专利名称：使用激光测定酶活性的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定酶的活性的方法等。更具体地，本发明涉及使用 多光子激发过程来测定酶的活性的方法等。
背景技术：
生物化学技术已经完成了组织或细胞中酶活性的测量。首先，一 部分组织被取出以制备勻浆，或收获培养细胞以制备溶解产物。接下 来，将组织匀浆或细胞溶解产物离心分离，以制备酶活性成分。然后， 将作为酶的底物的反应物加到如此制备的酶活性成分中，并测量在底 物反应物和酶之间发生反应后生成的底物代谢物的量，从而测量酶活 性。
在比色法中，例如，使用能够通过与酶反应进行着色的底物反应 物，并确定着色的程度，从而测量酶活性。测量方法的其它例子包括 使用通过与酶进行反应发出荧光的底物反应物，并确定荧光强度，从 而测量酶活性的荧光测定法；以及使用具有在与酶反应的过程中可变 的吸收波长的底物，并确定吸收率的变化，从而测量酶活性的吸收测 定法。
日本特开第2006-34215号描述了细胞色素P450 (下文中称为 "CYP450")的制备方法，细胞色素P450是药物代谢酶的代表。除此 之外，Analytical Biochemistry 276:214-226, 1999描述了利用由该方 法等获得的CYP450来测量酶活性。另外，American Society forPharmacology and Experimental Therapeutics DMD 30:845-852， 2002和Biochemistry 45:12204-12215， 2006分别公开了通过利用使用 基因重组的微生物生产的CYP450进行酶活性测量。此外，日本专利 特开No. Hei 11-225791描述了给动物使用的药物在体内新陈代谢，并 获得动物的尿以获得CYP450的酶活性测量。
发明内容
在根据现有技术测定酶活性的方法中，需要制备组织匀浆或细胞 溶解产物以及酶活性成分，这需要麻烦的处理。除此之外，在现有技 术的方法中，需要溶解组织或细胞，因此在保持组织或细胞活着的同 时测定组织或细胞内的酶的活性非常困难。
因此，需要一种测定酶活性的方法，在该方法中，与根据现有技 术的方法相比，可以通过更简单的操作进行测量，且通过该方法，还 可以测定体内组织内或体内细胞内存在的酶的活性。
为了满足上面的需要，根据本发明的一个实施例，提供了一种测 定酶活性的方法，包括通过检测从底物或底物代谢物的多光子激发 过程生成的辐射波，来测定底物借助酶进行新陈代谢所产生的底物代 谢物的量。
优选地，酶活性的测量在这样的条件下进行底物和底物代谢物 中只有一个要通过多光子激发过程生成辐射波。
尤其是，在酶是体内酶的情况下，酶活性测量优选地通过使底物 渗透到酶所在的体内位置进行。
另外，根据本发明的另一个实施例，提供一种测定酶活性促进剂 或抑制剂的方法，包括在酶活性促进剂或抑制剂存在时，通过检测 从底物或底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波，来测定底物借 助酶进行新陈代谢所产生的底物代谢物的量。还提供一种筛选酶活性 促进剂和/或抑制剂的方法，包括在样本存在时，通过检测从底物或 底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波，来测定底物借助酶进行 新陈代谢时产生的底物代谢物的量。此外，根据本发明的还一个实施例，提供一种用于测量酶活性的
设备，至少包括激光源，用于生成用以引发底物或底物代谢物的多 光子激发过程的近红外飞秒激光束；辐射波检测单元，用于检测从底 物或底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波；以及光径，使近红 外飞秒激光束通过该光径被引入酶所在的位置，且使辐射波通过该光 径被引入辐射波检测单元。
此外，该设备可以包括用于将底物引入酶的存在位置的渗透装置。
根据本发明实施例的测定酶活性的方法尤其适用于酶是药物代 谢酶的情况。
现在，下面将给出这里使用的术语的定义。
