1996)。 EB病毒终生在口咽部产生并通过口腔传染，初始感染可引起传染性单核细 胞增多症，多发于儿童和年轻成人。经多年研究发现EB病毒与鼻咽癌、胃 癌、肺癌以及一系列常见淋巴瘤均有相关。其中鼻咽癌与EB病毒关系最为 密切，近年来通过对肿瘤上皮细胞中的病毒基因组与抗原的检测证实了二者 的密切相关性(ZurHausenetal.,1970;Yeungeta1. 1993)。鼻咽癌是东南亚地区 常见肿瘤，与食道癌、肝癌并称中国三大肿瘤，且高发于我国南方数省，在 南方各种恶性肿瘤中占第一位。对于EB病毒相关肿瘤控制的主要策略为1、 早期检测诊断后进行治疗，2、将疾病的发生理想的推迟至平均寿命之外，3、 预防。由于EB病毒无法单独在体外培养，而大量细胞培养以及纯化带来的 困难和不安全因素使直接从形态学检测EB病毒很难在临床上实现，更无法 应用于大规模筛査工作。因此早期诊断多应用病毒特异性的抗原、抗体或遗 传物质对EB病毒相关肿瘤进行早期诊断是目前控制EB病毒相关肿瘤行之 有效的方法，现在诊断EB病毒相关疾病的主要指标为EB病毒壳抗原 (VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、及其抗体。其中EBNA1在 EB病毒潜伏期和裂解期均有表达，目前研究表明，虽然大多数人感染EB病 毒，但多属于潜伏期感染，而裂解期感染指病毒大量活跃复制，此类型感染与EB病毒所致恶性肿瘤密切相关，因此该抗原的特异性不理想；而VCA与
EA虽然在NPC病人中检出率高，但其特异性也不好，在健康人群中仍有较 高的检出率。因此选择灵敏度与特异性好的检测指标是现在本研究领域急需 解决的问题之一。
基于持续性的EB病毒裂解复制状态感染与一系列的人类恶性肿瘤密切 相关的认识，选择EB病毒列解期表达产物作为检测指标可能是好的选择。 现有的EB病毒的裂解期表达产物主要包括BALF1、 BLLF1、 BXLF2、 BALF4、 B0RF2、 BARF1、 BALF5及BZLF1等基因的表达产物。但是，制备疾病检测试 剂盒，除了需要表达的蛋白在免疫沉淀反应中抗体滴度效价很高外，蛋白还 要足够的稳定，目前并未有研究表明它们可以作为鼻咽癌及相关疾病的良好 的检测试剂。
BALF1基因位于EB病毒基因组164397 165059位置，是EB病毒进入裂解 复制状态早期表达的早期基因，长度为663bp， 1999年由Marshall发现该基因 与人类Bcl2家族具有同源性。BALF1基因编码蛋白具有凋亡抑制作用，能够 抑制感染的上皮细胞进入凋亡(Dawsonetal., 1995)。有研究表明BALF1基因 能够在B淋巴细胞以及上皮细胞中表达相应蛋白，在EB病毒潜伏期仅少量表 达，但一旦病毒进入裂解期，蛋白表达量明显增高。
目前尚未见使用BALF1基因表达产物作为抗原，作为鼻咽癌早期筛査 和诊断试剂的研究和报道。
发明内容
本发明针对上述本领域急需解决的问题，利用EB病毒裂解复制期早期基 因BALF1的生物学特性，提供了具有高灵敏度和特异性的，可应用于诊断EB 病毒相关疾病以及大规模人群筛査的新型检测指标及方法。
本发明提供一种试剂盒，它至少包含一种氨基酸序列如SEQ NO. 2所示 的蛋白或其与GST蛋白的融合蛋白。
进一步的，所述试剂盒含有氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白或其与 GST蛋白的融合蛋白。
所述试剂盒用于鼻咽癌及相关疾病的早期诊断、筛查和检测；优选的，所述试剂盒采用ELISA技术。
本发明还提供一种制备氨基酸序列如SEQNO. 2所示的蛋白或其与GST 蛋白的融合蛋白的方法，包括
a、构建含有SEQ N0.3核苷酸序列的重组质粒；b、将重组质粒转入宿 主细胞；c、收集得到含有SEQN0.2所示氨基酸序列的表达产物粗提物；d、 纯化表达产物粗提物，得到氨基酸序列如SEQ NO. 2所示蛋白或其与GST 蛋白的融合蛋白；e、将d步骤得到的纯化蛋白进行二次纯化。
上述的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白，即BALF1蛋白；或其与 GST蛋白的融合蛋白，即GST-BALF1融合蛋白，这两种蛋白质分子的灵敏度 与特异性均较好，作为检测试剂没有显著差异，为鼻咽癌以及其它EB病毒相 关疾病的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标。
