专利名称：亚氨基二乙酸的液相分析方法
技术领域：
本发明涉及亚氨基二乙酸的液相分析方法。(二) 背景技术亚氨基二乙酸(IDA)是一种比较重要的化工原料，常用作络合剂和 表面活性剂，常用于用于有机合成，也是草甘膦(Glyphosate)生产的重 要中间体。目前亚氨基二乙酸常用的分析方法有碱直接滴定法，离子交换树脂 法，紫外分光光度法和色谱法。由于亚氨基二乙酸是有机二元酸，采用碱 直接滴定法测定的是样品中所有酸(包括单酸)的含量，准确度比较差； 离子交换树脂法由于分离、洗脱程度难掌握，所以结果的重现性比较差； 紫外分光光度法需要铁明矾与IDA先生成配合物再进行检测，方法比较 繁瑣；亚氨基二乙酸本身没有紫外吸收基团，常规的液相方法只能在 210nm下进行检测，受到的末端吸收的干扰比较大。(三) 发明内容本发明的目的在于克服常规液相末端吸收干扰的缺陷，提供一种吸收 干扰小、灵敏度高的亚氨基二乙酸液相分析方法。 本发明采用的技术方案是亚氨基二乙酸的液相分析方法，所述方法包括(1)配制不同浓度 的亚氨基二乙酸标准溶液，各自加入足量2,4-二硝基氟苯于进行反应，反 应结束后对反应液进行液相色谱分析，以DNB-亚氨基二乙酸峰面积对应 二乙酸浓度绘制标准曲线；(2)取含有亚氨基二乙酸的待测溶液，加入
足量2,4-二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行液相色谱分析，根据DNB-亚氨基二乙酸的峰面积，对照步骤(1)获得的标准曲线，得到待测溶液的亚氨基二乙酸浓度数据。本发明对亚氨基二乙酸进行衍生化,在其氨基上引入二硝基苯基团增加吸收波长，其反应原理如下式所示进一步，所述方法如下(1) 配制不同浓度的亚氨基二乙酸标准溶液，各自加入足量2,4-二硝 基氟苯于40~70°C、避光条件下反应20 40min,反应结束后对 反应液进行液相色谱分析，以DNB-亚氨基二乙酸峰面积为纵坐 标、亚氨基二乙酸浓度为横坐标，绘制标准曲线；(2) 取含有亚氨基二乙酸的待测溶液，加入足量2,4-二硝基氟苯于 40 70°C、避光条件下反应20 40min,反应结束后对反应液进行 液相色谱分析，根据待测DNB-亚氨基二乙酸的峰面积，对照步 骤(1)获得的标准曲线，获得待测溶液的亚氨基二乙酸浓度数 据。优选的，所述方法如下 (1)配制不同浓度的亚氨基二乙酸标准溶液，取l体积份的标准溶液， 各自加入10体积份的0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、4体积份的体 积浓度1~10%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和10体积份的蒸馏水， 在40 70。C下避光反应20~40min后，再加75体积份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH为6~8的磷酸盐緩冲液，得到的混合液进行液相色HOOCH CCH COOH
谱分析，以DNB-亚氨基二乙酸峰面积为纵坐标、亚氨基二乙酸浓度为横坐标，绘制标准曲线；(2)取含有亚氨基二乙酸的待测溶液1体积份，加入10体积份的0.1 ~lmol/L的NaHC03溶液、4体积份的体积浓度1 10%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和10体积份的蒸馏水，在40 ~ 70。C下避光反应20 ~40min后，再加75体积份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH为6 ~ 8的磷酸盐緩冲液，得到的混合液进行液相色谱分析，根据待测DNB-亚氨基二乙酸的峰面积，对照步骤(1 )获得的标准曲线，获得待测溶液的亚氨基二乙酸浓度数据。 为保证所测数据的准确性，在一个完整的从标准曲线绘制到待测溶液浓度测定的过程中，对于不同浓度的标准溶液和待测溶液，其测定过程中 各步骤参数应完全相同。所测待测溶液浓度需在所绘制标准曲线浓度范围内，测得数据才是准 确的，若待测溶液浓度超出标准曲线的浓度范围，则有可能不符合其线性 关系，此时可将待测溶液稀释或者浓缩之后进行^r测，直至所测得浓度在 标准曲线浓度范围内为止。本发明采用的方案是1、 衍生化试剂的配置取1 ~ 10mL 2,4-二硝基氟苯溶于乙腈中配成100 mL溶液。2、 书f生化反应取0.1 ~ 0.5 mL样品，加0.5 ~ 2mL 0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、 O.l-lmL配好的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和0.5~2mL蒸馏水，在 40 ~ 70。C下避光反应20 ~ 40min后，再加5 ~ 20mL 0.1 ~ 0.5mol/L pH 为6 — 8的碌酸緩冲液。3、 色谱条件色i普柱Elite C18色i普片主(250nm x 4.6 nm);流动相甲醇乙酸-乙酸钠水溶液(曱醇与乙酸-乙酸钠水溶液 体积比为55: 45,乙酸、乙酸钠物质的量浓度均为0.05mol/L);流 速0.5 ~ 1.5mL/min;检测波长为300 ~ 400nm;柱温20~40°C;4、 本发明的仪器设备曰本岛津公司10A vp液相色谱配置SPD-10A紫外检测器以及 分析仪器配备的HPLC色谱工作站； 本发明原材料规格如下 曱醇、乙腈(色谱纯) 2,4-二硝基氟苯、乙酸、乙酸钠(分析纯) 本发明的有益效果主要体现在本发明方法准确、重现性好、灵敏度 高，可用于生物催化水解亚氨基二乙腈生产草甘膦中间体亚氨基二乙酸的 产物分析，也还可以用于其他亚氨基二乙酸生产过程的分析。(四)