"多光子激发过程，，的意思是一个分子同时吸收多个光子(多光子 吸收)，导致跃迁到电子第一激发态或第一激发态之上的现象。可以 通过用物镜将飞秒激光束，即脉宽处于从飞秒级到皮秒级的范围(亚 皮秒范围)内的激光束会聚到目标分子上引起多光子激发过程。这样 激发的分子在返回其原始能态时产生辐射波。通过检测辐射波，可以 观察样本中的分子。
在多光子激发过程中，通过多个光子实现激发。因此，与相关技 术中的单光子激发比较，可以使用具有较低能量的更长波长的激光。 此外，多光子激发过程只有在多个光子基本上同时到达同一分子时才 发生，因此，只在激光的焦点附近引发该过程。此外，因为使用纵深 性能极好的长波长激光，所以可以激发存在于从样本表面到深处范围 中的目标分子。
这里的术语"辐射波"指的是当已经跃迁到激发态的分子返回到 其初始能态时发出的光。"辐射波"包括荧光，且在分子是半导体时， 包括量子点、激光、太赫波等。附带地，这里的术语"反射波"与"辐 射波，，的意思不同"反射波"意味着不是基于多光子激发过程产生而 只是由样本反射的光。
根据基于本发明用于测定酶活性的方法和设备，可以通过简单的操作实现酶活性测量，还可以测定位于体内组织或体内细胞内的酶的 活性。
图l是测量皮肤组织内的酶活性的方法的示意图； 图2是测量体内细胞内的酶活性的方法的示意图； 图3是基于本发明用于测量酶活性的设备的第一实施例的框以及
图4是基于本发明用于测量酶活性的设备的第二实施例的框图。
具体实施例方式
现在，下面将参考
本发明的优选实施例。附带地，下面 的实施例仅是实现本发明的代表性例子，本发明的范围不解释为限制 到各实施例。
在基于本发明的实施例测量酶活性的方法中，通过多光子吸收来
测因底物或底一物代谢物的多光子激发过程产生的辐射波:通过该检 测，测量底物借助酶进行新陈代谢产生的底物代谢物的量，从而评估 酶活性。
在只有底物和底物代谢物其中之一通过多光子激发过程生成辐 射波的条件下执行上述测量。
更具体地，例如，在只有底物代谢物通过多光子激发过程生成辐 射波的条件下进行测量时，通过检测因底物代谢物的多光子激发过程 产生的辐射波，来测量借助作为测量对象的酶的活性从底物生成的底 物代谢物的量。在这种情况下，在预定时间过去之后辐射波的强度越 高，通过酶促新陈代谢生成的底物代谢物的量越大，因此，酶活性越
这里，酶活性(K)可以用下面的公式(1)表示
F。)/(r —r。〗 …(i)其中，a是修正因数，To是测量开始时间，T是测量开始后的预 定时间，F。是在时刻To测量的辐射波的值，且Ft是在时刻T测量的 辐射波的值。
类似地，在只有底物通过多光子激发过程生成辐射波的条件下进 行测量时，根据因底物的多光子激发过程发出的辐射波的减少来计算 借助作为测量对象的酶的活性从底物产生的底物代谢物的量。在这种 情况下，在预定时间过去之后辐射波的强度越低，借助酶进行新陈代 谢的底物的量越大，因此，产生的底物代谢物的量越大，即，酶的活 性越高。
作为底物，使用作为测量对象的酶或酶组专用的底物。这样可以 与很多其它酶的活性区分开，只测量作为测量对象的酶的活性。当使 用包括多种酶的酶组共用的底物(该底物不是该酶組中的酶之外的其 它酶的底物)时，可以将酶组的酶活性作为整体进行测量。
按照需要，根据用作测量对象的酶的功能，从化学物质、脂类 (lipids)、氨基酸、肽(peptides)、蛋白质、核酸等中选择底物。 当前一般使用的标签底物(底物反应物)的例子包括DFH: (3-hydroxy-5,5-dimethyl國4-(4誦methylsulfonylphenyl)國(5H)-furan-2-one), DFB:(3，4-difluorobenzyloxy)國5，5-dimethyl画4-(4國methylsulfonylphenyl) 國(5H)-furan-2-one) 和 DFP:3-(Isopropoxy)誦5，5-dimethyl画4-(4誦 methylsulfonylphenyl)-5H-furan-2-one。这些标签反应物也可以在本 发明中使用。