所述的方法中，步骤a所述的质粒载体为PGEX系列或PET系列的蛋白 表达载体；
步骤b所述的宿主细胞为E.coli.BL21、 DH5a或JM109;
步骤d所述的纯化方法为将收集的表达产物粗提物，用Glutahione Sepharose 4B或亲和层析柱纯化，Xa因子储存液，Xa因子剪切缓冲液洗脱 离心，或者用谷胱甘肽洗脱液，离心，得到纯化的氨基酸序列如SEQ NO. 2 所示蛋白；
步骤e所述的纯化方法为透析法、离子交换层析法以及HPLC-分子筛层 析法。
优选的，步骤e所述的纯化方法为HPLC-分子筛层析法，所使用的层析 柱为Sepharose-lOO。
我们在使用步骤6或7后保存一段时间后(5h)电泳分析发现蛋白质有 降解现象。因此我们认为可能有其他物质影响了所获得蛋白的稳定性。我们 采用了不同的方法(透析法，离子交换层析法以及HPLC-分子筛方法)，对蛋 白进行了再次纯化并通过电泳分析比较保存一段时间后的降解情况。最终认 为使用HPLC-分子筛的方法进行再次纯化获得的蛋白稳定性最好，因此我们 使用HPLC-分子筛获得更为稳定的目的蛋白的方法并非显而易见的方法。
经过本发明的方法制备得到的高度纯化的BALF1蛋白GST-BALF1融合蛋白在室温下保存12小时没有发生降解，为制备试剂盒提供了可能。而以这两 种蛋白制备的试剂盒，对鼻咽癌以及其它EB病毒相关疾病的诊断和筛査，其 灵敏度与特异性均很好。
图1 PGEX-BALF1质粒构建示意图。
图2 GST-BALF1融合蛋白在HPLC-分子筛纯化前后不同保存时间电泳图 (室温下保存，20°C)。
白色箭头所示为目的蛋白。泳道1为HPLC-分子筛纯化前蛋白质保存O 小时电泳图，2为HPLO分子筛纯化前蛋白质保存5小时电泳图，3为HPLO 分子筛纯化后0小时电泳图，4为HPLC-分子筛纯化后保存12小时电泳图。M 为marker。
图3 BALF1蛋白在HPLC-分子筛纯化前后不同保存时间电泳图(室温下 保存，20°C)。
白色箭头所示为目的蛋白。泳道l为HPLC-分子筛纯化前蛋白质保存O 小时电泳图，2为HPLC-分子筛纯化前蛋白质保存5小时电泳图，3为HPLC-分子筛纯化后0小时电泳图，4为HPLC-分子筛纯化后保存12小时电泳图。M 为marksro
图4正常组与NPC病人组检测结果进行R0C分析的结果。
图5 65例被测样本的VCA抗体浓度小于8 U/ml为阴性结果，8 U/ml
12 U/ml为可疑结果，大于12 U/ml为阳性结果。
图6 65例被测样本的EA抗体浓度小于8 U/ml为阴性结果，8 U/ml
12 U/ml为可疑结果，大于12 U/ml为阳性结果。
具体实施例方式
以下对本发明的详细描述意在更清楚地说明本发明，但并不限制本发明。 在我们的前期工作中，我们对一系列EB病毒裂解期表达基因利用体外 表达系统进行表达，并对已确诊为NPC的患者血清样本进行免疫沉淀反应， 发现BAFL1蛋白的免疫沉淀反应明显，其抗体具有作为诊断指标的潜能。经过前期筛选，认为BALF1表达产物作为检测试剂可能较好，筛选过程为
RT拉出不同的产物cDNA，然后体外真核表达(加入核素标记亮氨酸)，免 疫沉淀，比较不同cDNA的表达产物沉淀量。
实施例1、 PGEX-BALF1的获得(重组质粒示意图见图1)
(1) 引物的设计与合成根据已知BALF1序列设计的PCR引物序列为 F: 5， -GGGGATCCAATGAACCTGGCCATTGCTCTG-3，；
R: 5， -CGGAATTCTTACAAAGATTTCAGGAAGTC-3，
(2) RT-PCR扩增
使用TPA和n-丁酸盐诱导B95-8或P3服l细胞中的EBV进入裂解期，采 用RT-PCR方法获得BALF1基因的cDNA，将获得的产物按照常规方法进行测 序鉴定，证明所得到的cDNA序列如SEQ N0.3所示，与Genbank所公开的一 致。
(3) 使用BamHl， EcoRl内切酶酶切上述PCR产物与质粒PGEX-5X-3 (购 自amersham pharmacia biotech公司)，将酶切产物进行连接，获得含有 BALF1基因的PGEX质粒，即PGEX-BALF1。经过常规测序鉴定，证明已经将所 得到的cDNA插入到PGEX质粒得到重组质粒PGEX-BALF1 (见图1)。
