专利名称：一种高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法
技术领域：
本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，具体涉及一种产蔗糖异构酶(SIase)的微生物菌株的选育方法。
背景技术：
蔗糖异构酶是一类重要的葡萄糖基转移酶，它是制备功能性糖醇-异麦芽酮糖醇的关键酶。异麦芽酮糖醇(Isomalt)是近年来国际上新兴的功能性糖醇，具有低能量、低吸收、防龋齿性能，可供糖尿病人群和减肥人士食用，食用安全性高，更值得一提的是异麦芽酮糖醇拥有极低的吸湿性和纯正的口味，这是木糖醇和麦芽糖醇等其他功能糖醇难实现的。由于这些特点，异麦芽酮糖醇成为目前最受欢迎的蔗糖替代品。
异麦芽酮糖醇生产分两步，第一步是由蔗糖异构酶EC 5.4.99.11(Sucrose isomerase)，或叫异麦芽酮糖合成酶(Isomaltulose syntheses)，蔗糖葡萄糖基变位酶(Sucroseglucosylmutase)，α-葡糖基转移酶(α-glucosyltransferase)催化蔗糖生成异麦芽酮糖，第二步是异麦芽酮糖在催化剂作用下氢化为异麦芽酮糖醇。已知有一些菌种能产生蔗糖异构酶。美国专利4,390,627描述了从Protaminobacter rubrum(红色精朊杆菌)固定蔗糖变位酶生产异麦芽酮糖的方法。美国专利4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici，Protaminobacter rubrum，Serratia plymuthica(粘质沙雷氏菌)的固定化菌体生产异麦芽酮糖的过程，大约可以转化70-95％蔗糖。美国专利4,857,461公开了从Protaminobacterrubrum，Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶连续生产异麦芽酮糖的过程。美国专利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用Agrobacterium radiobacter(放射性土壤杆菌)的固定化菌体生产海藻酮糖和异麦芽酮糖的过程，异麦芽酮糖占10％以下。
虽然上述几种细菌能够把蔗糖转变成异麦芽酮糖，但产量很不稳定，转化率为8～85％。而且，除了主产物外，酶转化液中还存在部分海藻酮糖和少量的异麦芽糖、异松三糖、葡萄糖和果糖等副产物，一般异麦芽酮糖与海藻酮糖的比例为3∶1～5∶1。产物特异性不高，一方面降低了目的产物的收率，另一方面使下游过程变得十分困难，生产成本大大增加。因此目前，异麦芽酮糖醇制备工艺的瓶颈主要在于蔗糖异构酶催化制备异麦芽酮糖这一过程。
值得关注的是副产物海藻酮糖和异麦芽酮糖性质类似，也是一种新型甜味剂。因此筛选获得主产海藻酮糖的蔗糖异构酶产生菌，对进一步开发新型甜味剂市场同样也具有积极的意义。
筛选能够高效生产蔗糖异构酶的菌株，在提高SIase酶活的同时，研究影响SIase产物特异性的内在因素并改善SIase产物特异性，对异麦芽酮糖及其糖醇的工业生产以及开发新型甜味剂具有重要意义。然而微生物菌株的筛选是一项繁重的工作，常规的筛选方法工作量很大，需要消耗大量的人力物力，筛选周期很长，而且往往得不到目的菌株，筛选的盲目性很大，因此建立一个高效、快速、微量、准确的筛选方法是提高蔗糖异构酶酶活、改善其产物特异性的关键。
微孔板是一类在生物工程领域常用的实验器皿，六十年代中期，微量培养板在临床化学中是作为大容积试管的小巧微型替代物而被开发出来的，近年来已经成功地被用作自动搜索活性成分的可靠平台，主要用于PCR扩增、酶标仪检测、biolog鉴定系统等，常用规格有48孔板、96孔板、384孔板等，未见将微孔板应用于菌株筛选的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种方便快捷的高通量筛选方法，以筛选出高活力、高产物特异性的蔗糖异构酶生产菌株。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下 一种高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤 1、微培养 将待筛选的蔗糖异构酶生产菌(如经过化学诱变的菌株或基因改造的工程菌)接入含有培养基的微孔板I中，25～35℃，转速100～200rpm，振荡培养8～20h。
2、酶转化 将微孔板I离心去除上清液，每孔加入0.1～2mL，50～500g/L的蔗糖溶液进行酶转化反应。
3、初筛 转化结束后，微孔板I离心，将微孔板I中每孔的上清液稀释50～100倍后依次转移至另一微孔板II中。向微孔板II中加入显色试剂，如DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)，将微孔板II置于沸水浴中反应5分钟，DNS与还原糖发生氧化还原反应，生成的3-氨基-5-硝基水扬酸在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，根据这个原理弃去颜色浅的即总转化率低的菌株。然后利用分光光度计检测显色较深的菌株转化液的吸光值，选择转化率提高10％以上的菌株进行复筛。