现在，用作为药物代谢酶的代表的细胞色素P450 (下文中称为 "CYP450")作为要测量的对象酶，更详细地说明根据本发明实施例 的测量酶活性的方法。
CYP450是由包括多个分子类型的基因家族组成的基因超家族。 每个家族，例如CYP1家族，包括分子类型CYP1A1、 CYP1A2以及 CYP1B1。关于人类，已经报导了总共大约50种分子类型。各分子类 型分别具有不同的底物特异性。例如，已知CYP1A2催化咖啡因的 N-脱乙基作用，且CYP1B1催化17-p-雌二醇的第4位羟基化。CYP450的底物包括苯巴比妥和其它一些药物。例如，能用作 CYP1A2的底物的药物包括例如盐酸阿密曲替林、盐酸丙咪唤、盐 酸羟甲金霉素、盐酸米安色林的抗抑郁剂，例如盐酸美西律、盐酸普 萘洛尔、盐酸普罗帕酮的抗心率失常制剂等。
以这种方式，CPY450的分子类型具有各自专门的底物。因此， 通过根据与用作酶活性测量对象的给定分子类型相关的底物特征来 设计和选择底物，可以明确地测量分子类型的活性。在CYP2C9的情 况下，例如，MFC: (7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin)可以被用作 底物。这里，MFC本身不发荧光，但是当CYP2C9使其新陈代谢成 为HFC: (7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin)时,其发荧光。
另外，当使用多个分子类型共用的特定底物时，可以测量一组分 子类型(酶组)的酶活性。
为了引起底物或底物代谢物的多光子激发过程，使用具有飞秒级 到皮秒级范围(亚皮秒范围)内的脉冲带宽的飞秒激光束。作为激光 束，使用锁模激光束，以便实现刚提到的脉冲宽度。对于锁模激光器， 采用钛蓝宝石或掺铒光纤激光介质等。
近红外飞秒激光束(下文中也简称为"激光束")具有650 ~ 1100nm的波长，且根据用于测量的底物和底物代谢物的吸收波长在 该范围内适当选择该波长。更具体地说，在830nm波长的情况下，例 如，脉冲宽度不大于200fs，且重复频率是80MHz。除此之外，输出 稳定性大约是±0.5,且平均光束输出是大约2W。
通过使用聚光透镜(物镜)，近红外飞秒激光束被聚集在作为测 量对象的酶、底物和底物代谢物所在的焦点上。作为聚光透镜，使用 对红外线透明的透镜。透镜的放大率不受特别限制，且可以适当地为 大约20~40 (倍)。
在焦点(酶存在处)的附近，底物或底物代谢物同时吸收来自聚 集的激光束的多个光子，从而实现多光子激发过程。从而，已经跃迁 到激发状态的底物或底物代谢物在返回到其原始能量状态时生成辐 射波。通过检测辐射波，可以测量底物借助酶进行新陈代谢生成的底物代谢物的量。
用这样的方法进行辐射波的检测用聚光透镜将底物或底物代谢 物的多光子激发过程发出的辐射波聚集并引至光电转换元件。光电转 换元件检测辐射波，并将波的强度转换为电数据，并将该数据输出到 与之相连的计算机。
要作为测量对象的酶可以包括任何种类的酶。在体外的条件下，
的酶活性组分。另外，也可以使用已经被隔离并净化的酶，以及功能 未知且要被检测来确定其中指定的酶活性存在或不存在的蛋白质。这 种测量的对象被加到含有底物的緩沖剂，以产生酶反应，且緩冲剂中 的底物或底物代谢物受到多光子激发，从而测量酶活性。附带地，根 据本发明实施例测量酶活性的方法不仅可以用于体外条件下的测量， 还可以用于对存在于在体内组织或体内细胞内的酶的测量(在体内条 件下的测量)。稍后详细说明在体内条件下的酶活性的测量。
在执行测量中，不仅可以将酶和底物，也可以将酶活性促进剂或 抑制剂加入緩冲剂，从而可以估计酶活性促进剂或抑制剂的酶活性促 进或抑制活性。
除此之外，不仅可以将酶和底物，也可以将用作酶活性促进剂或 抑制剂的候选化合物(样本)加入緩沖剂，从而可以估计样本是否具 有酶活性促进或抑制活性。这允许针对指定的酶筛选活性促进剂或抑制剂。
在这种情况下，酶活性促进或抑制活性(S)可以用下面的公式 (2)表示
<formula>formula see original document page 9</formula>...(2)
