专利名称：：风疹病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种风疹病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：风疹病毒属于披膜病毒科，具单股正链RNA，直径为60nm，仅有一个血清型。风疹病毒的抗原结构相当稳定，是一种最危险的致畸因素。风疹病毒与巨细胞病毒、弓形虫病毒、疱疹病毒1型和2型共同命名为T0RCH。这五大病毒的共同危害是造成流产、早产、死胎、胎儿畸形、残疾儿。侥幸存活的新生儿常可发生生长发育迟缓、白内障、神经性耳聋、先天性心脏病、脑膜脑炎、巨细胞肝炎、溶血性贫血、视力、听力障碍等，因此TORCH检测对于优生优育至关重要。风疹是由风疹病毒引起的。风疹在我国己列入法定报告的传染病。80年代以来曰本、美国、印度、墨西哥、澳大利亚等均有较大的流行。孕妇属易感人群，一旦感染便可发生子宫内感染致胎儿畸形及严重后遗症，流产及死产率较正常妊娠高2-4倍。妊娠早期感染者致畸率为50%，中期为25%，末期为15%。因此，早期妊娠妇女若确诊为风疹病毒感染时应行人工流产终止妊娠。为避免孕早期受到风疹病毒感染，在孕前必须检查风疹IgG抗体，若IgG抗体阳性则表示曾经感染过风疹病毒，并有终生免疫力，不会再受感染，可以怀孕。若IgG抗体阴性则表示无抵抗力，容易受到风疹病毒感染，因此必须立即注射风疹疫苗，使体内产生抗体，然后再怀孕即可避免本病。因孕妇为易感人群，因此婚前和孕前风疹IgG抗体的检测至关重要，避免感染风疹造不必要的后果。当前检测风疹IgG抗体的诊断技术有金标、ELISA、PCR等方法。金标试剂操作简单，快速，但肉眼观察有一定误差，准确率低；PCR具有灵敏度极高的特点，直接检测病原体基因，但操作繁琐、需要先进的仪器设备和较高的费用，不适用于基层推广；而ELISA检测方法，具有灵敏度高、特异性强的特点，目前临床应用比较普遍，但存在漏检、假阳性等问题。上述诊断技术，均有其特定的优缺点。本发明利用化学发光免疫分析法，是一种较先进而有效的方法，其优点是把高灵敏的化学发光分析和特异性强的免疫分析方法相结合，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。高灵敏度的化学发光检测技术以被广大研究人员所认可，并正逐渐替代传统的生物检测技术。另外，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒采用微孔板化学发光免疫分析技术，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。
发明内容本发明目的在于克服现有技术的不足，将化学发光免疫分析技术与间接反应检测法相结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测风疹IgG抗体的试剂盒。另外目前临床应用普遍的。ELISA试剂盒样品稀释比例一般为1:100或者1:1000，操作繁琐，费时费力，而本试剂盒的样品稀释，采用l:IO稀释，大大节约了时间与成本，操作更简便，且能够减少非特异反应，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。本发明"风疹病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒"可以准确地检测出病人血清中风疹IgG抗体，它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点，某些指标均优于酶联免疫分析法。并且，本发明可使用的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。本发明的目的是提供一种化学发光免疫分析测定风疹病毒IgG抗体的试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒包括阴、阳性对照，包被的风疹病毒抗原固相载体，样品稀释液，碱性磷酸酶标记的抗人IgG单抗，化学发光底物以及浓縮洗漆液。根据本发明的试剂盒，其中，所述阴、阳性对照分别为正常人血清、风疹IgG抗体阳性血清经1%BSA的磷酸盐缓冲液稀释的溶液；所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管；所述样品稀释液为含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐温-20、0.05%二巯基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述化学发光底物l，2-二氧乙垸类衍生物为(金刚烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSTO或CDP-Star。本发明还提供了一种制备上述试剂盒的方法1)配制阴、阳性对照；该阴性对照为正常人血清经1%BSA的磷酸盐缓冲液稀释的溶液，阳性对照为风疹IgG抗体阳性血清经1%BSA的磷酸盐缓冲液稀释的溶液。2)以风疹病毒抗原包被固相载体；所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管，包被固相载体的步骤为将0.046MpH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的风疹病毒抗原混合，并将所得混合液负载于固相载体上，BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。