图1为亚氨基二乙酸标准曲线图；图2为衍生后得到的DNB-亚氨基二乙酸以及衍生化试剂的色谱峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围 并不仅限于此实施例1:亚氨基二乙酸标准曲线绘制精确配制2、 4、 6、 8、 10mg/mL的亚氨基二乙酸标准溶液，取标准液O.lmL各自加入l.OmL lmol/L的NaHC03溶液、0.4mL配好的2，4-二 硝基氟苯乙腈溶液(体积浓度6% )和l.OmL蒸馏水，在60。C下避光反应 30min后，再力口 7.5mL 0.2mol/L pH为7.0的磷酸盐緩冲液，用针头过滤 器过滤，取滤液按所选的色谱条件Elite Cl8色谱柱，流动相曱醇 O.05mol/L乙酸-乙酸钠溶液(曱醇与乙酸-乙酸钠溶液体积比55: 45), 流速1.0mL/min,进样10 |i L进行液相色谱分析。以DNB-亚氨基二乙 酸峰面积为自变量，亚氨基二乙酸浓度(mg/mL)为应变量，得到标准曲 线形图如图1所示，其线形R"直为0.9990,色谱图如图2所示。实施例2:亚氨基二乙酸样品浓度确定准确称取0.5008g亚氨基二乙酸样品溶解于lOOmL水中，取该样品 0.2mL采用2mL lmol/L的NaHC03溶液、0.8mL配好的2,4-二硝基氟苯 乙腈溶液(体积浓度1% )和2mL蒸馏水，在70°C下避光反应40min后， 再加15mL 0.2mol/L pH为7.5的磷酸緩沖液。用针头过滤器过滤。按所 选的色谱条件Elite C18色谱柱，流动相曱醇0.05mol/L乙酸-乙酸 钠溶液(曱醇与乙酸-乙酸钠溶液体积比55: 45 )，流速0.8mL/min。 进样10pL进行液相色谱分析，测得亚氨基二乙酸的浓度为0.5001%。实施例3:生物转化6h后转化液中亚氨基二乙酸样品浓度确定配制种子培养基醋酸铵1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%, MgS04 0.02%, FeS04 0.003%， NaCl 0.1%,用2M的盐酸或2M的氢氧化钠将pH 调节到7.5。配制发酵培养基醋@吏铵1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%， MgS04 0.02%, FeS04 0.003%, NaC10.1%，用2M的盐酸或2M的氢氧化钠将pH
调节到7.5。上述培养基组成以质量体积百分比表示，某物质浓度1%表示100mL 培养基中含有lg该物质。在5L种子罐中装入3L的种子培养基，灭菌后接入粪产碱杆菌 (1咖證/脏幽)CCTCCNo: M 208168菌种菌液(该菌种已作为 新菌种另案申请)，接种量5。/。(v/v)，在温度30。C，搅拌转速200rpm的 条件下培养24h,得到种子液；在50L的发酵罐中装入发酵培养基30L,实罐消毒后接入1.8L的种 子液，在通气比0.3: 1 (每分钟内通过的空气体积与培养液体积之比)， 搅拌转速150rpm,罐压0.05Mpa,温度30。C的条件下，在培养到lh时开 始时加入90g的正丁腈作为诱导剂，培养到6h时，将转化液离心取上清 液0.15mL采用1.5mL lmol/L的NaHC03溶液、0.6mL配好的2,4-二硝基 氟苯乙腈溶液(体积浓度2% )和1.5mL蒸馏水，在70。C下避光反应40min 后，再加11.25mL0.2mol/LpH为7.5的磷酸緩沖液。用针头过滤器过滤。 按所选的色谱条件Elite C18色谱柱，流动相曱醇0.05mol/L乙酸-乙酸钠溶液(曱醇与乙酸-乙酸钠溶液体积比55: 45 ),流速1.2mL/min。 进样10fiL进行液相色谱分析，测得亚氨基二乙酸的浓度为0.6845%。实施例4:生物转化3h后转化液中亚氨基二乙酸样品浓度确定。配制种子培养基醋酸铵1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%, MgS04 0.02%， FeS04 0.003%， NaCl 0.1%,用2M的盐酸或2M的氪氧化钠将pH 调节到7.5。配制发酵培养基醋酸4妄1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%， MgS04 0.02%, FeS04 0.003%, NaC10.1%,用2M的盐酸或2M的氢氧化钠将pH