其中，a和b是校正因数，To是测量开始时间，T是测量开始之 后的预定时间，F。是在时刻T。测量的辐射波的值，Ft是在没有酶活 性促进剂或抑制剂时在时刻T测量的辐射波的值，且F山是存在酶活 性促进剂或抑制剂时在时刻T测量的辐射波的值。
现在，将在下面说明在体内条件下酶活性的测量。近红外飞秒激光束的特征在于与用于根据相关技术的单光子激发的激光束相比， 具有更长波长和更低能量。另外，因为激发是在近红外飞秒激光束的 情况下由多个光子引起的，所以只有焦点附近的分子可以被激发。因 此，由近红外飞秒激光束进行的多光子激发提供高的深度到达性能 (纵深性能)。此外，其有利于抑制样本中在焦点之外的其它位置处 发生荧光光漂白或损伤，而可以进行长时间测量。
考虑到这些优点，可以将通过利用多光子激发过程测量酶活性的 方法视为用于在体内组织内或体内细胞内测量酶活性的最佳方法。高 的纵深性能可以实现的特征意味着可以测量存在于体内组织的内部 (深处)的体内酶的活性。此外，可以抑制样本中在焦点之外的其它 位置处发生荧光光漂白或损伤的特征使得可以长时间进行实时测量， 而不损害组织或细胞(即，以非侵害的方式)。因此，根据通过利用 多光子激发过程来测量酶活性的方法，可以直接测量存在于体内组织 或体内细胞内的酶的活性，而不需制备组织匀浆或细胞溶解产物，而 在根据相关技术的方法中则必须制备。
现在，以皮肤作为体内组织的例子，在下面说明基于本发明实施 例的执行测量酶活性的方法的具体方法。图l是测量皮肤组织中酶活 性的方法的示意图。
在图1中，附图标记Ai表示表皮，A2表示真皮，且A3表示皮 下组织。构成测量位置的皮肤希望是表面平滑、没有毛发且表皮薄的 皮肤位置。例如，优选前臂从肘后到手腕的范围中的皮肤位置。选择 这种位置确保可以避免激光束在体内表面被吸收或散射，且可以有效 检测到辐射波。另外，当将水、油等涂覆到皮肤表面，以便避免激光 束在体内表面上散射时，可以进一步增强测量精度。
在图中，聚光透镜28a将近红外飞秒激光束(在图中用虚线示出) 聚集到位于真皮A2处且作为用于测量的对象酶所在的位置的一个点 (焦点)上。在这种情况下，近红外飞秒激光束被皮肤组织中的水或 血液很少吸收且被组织很少散射，且呈现高纵深性能。
在测量期间，测量位置被遮蔽，以便排除环境光的透过。照射的激光束特别地引起具有在xy平面中大约500nm的直径且沿z轴方向 大约lmm大小的纺锤区中的激发(在图中，由虛线围起的椭圆形区 域)。与聚光透镜28a的工作距离相对应，激发发生在(距皮肤表面) 5mm的深度。
测量位置被涂上用作活性测量对象的酶专用的底物。这样涂上的 底物透过皮肤组织并透入组织细胞，被引入到酶存在的位置。例如， 在测量上面提到的CYP2C9的酶活性的情况下，将MFC (7-Methoxy-trifluoromethylcoumarin)以大约2.5 |iM的浓度溶解在 DMSO(二甲基亚砜)中，并将溶液涂在表皮上。此外，可以采用这 样的方法使底物从由图1中的附图标记5所示的渗透装置持续不断 地或间歇地渗透到测量位置。渗透装置5不仅包括图中所示渗透部分 52，还包括用于给渗透部分52提供底物溶液的液体供给线、主体等。 稍后将详细说明渗透装置5。
虽然下面将说明CYP2C9被用作测量的对象酶且MFC被用作底 物的情况，但酶和底物不限于这些。可以使用酶和专用于该酶的底物 的任何组合。
当渗透到CYP2C9所在的皮肤位置时，MFC与CYP2C9反应， 从而新陈4戈谢为HFC ( 7-Hydroxytrifluoromethylcoumarin )。通过 检测从HFC的多光子激发过程产生的辐射波(在这种情况下，荧光) 来测量HFC的量。在上面提到的公式(1)中，To是恰在MFC被施 用到测量位置前的时刻(测量开始时间)，T是在MFC施用后过去 的时间，F。是在时刻To测量到的荧光值(在没有将任何东西涂到测 量位置的情况下的荧光值)，且Ft是时刻T测定的荧光值。
以MFC被施用到测量位置的时间为基准，以例如5分钟为间隔 进行荧光强度的实时测量。为了检测来自HFC的荧光，使用具有 520nm的中心波长和50nm的波长范围的滤光器。