4、复筛 将初筛后得到的菌株在摇瓶(或摇管)中培养，加入50～500g/L蔗糖溶液，蔗糖溶液的加入量为10～100mL/g湿菌，进行酶转化反应，转化液点薄层色谱(TLC)，色谱条件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，显色剂苯胺-二苯胺-磷酸。异麦芽酮糖和海藻酮糖在此条件下显色不同，根据色斑颜色的深浅及斑点的大小筛选高产异麦芽酮糖或高产海藻酮糖的菌株(斑点越大、颜色越深，表明异麦芽酮糖或海藻酮糖的含量越多)。
对筛选出来的高产异麦芽酮糖或高产海藻酮糖的菌株的转化液进行高效液相色谱定量检测，确定菌株的异麦芽酮糖或海藻酮糖产量。色谱条件Agilent1200型HPLC，示差折光检测器(Shodex R101)，色谱柱为Shodex SP0810，流动相为纯水，流速为0.8mL/min，柱温为80℃。该法可同时检测异麦芽酮糖或海藻酮糖的浓度。
其中，步骤2或步骤3中所述的离心条件为使用酶标板离心机，5000～10000rpm，10～30min。
本发明的有益效果本发明介绍了一种高活力、高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的筛选方法，综合微培养板培养方式、酶学反应的性质(微孔板快速检测)及薄层色谱复筛法，建立了简便、高效的高通量筛选方法。该筛选方法利用直观的显色反应，以及酶标板微培养、连续加样器和排枪的作用，可达到每人200样/日以上的处理量，为高产物特异性蔗糖异构酶产生菌的筛选提供了简便、高效、微量的筛选方法。
图1为本发明的高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法的流程图。
具体实施例方式 实施例1筛选高产异麦芽酮糖的菌株。
将蔗糖异构酶产生菌培养至对数生长期，离心收集菌体制成菌悬液(约108个)，加入化学诱变剂硫酸二乙酯原液0.2ml，30℃，150rpm振荡培养30min后终止反应，用磷酸钾缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)洗涤两次，离心后取不同的稀释度涂布平板，置30℃培养箱中培养。共获得410株单菌落。
将单菌落接入含有液体培养基的96孔板中，30℃，转速120rpm，振荡培养12h。
将96孔板离心，去除上清液，每孔加入1mL、100g/L的蔗糖溶液进行转化。
转化结束后离心取上清液，依次稀释50倍后，各取100uL转至另一96孔板中，加等体积的无菌水和DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)，在沸水浴中充分反应5分钟，弃去颜色浅的即总转化率低的菌株，初筛工作在一天内完成，得到总转化率较好的菌株112株。然后利用分光光度计检测这112株转化液的吸光值，选取55株总转化率提高10％以上的菌株进行摇瓶复筛。
将初筛后得到的菌株在摇瓶中培养，加入100g/L蔗糖溶液5mL进行酶转化反应，转化液点薄层色谱(TLC)，色谱条件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，显色剂苯胺-二苯胺-磷酸。在此条件下，异麦芽酮糖显绿色而海藻酮糖显红色，根据色斑颜色的深浅及斑点的大小，筛选获得高产异麦芽酮糖或海藻酮糖的菌株19株，其中目的菌株即高产异麦芽酮糖的菌株11株。
最后对11株菌株进行液相色谱定量检测，Agilent1200型HPLC，示差折光检测器(Shodex R101)，色谱柱为Shodex SP0810，流动相为纯水，流速为0.8mL/min，柱温为80℃。最终获得产生异麦芽酮糖∶海藻酮糖大于8∶1的菌株6株。整个筛选工作共计5天。实施例2筛选高产海藻酮糖的菌株。
设计一对引物，正向引物5′-TTAAGCTTCCATGGATTCTCAAGGATT-3′ 反向引物5′-TTGGATCCCTCGAGCGGATTAAGTTTATAAATG-3′ 通过PCR扩增反应(PCR扩增条件95℃，3min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，5min，共30个循环)得到Erwinia rhapontici NCPPB1579中的蔗糖异构酶基因，经过Nco I和Xho I双酶切后，与载体PET-22b连接，得到重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，构建正确表达蔗糖异构酶的基因工程菌，通过与其他菌属的蔗糖异构酶基因进行比对，并参考相关文献，利用快速定点突变试剂盒(TAKALA)对该蔗糖异构酶基因的多个保守序列进行随机突变，然后在大肠杆菌DH5α中表达，得到有酶活的菌株317株。