实施例2、 GST-BALF1表达蛋白的制备与纯化
(1) 用CaCl2法制备大肠杆菌JM109与BL21的感受态细菌，50ul分装后 液氮保存备用。
(2) 用已经获得的重组质粒PGEX-BALF1转化两种感受态细胞，使用抗生 素进行筛选获得含有插入片段的阳性克隆。
(3) 将含有阳性重组质粒的JM109阳性克隆的单克隆在含有氨卞青霉素 的LB培养基中扩大培养。提取质粒保存备用，并且制备甘油菌保存备用。
(4) 将含有阳性重组质粒的BL21阳性克隆的单克隆接种在含有氨卞青霉 素(100ug/ul)的2ml LB培养基中，37摄氏度培养过夜。将400ul过夜培养 物分别接种到40ml含氨卞青霉素(100ug/ul)的LB培养基中，于37摄氏度培养7h。加入IPTG至终浓度为lmmol/L， 37摄氏度培养2. 5小时，转移至50ml 离心管中。室温4000rpm离心10min，去上清，重悬于预冷的lml含1% Triton-100的PBS中。使用超声波破菌(200W, 15s X 10次)，12000rpm离心 10min，收集上清。
(5) 重悬GST S印harase4B，取lml装柱，使用4ml PBS (pH 7. 0)缓冲液平 衡。滤去PBS，打开柱底盖，取出琼脂珠，置于一干净的3ml离心管中，加 入已经获得的细菌裂解液上清lml轻轻混匀，置于室温5 10分钟，其间混 匀3 5次，500rpm离心10分钟，去上清。加入2ml PBS重悬，置于室温5 IO分钟，其间混匀3 5次，500rpm离心IO分钟，去上清。重复1次。
(6) 离心管内加入200ul谷胱甘肽洗脱液，轻轻混匀，置于室温5 10 分钟，其间混匀3 5次，500rpm离心10分钟，取上清收集，-80摄氏度保 存备用。将上清液的蛋白按照常规方法进行鉴定，证明上清为纯化的 GST-BALF1融合蛋白，其氨基酸序列由GST和SEQ NO. 2所示的序列组成。
(7) 接步骤5，根据细菌蛋白表达多少，在200ulXa因子剪切缓冲液中， 按照试剂说明书，根据不同的蛋白量，加入不同单位的Xa因子后加入离心管 中，轻轻混匀，置于室温3小时，其间混匀3 5次，500rpm离心IO分钟， 取上清收集，-80摄氏度保存备用。将上清液的蛋白按照常规方法进行鉴定， 证明上清为纯化的BALF1蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
(8) 对骤6获得的GST-BALF1融合蛋白或步骤7所得到的BALF1蛋白， 使用HPLC-分子筛进一步纯化。选用层析柱为S印harose-lOO已装柱，用2 倍柱床体积已滤菌PBS平衡层析柱，将经过亲和层析纯化获得的GST-BALF1 融合蛋白或BALF1蛋白3 ml上样加入柱中，A260 nm波长观察柱内流出液体 的蛋白含量，收集峰尖部分蛋白，即为高度纯化的GST-BALF1融合蛋白或 BALF1蛋白，-80摄氏度保存备用。
得到的GST-BALF1融合蛋白或BALF1蛋白室温保存12小时后仍然没有发 生降解，而未经步骤8 二次纯化的GST-BALF1融合蛋白或BALF1蛋白室温保 存5小时明显发生降解，前者稳定性显著好于后者(见附图2、 3)。
用上述方法制备得到的高度纯化的GST-BALF1蛋白或BALF1蛋白按照常 规方法制备成检测试剂盒。实施例3应用ELISA法检测血清中BALF1基因表达抗原的抗体。
检测原理:利用本发明制备的重组抗原包板，加入待检测血清，待血清中 抗体与包板抗原结合后，应用酶标抗人二抗与抗体结合，显色测定结果。
(1) 由GST-BALF1蛋白，BALF1蛋白作为不同的诊断抗原组合分别进行 ELISA检测。
(2) 抗原包被:用包被稀释液(碳酸钠缓冲液)分别将上述不同诊断抗原组 合稀释至100ug/ral。 ELISA酶标板上每孔加入lOOul， 37摄氏度3h。 PBST 洗板五次。
(3) 封闭加入5X牛血清白蛋白封闭液100ul/孔，37摄氏度lh， PBST 洗板五次。
(4) 待测血清血清1:80稀释后加入反应孔中，100ul/孔，37摄氏度lh， 洗板五次。
(5) 酶标物辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标羊抗人工作液100ul/孔， 37摄氏度lh，洗板5次。