这使得可以实现对存在于真皮A2中的CYP2C9的酶活性的实时 测量。在这种情况下，对皮肤的侵害相当轻，使得可以在很少伤害皮 肤的情况下长时间进行实时测量。此外，在期望检查CYP2C9的酶活性促进剂或抑制剂的酶活性 促进或抑制活性的情况下，与MFC的方式相同，将酶活性促进剂或 抑制剂施用到测量位置。此外，通过使用渗透装置5，可以使得酶活 性促进剂或抑制剂渗透到测量位置。
可以使得MFC以及酶活性促进剂或抑制剂混合地渗透或单独地 渗透。在使用渗透装置5使MFC以及酶活性促进剂或抑制剂单独渗 透的情况下，需要两个渗透装置5， 一个用于MFC, —个用于促进剂 或抑制剂；因此，两个渗透装置5被放置在测量位置的附近的表皮 A丄
至于将底物和酶活性促进剂或抑制剂施用到测量位置的顺序，优 选地在底物之前首先施用酶活性促进剂或抑制剂。在这种情况下，将 恰在施用底物前的时间假设为T。(测量开始时间)(参考上述公式 (2))。
在不同的测量位置，重复测量Ft (在酶活性促进剂或抑制剂不存 在时在时刻T测量的辐射波的值)和Ftb (在酶活性促进剂或抑制剂 存在时在时刻T测量的辐射波的值)。例如，在从肘后到手腕的前臂 部分的情况下，期望在尽可能一致的测量条件下重复测量，例如，在 互相隔开几厘米的位置上重复测量。
此外，在筛选CYP2C9的酶活性促进剂或抑制剂的情况下，用 与上面相同的方式，将每个候选化合物(样本)施用到测量位置或使 用渗透装置5使其渗透到测量位置。此外，以与上面相同的方式，可 以使MFC和样本混合地或单独地渗透。
现在以皮肤作为体内组织的例子具体说明测量的对象酶是 CYP2C9的情况。虽然已描述了作为测量对象的皮肤部分是真皮A2 的情况，但是例如，可以测量由图中的附图标记B表示的皮脂腺组织 中的酶活性。此外，本发明实施例中能够构成测量对象的体内组织的 例子不仅包括皮肤，还包括指曱、耳朵、指尖、嘴唇、视网膜、毛发 等。此外，可以应用的体内组织不局限于暴露于身体表面的这些组织， 还包括例如肝脏、脑、肾、肌肉等的内脏。为了测量内脏组织中的酶活性，利用光纤将激光束引至内脏中的测量位置，并使辐射波会聚。 在内窥镜检查或开腹手术等时，使用光纤进行的测量被认为可用于患 病部分(手术部分)的组织中酶活性的测量。
图2是测量体内细胞内酶活性的方法的示意图。 在图2中，附图标记C表示培养的细胞。在图中，培养的细胞C 被示出处于Petri培养亚的培养状态中。培养细胞的器皿没有特别限
制；不仅可以使用Petri培养皿，而且可以使用烧瓶、腔式玻片等， 只要器皿的材料对激光束是透明的。
在图中，用聚光透镜28a将近红外飞秒激光束(在图中用虛线表 示)会聚到培养的细胞C，细胞C是要测量的对象酶所在的位置。在 这种情况下，通过将激光束会聚到例如核子、线粒体、高尔基体等特 定的细胞内的细胞器官，可以测量存在于这种细胞内的细胞器官中的 酶的活性。在测量期间，进行光遮蔽，以防止透进环境光。
在进行测量时，将专用于用作测量对象的酶的底物添加到培养溶 液。这样添加的底物渗透到培养的细胞中，且其被引入酶所在的位置。 例如，在测量上面提到的CYP2C9的酶活性的情况下，将MFC (7國Methoxy-trifluoromethylcoumain )以大约5 的浓度溶解在 DMSO(二甲基亚砜)中，并将溶液添加到培养的细胞。此外，在使 用细胞质膜渗透性低的底物的情况下，可以使用例如微量注射的技术 将底物引入培养的细胞。
当期望检查CYP2C的酶活性促进剂或抑制剂的酶活性促进或抑 制活性时，以与MFC相同的方式，将促进剂或抑制剂添加到培养溶 液。在这种情况下，MFC以及酶活性促进剂或抑制剂可以混合地或 单独地添加。
此外，在筛选CYP2C9的酶活性促进剂或抑制剂的情况下，将 候选化合物(样本)添加到培养溶液。在本例中，以与上面相同的方 式，可以混合或单独地添加MFC和样本。
现在，将在下面说明根据本发明实施例的测量酶活性的设备。图 3是示出第一实施例的方框图。根据本发明实施例的用于测量酶活性的设备的基本结构可以通过转向已知的近红外多光子激发正立显微 镜的系统来获得。现在，下面将基于附图详细说明该结构。