将单菌落接入含有液体培养基的96孔板中，35℃，转速200rpm，振荡培养20h。
将96孔板离心，去除上清液，每孔加入0.2mL、500g/L的蔗糖溶液进行转化。
转化结束后离心取上清液，依次稀释100倍后，各取50uL转至另一96孔板中，加等体积的无菌水和DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)，在沸水浴中充分反应5分钟，弃去颜色浅的即总转化率低的菌株，初筛工作在一天内完成，得到总转化率较好的菌株98株。然后利用分光光度计检测这98株转化液的吸光值，选取48株总转化率提高10％以上的菌株进行摇瓶复筛。
将初筛后得到的菌株在摇管中培养，加入500g/L蔗糖溶液2mL进行酶转化反应，转化液点薄层色谱(TLC)，色谱条件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，显色剂苯胺-二苯胺-磷酸。在此条件下，异麦芽酮糖显绿色而海藻酮糖显红色，根据色斑颜色的深浅及斑点的大小，筛选获得高产异麦芽酮糖或海藻酮糖的菌株15株，其中目的菌株即高产海藻酮糖的菌株7株。
最后对7株菌株进行液相色谱定量检测，色谱条件Agilent1200型HPLC，示差折光检测器(Shodex R101)，色谱柱为Shodex SP0810，流动相为纯水，流速为0.8mL/min，柱温为80℃。最终获得产生海藻酮糖∶异麦芽酮糖大于8∶1的菌株3株。整个筛选工作共计5天。
权利要求
1、一种高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤
(1)将待筛选的蔗糖异构酶生产菌接入含有培养基的微孔板I中，振荡培养；
(2)将微孔板I离心去除上清液，加入蔗糖溶液进行酶转化反应；
(3)转化结束后，微孔板I离心，将微孔板I中每孔的上清液稀释后依次转移至微孔板II中，向微孔板II中加入显色试剂，并检测吸光值，筛选出蔗糖异构酶高产菌株；
(4)将蔗糖异构酶高产菌株放大培养，加入蔗糖溶液进行酶转化反应，用薄层色谱检测蔗糖转化液中的产物比例，得到高产异麦芽酮糖的菌株或高产海藻酮糖的菌株。
2、根据权利要求1所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(1)中所述的振荡培养条件为25～35℃，转速100～200rpm，振荡培养8～20h。
3、根据权利要求1所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(2)或步骤(3)中所述的离心条件为使用酶标板离心机，5000～10000rpm，10～30min。
4、根据权利要求1所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(3)中所述的显色试剂为DNS试剂。
5、根据权利要求1所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(3)中筛选出的蔗糖异构酶高产菌株为转化率提高10％以上的菌株。
6、根据权利要求1所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(2)或步骤(4)中所述的蔗糖溶液浓度为50～500g/L。
7、根据权利要求6所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(2)中蔗糖溶液每孔加入量为0.1～2mL。
8、根据权利要求6所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(4)中蔗糖溶液的加入量为10～100mL/g湿菌。
9、根据权利要求1所述的高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于步骤(4)中所述的菌株放大培养为摇瓶培养或摇管培养。
全文摘要
本发明公开了一种高活力高产物特异性蔗糖异构酶生产菌株的高通量筛选方法，即将待筛选的蔗糖异构酶生产菌接入含有培养基的微孔板中振荡培养，离心去除上清液，加入蔗糖溶液进行酶转化反应，反应结束后，将每孔的上清液依次转移至另一微孔板中，加入显色试剂，并检测吸光值，筛选出蔗糖异构酶高产菌株再进行摇瓶复筛，利用薄层色谱筛选产物特异性较好的菌株，最终得到高产异麦芽酮糖的菌株或高产海藻酮糖的菌株。该筛选方法利用直观的显色反应，以及酶标板微培养、连续加样器和排枪的作用，可达到每人200样/日以上的处理量，为高产物特异性蔗糖异构酶产生菌的筛选提供了简便、高效、微量的筛选方法。
文档编号G01N30/36GK101289687SQ20081012384
公开日2008年10月22日 申请日期2008年6月10日 优先权日2008年6月10日
发明者虹 徐, 莎 李, 环民霞, 贲 任, 冯小海, 恒 蔡, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学