(6) 显色:加入TMB显色工作液，100ul/孔，显色10min。
(7) 中止反应加入l滴中止液中止显色。
(8) 结果判断使用450nm波长检测各孔吸光度(OD)值。
结果使用GST-BALF1融合蛋白，BALF1蛋白作为诊断抗原组合包板对 NPC患者及正常人血清样本(91例NPC患者血清样本vsl46例正常人血清样 本)进行ELISA检测后，得到数据进行受试者工作曲线分析，以不同Cutoff 值进行敏感性及特异性判定得到表1表1: 采用不同分界值时的诊断效能评价参数表
分界值灵敏度特异度Y0UDEN分界值灵敏度特异度Y0UDEN
0.2460.9890.5180.5070.2820,8780.7870.665
0.2490.9670.5320.4990.2850.8780.7940.672
0.2510.9670.5530.5200.2880.8780，0.686
0.2520.9670.5600.5270.2890.8780.8160.693
0.2530.9670.5740.5410.2920.8780.8230.700
0.2540.%70.5820.5480.2940.8780.8300.708
0.2560.9670.5890.5550.2960.8780.8510.729
0.2570,9670.5960,5620.2970.8560.8510.707
0.2580.9670.6030.5700,3000.8560.8650.721
0.2600.9440.6100.5540.3040,8560.8720.728
0.2610.9440.6170.5610.3070.8560.8790.735
0.2630.9440.6310.5760.3090.8440.8790.724
0.2660.9440.6380.5830.3100,8440.8870,731
0,2680.9440.6520,5970.3110.8440.8940.738
0.2690.9440.6600.6040.3140.8440.9010.745
0,2700.9440.6670,6110.3190.8440.9150.759
0.2710.9440.6740.6180.3230.8220.9150.737
0.2720細0.6880.5880.3250細0.9150.715
0.2740.8780.6950.5730.3270扁0.9290.729
0.2750.8780.7160.5940.3300.8000.9430.743
0.2760.8780.7380.6150,3340.7890.9500.739
0.2770,8780.7520.6300.3430.7890.9570.746
0.2780.8780.7730.6510.3500,7890.9720.761
0.2800.8780.7800.6580.3520.7890.9790,768
我们在实际工作中可以根据实际需要(筛查或确诊)确定Cutoff值，我 们以上述数据做出受试者工作曲线(ROC)如附图4。可见该曲线拟合后其灵敏度和特异性倶佳。随机抽取NPC样本中的50例，正常样本中随机抽取的6
例，其他非NPC疾病9例共65例血清。进行VCA及EA抗体的检测，与BALF1 抗体检测比较，比较结果见表2。
表2不同抗体检测方法对NPC血清样本及非NPC血清样本的检测结果比较
阳性判定值范围NPC患者血清 阳性率非NPC患者血清阳 性率
VCA抗体检测>12 U/ml(+) 8 12 U/ml (±) <8 U/ml(-)0%0%
EA抗体检测>12 U/ml(+) 8 12 U/ml (±) <8 U/ml(-)機14%
BALF1抗体检测OD值〉0. 388%7%
VCA检测结果如图5，其判定值范围小于8U/ml为阴性结果，8U/ml 12 U/ml为可疑结果，大于12 U/ml为阳性结果。根据该标准对被测样本进 行分析。发现所有被测样本中的VCA浓度均小于8 U/ml，分布于1 7.778 之间，无阳性结果发现。
EA检测结果如图6，其判定值范围小于8U/ml为阴性结果，8U/ml 12 U/ml为可疑结果，大于12 U/ml为阳性结果。根据该标准对被测样本进 行分析。共有22个样本为阳性，其中22个样本大于12 U/ml，为阳性结果， 其中有一例为食管癌样本， 一例为正常人样本，其余20例均为NPC样本，占 所有NPC样本的40X。有7例样本介于8 U/ml 12 U/ml间，其中有2例为 NPC样本，占所有NPC样本的4%。剩余36例样本均小于8 U/ml 。