在图3中，附图标记ll表示能够以近红外脉沖振荡的激光束源。 从激光束源11发出的激光束(图中用虚线表示)透射穿过用于控制 激光束直径的激光束直径控制器21，并由用于对样本4进行激光束扫 描的电镜(Galvano mirror) 22反射。
随后，激光束进入分束器23，分束器23包括使用二向色滤光片 (dichroic filter)、分色镜(dichroic mirror)等的光学系统。用于 本实施例中的带通滤波器24使激光束透射过去，同时朝稍后说明的 CCD照相机单元32反射从被来自光源61的、波长为600 ~ 950nm的 光辐射的样本4而来的反射波(在图中用虚线表示)。
将透射穿过带通滤波器24的激光束引至分束器25。与分束器23 一样，分束器25包括使用二向色滤光片、分色镜等的光学系统。用 于该实施例的分色镜26使来自激光束源11的激光束透射过去。另外， 分色镜26从来自样本4的辐射波选择特定的波长，将所选择的波长 的波反射到稍后说明的辐射波检测单元31,并同时透射反射波使其射 向分束器23。
透射穿过分色镜26的激光束被安装到焦点控制机构27的聚光透 镜28a会聚到样本4中的焦点4a上。这里使用的聚光透镜28a、激光 束直径控制器21、带通滤波器24以及分色镜26对红外线是透明的。 这也适用于其它滤光器，除非另外说明。此外，聚光透镜28a的放大 率不特别限制，适当地为大约20~40 (倍)。
这样会聚的激光束引发焦点4a处的底物和底物代谢物的多光子 激发过程。聚光透镜28a被安装在焦点控制机构27中，使得其沿图 中的垂直(高度)方向的位置可以被控制。这确保样本4中的焦点4a 在垂直(深度)方向的位置可以被控制。
另外，聚光透镜28a还用于会聚从焦点4a产生的辐射波和反射 波(在图中，两种波分别由点划线和点线表示)，以分别将波引至辐 射波检测单元31和CCD照相机单元32。在被会聚的辐射波中，首先，用分色镜26反射特定的波长。被反射的辐射波进一步透射穿过短通 滤波器29，被引至辐射波检测单元31。附带提及，短通滤波器29具 有拦截不小于特定波长的波分量的特征。
辐射波检测单元31具有选择性地接收特定波长的功能，且使用 至少一个这样的辐射波检测单元31。辐射波检测单元31包括用于检 测辐射波的光电转换元件。用于存储并处理从光电转换元件发送的数 据的计算机(未示出)连接到辐射波检测单元31。光电转换元件检测 辐射波，将辐射波的强度转换为电数据，并将该数据输出到与之连接 的计算机。根据该数据(辐射波的测量值)，通过使用上述公式(1) 计算酶活性(K)。
如上所述，根据本发明实施例的用于测量酶活性的设备包括激光 束源11、辐射波检测单元31以及光径，其中，激光束通过该光径被 引至样本4中酶所在的位置，且通过该路径辐射波被引至辐射波检测 单元31。这里，"光径"至少包括电镜22、分束器25以及聚光透镜 28a。
另外，如图3中所示，光径可以包括用于将反射波从样本4引至 用于检测反射波的CCD照相机单元32的分束器23。由聚光透镜28a 会聚且透射穿过分束器25的分色镜26的反射波(在图中用点线表示) 被分束器23的带通滤波器24反射，且被引至CCD照相机单元32。 附带地，长通滤波器33被设置在CCD照相机单元32前面。长通滤 波器33具有拦截不大于特定波长的波分量的特征。
图像显示装置(未示出)被连接到CCD照相机单元32。这确保 通过使用以顶置式照明系统进行照明的普通白光源61，可以在通过 (在红外区也具有灵敏度的)CCD照相机单元32和图像显示装置在 监视器上检查样本的同时确定激光束辐射的位置。因为CCD照相机 单元32在红外区也有灵敏度，所以在样本4是皮肤的情况下，例如， 皮下部分(样本4的内部)也可以利用红外线穿过皮肤的渗透性进行 观察。顶置式照明系统包括由图中的附图标记61表示的光源、由附 图标记71表示的光束直径控制器以及由附图标记72表示的长通滤波器。附带地，在图中省略了从光源61向下照射到样本4的顶置式照 明光。