3)配制样品稀释液；该样品稀释液为含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐温-20、0.05%二巯基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH值为7.4的磷酸盐缓冲液。4)以碱性磷酸酶标记抗人IgG单抗，用戊二醛交联发制备。5)配制化学发光底物；化学发光底物液为含2(m的AMPPD溶液；6)配制浓縮洗涤液；所述洗涤液为20倍浓縮的Tris-HCl缓冲液；7)分装上述阴、阳性对照、样品稀释液、浓縮洗涤液、酶标记物和化学发光底物；以及8)组装为成品。具体的上述试剂盒包括包被有抗原的化学发光微孔板48或96孔、样品稀释液1瓶、酶标记物1瓶、阴性和阳性对照各1瓶、化学发光底物液1瓶、浓縮洗漆液1瓶。根据本发明的试剂盒，试剂盒采用风疹病毒纯化的抗原包被固相载体，继而加入酶标记的抗人IgG单抗，再与化学发光底物作用，测值即与标本中的风疹病毒IgG抗体成正相关。该检测方法有效地利用了化学发光技术原理，又具有反应逐层加大，因而极大的提高了检测的特异性和灵敏性。另外，样品稀释后能够减少非特异反应，本法较常规ELISA试剂盒样品稀释比例大大縮小，直接在微孔板内加稀释液与样品即可完成样品的稀释，极大地节约了时间与成本。具体实施例方式实施例1制备本发明的风疹病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒本发明的风疹病毒IgG抗体诊断试剂盒包括阴、阳性对照，包被的风疹病毒抗原固相载体，样品稀释液，浓縮洗涤液，碱性磷酸酶标记的抗人IgG单抗，化学发光底物。本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，包括包被抗原、标记抗体、白色微孔板的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对固相载体用不同的包被缓冲液和封闭液进行试验，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，通过不同包被浓度试验找到最佳的浓度条件。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比试验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对样品稀释液和酶标记物使用的稀释液进行了长期的考察试验，配制出了能够减少非特异反应、灵敏度高、特异性好且长期保持活性而稳定的稀释液。一、风疹病毒抗原预包被化学微孔板的制备(1)包被将风疹病毒纯化抗原加至0.046MpH值为4.6柠檬酸缓冲液中混匀制成包被液，每孔lOOuL加入微孔板各孔内，4'C过夜。具体地，所述包被方法为柠檬酸4.44g柠檬酸三钠7.3g去离子水定容至1000mL，调pH至4.6加入纯化的风疹病毒抗原制成浓度为1:500的包被液，每孔100uL加入微孔板各孔内，4'C过夜。(2)洗涤用生理盐水洗三次，拍干。(3)封闭每孔分别加入封闭液200uL，室温放置3小时，甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。具体地，封闭液配制方法为NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9gBSA10gProclin300lmL去离子水定容至1000mL，调ra至7.0室温除湿干燥1824小时。然后进行封袋。二、阴、阳性对照的制备混合的正常人血清经过滤除菌后，用含有1%BSA的磷酸盐缓冲液稀释为溶液配制成阴性对照；将风疹IgG抗体阳性血清经过滤除菌，灭活后，用含有1%BSA的磷酸盐缓冲液按1:200稀释，配制成阳性对照；三、样品稀释液的制备BSAlg甘油lmL吐温-20lmL二巯基乙醇0.5mLProclin300lmL用0.02M的磷酸盐缓冲液定容至1000mL，调PH至7.4四、浓縮洗涤液的制备Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL去离子水定容至1000mL，调pH至7.4使用时用去离子水稀释20倍。五、碱性磷酸酶标记抗人IgG单抗的制备用戊二醛交联法将抗人IgG单抗与碱性磷酸酶偶联在一起，对PBS充分透析，加等体积甘油，—20。C以下保存。使用时用含有1.2%Tris，0.5%BSA，0.l%Proclin300的稀释液稀释，浓度为1:1000。六、化学发光底物液的制备本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法Tris24gNaCl160gKC14gHC115mLAMPPD200mLProclin300lmL去离子水定容至1000mL，调pH值为8.09.0七、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成风疹病毒IgG抗体测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。实施例23制备本发明的风疹病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除分别以塑料珠、塑料管作为载体，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的测定试剂盒。实施例4本发明的试剂盒的使用方法1)自4t:冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。2)将试剂盒提供的20倍浓縮洗涤液用去离子水20倍稀释后，配制成应用洗涤液。3)取出包被板条，插入板架上。4)设阴性对照3孔，阳性对照2孔，每孔分别加入100uL。将样品稀释液加于孔内100uL，再将待测血清10uL加入样品稀释液中，每次实验设空白l孔。