上述结果说明，在对我们现有的NPC患者血清样本的检测中，VCA和EA 两种现有的抗原检测方法在NPC疾病检测能力上均显著低于本发明。
本发明的诊断试剂盒为鼻咽癌以及其它EB病毒相关疾病的诊断提供新 的高灵敏度与特异性的检测指标,为早期筛查和诊断鼻咽癌及其它EB病毒相 关疾病提供了一个新途径。序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110〉四川大学华西医院
〈120〉 一种鼻咽癌早期筛査、诊断试剂及应用
〈130〉 CD314-07P103187
<160> 3
〈170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211〉 663
<212> DNA
<213〉 Epstein-Barr BALF1
〈220〉
<221> CDS
<222〉 (1)..(663)
<400> 1
atg Met 1犯c Asnctg Leugcc att Ala lie 5get ctg gac Ala Leu Asptct Sercct Pro 10C3C Hiscca ggc Pro Glyetc Leugcg Ala 15tct Ser48
tat Tyract Thr3tt liectg cca Leu Pro 20cgc cca ttt Arg Pro Phetat 丁yr 25cat Hisata lieSerctg Leu朋g Lys 30ccc Progtg Val96
age Sertgg Trpcct Pro 35g￡ic gag Asp 6luacc atg agg Thr Met Arg 40Progcc Alaaag 匕ystct SerThr 45Asptct Sergtg Val144
Ut Phegtg Val 50agg Argacc ccg Thr Progtc gag gcg Val Glu Ala 55tgg Trpgtc Valgcg Alaccc Pro 60teg Serccg Proccg Progac Asp192
gac Asp 65aag Lysgtg Valget g邓 Ala Glutec age tac Ser Ser Tyr 70etc Leuatg MetUc Phe 75agg gcc Arg Alaatg MetTyrgcg Ala 80240
gtg ValUc Pheacc Thregg gat Arg Asp 85gag aaa gac Glu Lys Aspctg Leucct Pro 90ttg LeuProgcc Alactg Leugtc Val 95etc Leu288
tgc Cysegg Argetc Leuate aag lie Lys 100gcc tec ctg Ala Ser Leuagg Arg 105犯g Lysgat Aspagg aa_g Arg lysctg Leu 110tac Tyrgcg Ala336
gag Gluctg Leugcc Ala 115tgc agg Cys Argaca gcc gac Thr Ala Asp 120ate lieggg Glyggc GlyLysgac Asp 125acg Thrcac HisVal384
egg Argetc Leu 130ate lieate age lie Sergtc ctg cgc Val Leu Arg 135gC3 Alagtg Valtac Tyr犯c gac Asn Asp 140Histeic Tyrgac Asp432
tac Tyr 145tgg Trp"tcg Seregg etc Arg Leuagg gtg gtg Arg Val Val 150ctg Leutgc Cystac Tyr 155Thrgtg Valgtg Valttt Phegcg Ala 160480
gtg Valcga ArgAsntac ctg Tyr Leu 165gat gac cac Asp Asp Hisaagage Ser 170gcc Alagcc Alanc Phegtg Valctg Leu 175ggg Gly528