用作激光束源的近红外飞秒激光束具有650 ~ 1100 nm的波长， 且在根据用来测量的底物和底物代谢物的吸收波长的范围中适当地 选择波长。更具体地说，在波长是830nm的情况下，例如，脉宽不大 于200fs，且重复频率是80MHz。此外，输出稳定性大约是土0.5，且 平均束输出是大约2W。
在这种情况下，例如，由辐射波检测单元31检测到的辐射波具 有500~600nm的波长(荧光)，而由CCD照相机单元32检测到的 反射波的波长是600 ~ 950nm。
在辐射波检测单元31检测到的辐射波的波长和激光束的波长根 据从用于测量的底物和底物代谢物的多光子激发过程产生的辐射波 的波长而变。要使用的带通滤波器24、分色镜26以及短通滤波器29 的特征根据与测量相关的底物和底物代谢物进行最优选择。
样本4的例子包括各种体表的组织，例如皮肤、指甲、耳朵、 指尖、嘴唇、视网膜以及毛发(此外，见图1)。此外，在样本4是 培养的细胞的情况下，也可以测量体内细胞内的酶活性，如图2中所 示。
另外，特别在样本4是体内组织例如皮肤的情况下，可以采用这 样的配置除了上面所述的部件之外，用于测量酶活性的设备配有渗 透装置5，且使底物、酶活性促进剂或抑制剂以及样本渗透到酶所在 的测量位置。
渗透装置5包括主体51、渗透部分52以及液体供给线53。主体 51具有用于保留底物溶液的贮液器，且底物溶液通过液体供给线53 被输送到渗透部分52。渗透部分52被设置在测量位置的附近，使得 从主体53输送而来的底物溶液渗透到酶所在的位置。另外，在酶活 性促进剂等的溶液进行渗透的情况下也使用渗透装置5。在这种情况 下，多个渗透部分52和多个液体供给线53被连接到主体51，并用作 分别输送酶活性促进剂或抑制剂溶液等。主体51设置有用于控制输送到渗透部分52的底物溶液等的剂量 的阀54。液体供给线53通过阀54连接到主体51。阀54允许底物溶 液等以分别受控的剂量连续不断地或间歇地被输送。
作为主体51，可以使用具有普通泵功能的装置。另外，主体51 被期望设置有可以控制底物溶液等的量的机构，例如阀54。此外，使 渗透部分52与体内组织例如皮肤接触，该体内组织被底物溶液等弄 湿，因此期望具有溶液不被蒸发的设置。具体地，优选使用微量分析 仪。
图4是示出基于本发明的用于测量酶活性的设备的第二实施例 的框图。在该图中，激光束、辐射波和反射波被部分简化。
图4中所示用于测量酶活性的设备具有用于传送激光束、辐射波 和反射波的光纤28c。用于测量酶活性的设备适用于样本4是例如肝 脏、脑、肾、肌肉等的内脏的情况。设计设备，使得激光束可以通过 光纤28c传播，以被辐射到这样的内脏。
从激光束源11发射的激光束透射穿过分束器25的分色镜26， 然后被聚光透镜28b引至光纤28c，并通过光纤28c传送到聚光透镜 (物镜)28a。随后，聚光透镜28a将激光束会聚到样本4中的焦点 4a上，以引发底物和底物代谢物的多光子激发过程。
由于底物和底物代谢物的多光子激发过程从焦点4a生成的辐射 波(以及反射波)被聚光透镜28a会聚，并通过光纤28c传播，以引 至辐射波检测单元31和CCD照相机单元32。
期望内脏组织中酶活性的测量在内窥镜检查或开腹手术等时刻 进行。因此，希望聚光透镜28a和光纤28c尽可能小。
最后，将对作为本发明实施例中测量对象的酶进行说明。用于测 量的对象酶没有特别限制，如上所述，可以包括在体外条件下和体内 条件下的多种酶中的任一个。从组织匀浆和细胞溶解产物制备的酶活 性部分、被隔离并净化的酶、功能未知且要被检查其中存在或不存在 酶活性的蛋白质等也可以作为这里要测量的对象。
测量的对象的尤其优选的例子包括药物代谢酶。药物代谢酶是能够使体内的各种化学物质进行新陈代谢的酶组，例如CPY450、 N-乙 酰转移酶(NAT-2)、甲基转移酶(TPMT)等。
已知例如药效和副作用的药物反应包括个体差异和种族差异。因 此，取决于患者，可能出现不期望的副作用，或可能由于不足的剂量 而不能获得期望的药效。考虑到此，近年来，进行了实现根据疾病的 情况和患者的体质选择合适药物的所谓量体用药(tailor-made medicine)的努力，以便产生最好的治疗效果。
