专利名称：白菜霜霉孢子囊的离体繁殖与活性荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域中一种专性寄主菌白菜霜霉孢子囊的离体繁殖方法与活性快速 检测方法。
技术背景大白菜是人们喜爱的大众化蔬菜，现占长江中下游大中城市蔬菜复种面积的30-40%，北 方也大量引种栽培，近年来，东南亚、日、美及欧洲一些国家也广泛引种，己逐渐成为世界 性蔬菜[侯喜林.不结球白菜育种研究新进展.南京农业大学学报，2003， 26(4):111-115]。霜霉 病是中国大白菜(份"OT'ca戸fe'"e"^Rupr.)的主要病害之一，该病害是由鞭毛菌亚门，卵菌 纲，霜霉科，白菜霜霉菌(尸era"仍/wraPers. Fr)侵染引起的一种气传病害，也是 十字花科蔬菜的重要病害，主要危害白菜、青菜、萝卜、油菜、甘蓝、芥菜等。世界各地均 有发生，危害严重，有时导致绝收[王神云，曹家树.芜菁霜霉病离体接种方法初报.江苏农业 科学,2006， (6): 165-167]。白菜霜霉病从苗期到包心期或种株开花到结荚期均可发病，主要危 害子叶、真叶、花及种荚。苗期发病致子叶或嫩茎变黄枯死，成株期发病多于叶背面，初生 水浸状斑点，水浸状斑点在湿度大或有露水时长出白色霉状物(似盐霜状)或形成多角形病 斑。发病重时，病斑增多相连，使叶片变黄干枯，受害叶片大多从边叶外向内叶发展，发病 重的植株不能包心。采种株的茎顶及花梗染病后，多肥肿畸形，种荚染病也会导致不同程度 的变形，表面生白色霉状物，结实不良[李怀方主编.园艺植物病理学(华南本).北京中国农 业出版社，2001， 127-129;赖传雅主编.农业植物病理学(华南本).北京科学出版社，2003， 359-362]。霜霉病病株率一般20%-30%，重病田可达100%，流行年份可减产50%以上。霜霉 病菌以菌丝体及卵孢子在土壤或病株残体越夏、越冬，成为初次侵染源，或以孢子囊及游动 孢子借气流或雨水传播侵染，而田间植株发病后，环境条件适宜时，病部可全日释放孢子囊， 并浮动于大气中，通过气流传播，造成重复侵染。[邵小花，陈全庆，张繁琴.大白菜霜霉病与 若干生态因子的关系.上海农业学报，19卯,6(3):78-81]。为了减轻病害的发生，长期施用农药 不仅污染环境，破坏生态平衡，也严重威胁人们的身体健康，而且白菜霜霉菌具有世代短、 产孢量大的特点，容易产生抗药性[刘爱媛.链霉素对几种卵菌的抑制作用.植物保护学报， 2001, 28(3): 254-258]。因此选育和利用抗病品种是防治该病较为经济有效的方法[李明远.十 字花科蔬菜霜霉病的发生与防治.当代蔬菜，2004(8): 38-39]。白菜霜霉菌是一种专性寄生菌，只能在活体上成活，目前尚不能在人工培养基上生长，因此大白菜抗病研究和菌种离体繁殖甚为不便[Slusarenko A J, Schlaich N. Downy mildew of 爿ra6/cto戸、//zor//awa caused by场a/qperaMayjpora戸ra础ca (formerly Pera"cwpora戸ra础ca). Mo/ecw/ar P/a加尸aAo/ogy， 2003, 4(4): 159-170]，人工接种是抗病育种和对种质资源进行抗病 评价以及防治效果评价的重要工具，离体接种法在葡萄、丝瓜、黄瓜霜霉病等病害上都有应 用报道[汤钿.葡萄霜霉病离体接种方法的研究.微生物学通报，1994, 21(6): 373;谢大森，徐 春香.丝瓜霜霉病菌人工接种技术研究初报.