调节到7.5。上述培养基组成以质量体积百分比表示，某物质浓度1%表示100mL 培养基中含有lg该物质。在5L种子罐中装入3L的种子培养基，灭菌后接入粪产碱杆菌 U/ca//ge"^/aec"/z;y )CCTCC No: M 208168菌种菌液，接种量5%( v/v )， 在温度30。C,搅拌转速200rpm的条件下培养24h，得到种子液；在50L的发酵罐中装入发酵培养基30L，实罐消毒后接入1.8L的种 子液，在通气比0.3: 1，搅拌转速150rpm,罐压0.05Mpa,温度30。C的 条件下，在培养到lh时开始时加入90g的正丁腈作为诱导剂，培养到3h 时，将转化液离心取上清液O.lmL采用l.OmL lmol/L的NaHC03溶液、 0.4mL配好的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液(体积浓度3% )和l.OmL蒸馏水， 在60。C下避光反应-30min后，再加7.5mL 0.2mol/L pH为7.0的磷酸緩沖 液。用针头过滤器过滤。按所选的色谱条件Elite C18色谱柱，流动相 曱醇0.05mol/L乙酸-乙酸钠溶液(曱醇与乙酸-乙酸钠溶液体积比55: 45),流速1.0mL/min。进样20pL进行液相色谱分析，测得亚氨基二 乙酸的浓度为0.3775%。
权利要求
1. 亚氨基二乙酸的液相分析方法，所述方法包括(1)配制不同浓度的亚氨基二乙酸标准溶液，各自加入足量2，4-二硝基氟苯于进行反应，反应结束后对反应液进行液相色谱分析，以DNB-亚氨基二乙酸峰面积对应亚氨基二乙酸浓度绘制标准曲线；(2)取含有亚氨基二乙酸的待测溶液，加入足量2，4-二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行液相色谱分析，根据DNB-亚氨基二乙酸的峰面积，对照步骤(1)获得的标准曲线，得到待测溶液的亚氨基二乙酸浓度数据。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 配制不同浓度的亚氨基二乙酸标准溶液，各自加入足量2,4-二硝 基氟苯于40 70。C、避光条件下反应20 40min,反应结束后对反 应液进行液相色谱分析，以DNB-亚氨基二乙酸峰面积为纵坐标、 亚氨基二乙酸浓度为横坐标，绘制标准曲线；(2) 取含有亚氨基二乙酸的待测溶液，加入足量2,4-二硝基氟苯于 40 70°C、避光条件下反应20 40min,反应结束后对反应液进行 液相色谱分析，根据待测DNB-亚氨基二乙酸的峰面积，对照步 骤(1)获得的标准曲线，获得待测溶液的亚氨基二乙酸浓度数 据。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )配制不同浓度的亚氨基二乙酸标准溶液，取1体积份的标准溶液， 各自加入10体积份的0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、4体积份的 体积浓度1 10%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和10体积份的蒸馏 水，在40 ~ 70。C下避光反应20 ~ 40min后，再加75体积份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH为6-8的磷酸盐緩沖液，得到的混合液进行液相色谱分析，以DNB-亚氨基二乙酸峰面积为纵坐标、亚氨基二乙 酸浓度为横坐标，绘制标准曲线； (2)取含有亚氨基二乙酸的待测溶液1体积份，加入10体积份的0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、4体积份的体积浓度1 10%的2,4-二硝 基氟苯乙腈溶液和10体积份的蒸馏水，在40 ~ 70°C下避光反应 20 ~ 40min后，再加75体积份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH为6 ~ 8的 磷酸盐緩沖液，得到的混合液进行液相色谱分析，根据待测DNB-亚氨基二乙酸的峰面积，对照步骤(1)获得的标准曲线，获得 待测溶液的亚氨基二乙酸浓度数据。 4.如权利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所述液相色谱条件如下色i普柱Elite Cl8色谱柱；流动相曱醇乙酸-乙酸钠i^液；流速0.5 ~ 1.5mL/min; 4企测波长为300 ~ 400nm;柱温20~40°C。
全文摘要
本发明提供了一种亚氨基二乙酸的液相分析方法，所述方法包括(1)配制不同浓度的亚氨基二乙酸标准溶液，加入足量2，4-二硝基氟苯于进行反应，反应结束后对反应液进行液相色谱分析，以DNB-亚氨基二乙酸峰面积对应亚氨基二乙酸浓度绘制标准曲线；(2)取含有亚氨基二乙酸的待测溶液，加入足量2，4-二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行液相色谱分析，根据DNB-亚氨基二乙酸的峰面积，对照步骤(1)获得的标准曲线，得到待测溶液的亚氨基二乙酸浓度数据。本发明方法准确、重现性好、灵敏度高，可用于生物催化水解亚氨基二乙腈生产草甘膦中间体亚氨基二乙酸的产物分析，也还可以用于其他亚氨基二乙酸生产过程的分析。
文档编号G01N30/00GK101398413SQ200810122190
公开日2009年4月1日 申请日期2008年11月10日 优先权日2008年11月10日
发明者徐建妙, 柳志强, 沈寅初, 郑裕国 申请人:浙江工业大学