药物反应的个体差异的主要原因之一是药物代谢酶的遗传多样 性现象。关于药物代谢酶观察到的遗传多样性现象直接影响与药物的 新陈代谢和其动力学相关的酶的活性，并与个体的药物反应具有密切 关系。
最近，关于遗传多样性现象和药物反应之间关系，通过收集大量 病历进行了大规模的基因分析。至于作为代表性的药物代谢酶的 CYP450，使用DNA微阵列技术的遗传多样性现象决定技术已经开始 实际使用，且酶活性和遗传多样性现象之间的关系正被阐明。
根据基于本发明实施例的用于测量酶活性的方法和设备，体内组 织内的药物代谢酶的活性可以被直接测量，而无需这种基于DNA的 分析。因此，可以更简单和快捷地掌握关于单个患者的药物代谢酶的 活性的特性特征。例如，如果医生可以准确地估计在诊断或外科手术 时存在于患病部分的组织中的CYP450的活性，则在开药方时对于发 现副作用的风险和确定合适的剂量有用。
根据本发明实施例的用于测量酶活性的方法和设备可以在例如 制药研究和开发、药理测试、安全测试等领域中，被用于体内组织或 体内细胞内酶活性的测量。另外，该方法和设备也可以被用于质量检 查，用于检查酶的活性是否被表达为期望的程度，例如，在通过特定 酶的基因操作获得的转基因动物或细胞株中。
此外，基于本发明实施例的用于测量酶活性的方法和设备允许医 生掌握单个患者中的酶活性的特性以估计药物代谢能力等，并开出合
适的一种或多种药物，从而实现所谓的量体用药。本领域的技术人员应当理解，取决于设计需要和其它因素，可能 发生各种变型、合并、子合并以及改变，只要它们落在所附权利要求 书或其等同物的范围内。
权利要求
1.一种测定酶活性的方法，包括测定底物借助酶进行新陈代谢所产生的底物代谢物的量，所述测定是通过检测从所述底物或所述底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波而进行的。
2. 根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所 述方法在以下条件下进行所述底物和所述底物代谢物中只有一个通 过所述多光子激发过程生成所述辐射波。
3. 根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所 述酶是体内酶，且所述底物被渗透到所述酶所在的体内位置。
4. 根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所 述酶是药物代谢酶。
5. —种测定酶活性促进剂或抑制剂的方法，包括测定在所述生的底物代谢物的量，所述测定是通过检测从所述底物或所述底物代 谢物的多光子激发过程生成的辐射波而进行的。
6. —种筛选酶活性促进剂和/或抑制剂的方法，包括在样本存 在的情况下，测定底物借助酶进行新陈代谢所产生的底物代谢物的过程生成的辐射波而进行的。
7. —种用于测定酶活性的设备，包括激光源，用于生成用以引发底物或底物代谢物的多光子激发过程 的近红外飞秒激光束；辐射波检测单元，用于检测从所述底物或底物代谢物的所述多光 子激发过程生成的辐射波；以及光径，使所述近红外飞秒激光束通过该光径被引入所述酶的存在 位置，且使所述辐射波通过该光径被引入所述辐射波检测单元。
8. 根据权利要求7所述的用于测定酶活性的设备，其特征在于， 还包括用于将所述底物引入所述酶的所述存在位置的渗透装置。
全文摘要
本发明涉及一种使用激光测定酶活性的方法和设备。该测定酶活性的方法包括通过检测从底物或底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波，测定底物借助酶进行新陈代谢所产生的底物代谢物的量。
文档编号G01N21/63GK101315332SQ20081010930
公开日2008年12月3日 申请日期2008年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者大西通博, 岸本拓哉, 渡边英俊 申请人:索尼株式会社