广西农业大学学报，1998, 17(3): 254-258;刘西 莉，朱书生，李健强等. 一种黄瓜霜霉病菌菌株的保存方法.专利公开号:CN 1693447A]，但还 没有关于大白菜霜霉病离体接种繁殖的相关报道。崔铁军等(1994)发现向R葵霜霉病的菌丝和孢子囊有自体荧光现象，死亡的菌丝体具 有特征性的自体荧光，活的菌丝体没有该现象，以及后来在其它霜霉属真菌上也观察到此现 象，因此认为霜霉属真菌在特定波长的光激发下发生的自体荧光现象与其活性如菌丝体产孢 活性、孢子囊萌发活性等具有相关性。[崔铁军等.向日葵霜霉病种子带菌的荧光检验法.1994, 植物病理学报，24(2): 127-128;商鸿生等.霍尔斯单轴霉的自体荧光现象.1994， 13 (4):317-318]，所以可以将自体荧光现象用来作为霜霉属真菌孢子囊活性检测的手段。 发明内容针对上述情况，本发明的目的是提供简单、便捷、有效的白菜霜霉孢子囊离体繁殖和活 性快速荧光检测方法。具体技术方案如下白菜霜霉孢子囊的离体繁殖与活性荧光检测方法，该方法包括下列步骤(1) 白菜霜霉孢子囊离体繁殖方法① 接种体的制备，② 离体叶柄接种与培养，③ 孢子囊萌发的观察；(2) 白菜霜霉孢子囊活性荧光检测方法① 孢子囊悬浮液的制备，② 孢子囊自体荧光的观察，③ 孢子囊活性的确定。 接种体的制备是用用消毒软毛笔蘸取无菌水将病叶背部霜霉病病斑霉层刷入小烧杯无菌水中，干净纱布过滤后制备孢子囊悬浮液。离体叶柄接种与培养是用健康白菜中部叶片的叶柄切割成纵向10cm左右横向4cm左右 的片段，在切口处接种孢子囊悬浮液，然后将其置于15'C生物培养箱黑暗中培养。孢子囊荧光的自体观察结果是，如果无自体荧光或荧光极淡，说明孢子囊具有活性，反 之，如果孢子囊发出亮蓝色自体荧光，说明活性丧失。(见图4、 5)。还包括白菜霜霉孢子囊的离体繁殖与活性荧光检测方法在繁殖和检测白菜霜霉方面的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果是，提供了一种简单、便捷、有效的白菜霜霉菌孢 子囊离体繁殖方法，可使孢子囊大量繁殖，获得大量的新鲜霉菌，同时根据霜霉属真菌具有 的自体荧光现象与其活性如菌丝体产孢活性、孢子囊萌发活性等具有相关性的原理，提供了 一种快速、简便的白菜霜霉菌孢子囊活性的荧光检测方法。本发明为霜霉菌等专性寄生性很 强的病菌的离体繁殖和孢子囊活性检测提供了一条新途径，将为大白菜抗病育种和种质资源 抗病评价以及防治效果评价奠定技术基础，具有较高的实际利用价值。下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步的详述。
图l:白菜霜霉孢子囊的萌发形成单芽管； 图2:白菜霜霉孢子囊的萌发形成2个芽管；图3:白菜霜霉孢子囊的萌发形成孢囊梗，并以二叉式分枝产生新的孢子囊； 图4:新鲜白菜霜霉孢子囊荧光观察； 图5:死亡白菜霜霉孢子囊自体荧光观察。
具体实施方式
实施例l:白菜霜霉孢子囊离体繁殖方法(1) 接种体的制备每年十一月份从田间采集新鲜的大白菜霜霉病病叶，用0. 1%升汞水表面消毒，再用无菌水冲洗干净，置于15'C下消毒光照培养箱中黑暗下保湿培养，待病斑上产生孢子囊后通过显 微镜观察菌丝及孢子囊的形态从而确定从田间采得的病叶培养后得到的病原菌接种液为白菜 霜霉病菌。用消毒软毛笔蘸取无菌水将经保湿培养的病叶叶背部霜霉病病斑霉层刷入小烧杯 无菌水中，干净纱布过滤后制备孢子囊悬浮液。