gca Alaliegcc AlaC3C t￡LC His Tyr 180ctg gcc etc Leu Ala Leutat Tyr 185cgc Arg， Argetc tgg Leu Trpm Phe 190gcg Alaagg Arg576
ctg Leuggc Glyggc Gly 195atg cca Met Proaga teg ctg Arg Ser Leu 200聊 Argcgt Argcag Ginttc Pheccc Pro 205gtg Valscg Thrtgg Trp624gcc ctg gcc age ctg act gac ttc ctg Ala Leu Ala Ser Leu Thr人sp Phe Leu 210 215
Lys
序列表.txt tct ttg taa Ser Leu 220
663
〈210〉 2 〈211〉 220 〈212〉 PRT
<213〉 Epstein-Barr BALF1 〈400〉 2
Met Asn Leu Ala lie Ala Leu Asp Ser Pro His Pro Gly Leu Ala Ser 15 10 15
Tyr Thr lie Leu Pro Arg Pro Phe Tyr His lie Ser Leu Lys Pro Val 20 2^ 30
Ser Trp Pro Asp Glu Thr Met Arg Pro Ala Lys Ser Thr Asp Ser Val 35 40 45
Phe Val Arg Thr Pro Val Glu Ala Trp Val Ala Pro Ser Pro Pro Asp 50 55 60
Asp Lys Val Ala Glu Ser Ser Tyr Leu Met Phe Arg Ala Met; Tyr Ala 65 70 75 80
Val Phe Thr Arg Asp Glu Lys Asp Leu Pro Leu Pro Ala Leu Val Leu 85 90 95
Cys Arg Leu lie Lys Ala Ser Leu Arg Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Ala 100 105 110
Glu Leu Ala Cys Arg Thr Ala Asp lie Gly Gly Lys Asp Thr His Val 115 120 125
Arg Leu lie lie Ser Val Leu Arg Ala Val Tyr Asn Asp His Tyr Asp 130 135 140
Tyr Trp Ser Arg Leu Arg Val Val Leu Cys Tyr Thr Val Val Phe Ala 145 150 155 160
Val Arg Asn Tyr Leu Asp Asp His Lys Ser Ala Ala Phe Val Leu Gly 165 170 175
Ala lie Ala His Tyr Leu Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Trp Phe Ala Arg 180 185 190
Leu Gly Gly Met Pro Arg Ser Leu Arg Arg Gin Phe Pro Val Thr Trp 195 200 205
Ala Leu Ala Ser Leu Thr Asp Phe Leu Lys Ser Leu 210 215 220
〈210〉 3
〈211〉 663
〈212〉 DNA
<213〉 Epstein-Barr BALF1
〈400〉 3
atgaacctgg ccattgctct ggactxtcct cacccaggcc tcgcgtctta tactattctg
60序列表.txt
ccacgcccat tttatcatat aagcctgaag cccgtgagct ggcctgacga gaccatgagg 120
ccagccaagt ctacagattc tgtgtttgtg aggaccccgg "tcgaggcgtg ggtcgcgccc 180