用微量震荡器充分振荡混匀，贴上封板膜，置37'C温育30分钟；5)用全自动洗板机或手工洗板5次，每孔400uL，最后在干净的吸水纸上扣干；6)除空白孔外，每孔加入酶标记物100uL，用微量震荡器充分振荡混匀，贴上封板膜，置37。C温育30分钟；7)洗板方法同5);8)每孔加化学发光底物液100uL，振荡混匀，置室温避光反应5分钟。9)必须于加化学发光底物液后的第530分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。10)结果判定根据测定标本(S)的RLU值与临界值(CUT-OFF)的比值确定。临界值(CUT-OFF)=2.1X阴性对照孔平均RLU值。若S/C0值》1，则为阳性反应，说明样本中含有风疹IgG抗体。若S/C0值〈1，则为阴性反应，说明样本中不含有风疹IgG抗体。实施例5本发明的试剂盒与其类似物交叉反应本发明试剂盒对TORCH其他四项IgG抗体阳性血清66例进行检测，其中CMV-IgG阳性血清21例、T0X-IgG阳性血清18例、HSVl-IgG阳性血清16例和HSV2-IgG阳性血清11例，检测结果如下表l表l本发明的试剂盒交叉试验的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表l检测结果可以看出，本试剂盒与其类似物无交叉，有很强的特异性。实施例6本发明的试剂盒与ELISA试剂盒对血样测值的比较本发明试剂盒与ELISA试剂盒同时检测58例风疹IgG抗体阳性血清标本和532例风疹IgG抗体阴性血清标本，两种试剂盒的检测结果分别见下表2与3:表258例阳性血清标本的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从表2可以看出，本试剂盒对阳性血清的检出率98.2%(57/58)，ELISA试剂盒对阳性血清的检出率96.5%(56/58)，可以看出本发明试剂盒对阳性血清的检出率高于ELISA试剂盒。从表3可以看出，本试剂盒对阴性血清的检出率97.4%(518/532)，ELISA试剂盒对阴性血清的检出率96.0%(511/532)，可以看出本发明试剂盒对阴性血清的检出率高于ELISA试剂盒。结果显示本试剂盒的检测结果与临床具有更高的符合率，更适用于临床推广应用，安全可靠。权利要求1.一种用于检测风疹IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒，其特征在于，包括阴、阳性对照，包被有风疹病毒抗原的固相载体，样品稀释液，碱性磷酸酶标记的抗人IgG的单抗，化学发光底物以及浓缩洗涤液。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴、阳性对照分别为正常人血清、风疹IgG抗体阳性血清经1%BSA的磷酸盐缓冲液稀释的溶液。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐温-20、0.05%二巯基乙醇、0,l%Proclin300的0.02MpH值为7.4的磷酸盐缓冲液。5、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。6、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤配制阴、阳性对照；以纯化的风疹病毒抗原包被固相载体；配制样品稀释液；用碱性磷酸酶标记抗人IgG的单抗；配制化学发光底物以及配制浓縮洗涤液；分装上述阴、阳性对照、样品稀释液、浓縮洗涤液、酶标记物和该酶所作用的化学发光底物；以及组装为成品。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阴、阳性对照分别为正常人血清、风疹IgG抗体阳性血清经1%BSA的磷酸盐缓冲液稀释的溶液。8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体采用以下方法将0.046MpH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的风疹病毒抗原混合，并将所得混合液负载于固相载体上，BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品稀释液为含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐温-20、0.05%二巯基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH值为7.4的磷酸盐缓冲液。全文摘要一种用于检测风疹IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒，包括阴、阳性对照，包被有风疹病毒抗原的固相载体，样品稀释液，碱性磷酸酶标记的抗人IgG的单抗，化学发光底物以及浓缩洗涤液。所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)配制阴、阳性对照；2)包被固相载体；3)配制样品稀释液；4)以碱性磷酸酶标记抗人IgG的单抗；5)配制化学发光底物；6)配制浓缩洗涤液；7)分装上述阴、阳性对照、样品稀释液、酶标记物、化学发光底物及浓缩洗涤液；8)组装为成品。采用本试剂盒及其制备方法，可以简便、快速、灵敏、准确地检测人血清中的风疹IgG抗体，且便于推广应用。文档编号G01N21/76GK101368959SQ20081010267公开日2009年2月18日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者唐宝军,宋胜利,应希堂,坤张,胡国茂,赵娟娟申请人:北京科美东雅生物技术有限公司