tcgccgccgg acgacaaggt ggctgagtcc agctacctca tgttcagggc catgtacgcg 240
gtgttcaccc gggatgagaa agacctgcct ttgccagccc "tggtcctctg ccggctcatc 300
aaggcctccc tgaggaagga taggaagctg tacgcggagc tggcctgcag gacagccgac 360
atcgggggca aagacacgca cgtacggctc atcatcagcg tcctgcgcgc agtgtacaac 420
gaccactacg actactggtc gcggctcagg gtggtgctgt gctacacagt ggtgtttgcg 480
gtgcgaaact acctggatga ccacaagagc gccgccttcg tgctgggggc aatcgcccac 540
tacctggccc tctatcgcsg actctggttt gcgaggctgg gcggcatgcc aagatcgctg 600
agacgtcagt tccccgtgac gtgggccctg gccagcctga ctgacttcct gaaatctttg 660
taa 66权利要求
1. 一种试剂盒，它至少包含一种氨基酸序列如SEQ NO.2所示的蛋白或其与GST蛋白的融合蛋白。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于含有氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白或其与GST蛋白的融合蛋白。
3、 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于用于鼻咽癌及相关 疾病的早期诊断、筛查和检测。
4、根据权利要求1 3任一一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒 采用ELISA技术。
5、 一种制备氨基酸序列如SEQNO. 2所示的蛋白或其与GST蛋白的融 合蛋白的方法，包括a、构建含有SEQ NOJ核苷酸序列的重组质粒；b、将重组质粒转入宿 主细胞；c、收集得到含有SEQN0.2所示氨基酸序列的表达产物粗提物；d、 纯化表达产物粗提物，得到氨基酸序列如SEQ NO. 2所示蛋白或其与GST 蛋白的融合蛋白；e、将d歩骤得到的纯化蛋白进行二次纯化。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征是，步骤a所述的质粒载体为 PGEX系列或PET系列的蛋白表达载体。
7、 根据权利要求5所述的方法，其特征是，步骤b所述的宿主细胞为 E.coli.BL21、 DH5a或JM109。
8、 根据权利要求5所述的方法，其特征是，步骤d所述的纯化方法为 将收集的表达产物粗提物，用Glutahione Sepharose 4B或亲和层析柱纯化，Xa 因子储存液，Xa因子剪切缓冲液洗脱离心，或者用谷胱甘肽洗脱液，离心， 得到纯化的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示蛋白。
9、 根据权利要求5所述的方法，其特征是，步骤e所述的纯化方法为透 析法、离子交换层析法以及HPLC-分子筛层析法。
10、 根据权利要求9所述的方法，其特征是，所述的HPLC-分子筛层析 法，所使用的层析柱为S印harose-100。
全文摘要
本发明涉及一种鼻咽癌早期诊断试剂，它至少包含一种氨基酸序列如SEQ NO.2所示的蛋白或其与GST蛋白的融合蛋白。本发明还提供了一种制备氨基酸序列如SEQ NO.2所示的蛋白或其与GST蛋白的融合蛋白的方法。本发明的诊断试剂盒为鼻咽癌以及其它EB病毒相关疾病的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标，为早期筛查和诊断鼻咽癌及其它EB病毒相关疾病提供了一个新途径。
文档编号G01N33/569GK101303353SQ200810097299
公开日2008年11月12日 申请日期2008年5月9日 优先权日2007年5月10日
发明者应斌武, 波 李, 王兰兰, 红 范, 魏永刚 申请人:四川大学华西医院