(2) 离体叶柄接种与培养取健康无病白菜，剥去外层叶片，用消毒刀片将白菜中部叶片的叶柄切割成纵向为lOcm 左右横向为4cm左右的片段，用无菌水多次冲洗干净后放置于铺有3层吸水纸直径为18cm 的培养皿中，用毛笔蘸取孢子囊悬浮液将病菌接种于叶柄片段的切口上，在无菌箱中晾干后， 将培养皿置于15'C生物培养箱黑暗中培养。每天进行观察，7-8天就可以观察到在切口处或 叶柄背部长出由孢子囊和孢囊梗构成的白色霉层。(3)孢子囊萌发的观察吸取新鲜孢子囊悬浮液5mL于试管中，轻轻在手掌上拍动数次，以使孢子囊脱离孢囊梗， 更加分散。因高浓度的孢子囊能产生抑制萌发的物质，故悬浮液浓度为每100X视野中有3-5 个孢子囊即可。将试管放置于l(TC培养箱中光照条件下培养，每隔24小时吸取少量悬浮液， 制片，在显微镜下观察。在l(TC下培养数小时后就有孢子囊开始萌发，24小时内可达到最高萌发率。在可见光的 视野中，新鲜孢子囊形态饱满，圆形或椭圆形，内容物透明均匀，孢子囊以多种形态进行萌 发① 孢子囊萌发形成一个芽管，萌发形成的芽管的长度最长可达孢子囊直径的IO倍以上(见 图1)。② 孢子囊萌发形成两个或多个芽管(见图2)。③ 孢子囊萌发形成孢囊梗，并以二叉式分枝产生新的孢子囊，二叉式分枝有l-4次。新鲜 霉层形成4-5天后，在相对湿度较大的情况下，病组织上的孢子囊可以在孢囊梗着生状态下 进行萌发，在二叉式分枝的末端形成新的孢子囊(见图3)。实施例2:白菜霜霉孢子囊活性荧光检测方法(1) 孢子囊悬浮液的制备 待白菜叶柄切口处或叶柄背部长出由孢子囊和孢囊梗构成的白色霉层，立即用经消毒灭菌的毛笔将新长出的孢子囊刷入无菌水中，获得白菜霜霉的新鲜孢子囊悬浮液。将保存一年 以上的病叶干标本上的霉层制备成孢子囊悬浮液。(2) 孢子囊自体荧光的观察吸取少量悬浮液制玻片，用荧光显微镜观察。采用的荧光显微镜为OPTON， Axioskop型 落射式荧光显微镜，50W超高气压汞灯，紫外激发，阻挡滤光片为02型紫外光激发的滤光 片组。(3) 孢子囊活性的确定在荧光视野中，新鲜孢子囊无自体荧光或荧光极淡，在目镜肉眼不易观察到荧光，在150 万像素摄像监视器上可看见孢子囊轮廓(见图4)。长期存放的病组织的孢子囊，孢子囊发出 亮蓝色自体荧光，目镜肉眼和监视器屏幕上都可以明显观察到(见图5)。
权利要求
1、白菜霜霉孢子囊的离体繁殖与活性荧光检测方法，其特征是，该方法包括下列步骤(1)白菜霜霉孢子囊离体繁殖方法①接种体的制备，②离体叶柄接种与培养，③孢子囊萌发的观察；(2)白菜霜霉孢子囊活性荧光检测方法①孢子囊悬浮液的制备，②孢子囊自体荧光的观察，③孢子囊活性的确定。
2、 权利要求l所述的白菜霜霉孢子囊离体繁殖与活性荧光检测方法，其特征是，用消毒 软毛笔蘸取无菌水将病叶背部霜霉病病斑霉层刷入小烧杯无菌水中，干净纱布过滤后制备孢 子囊悬浮液。
3、 权利要求l所述的白菜霜霉孢子囊离体繁殖与活性荧光检测方法，其特征是，是用健 康白菜中部叶片的叶柄切割成纵向10cm左右横向4cm左右的片段，在切口处接种孢子囊悬 浮液，然后将其置于15'C生物培养箱黑暗中培养。
4、 权利要求l所述的白菜霜霉孢子囊离体繁殖与活性荧光检测方法，其特征是，孢子囊 荧光的自体观察结果是，如果无自体荧光或荧光极淡，说明孢子囊具有活性，反之，如果孢 子囊发出亮蓝色自体荧光，说明活性丧失。
5、 白菜霜霉孢子囊的离体繁殖与活性荧光检测方法在繁殖和检测白菜霜霉方面的应用。
全文摘要
本发明提供白菜霜霉孢子囊的离体繁殖与活性荧光检测方法。属于菌种繁育和活性检测领域。该方法将健康白菜中部叶片的叶柄切割成10cm×4cm左右片段，切口处接种孢子囊悬浮液，置于15℃生物培养箱黑暗中培养。荧光显微镜观察白菜霜霉的新鲜孢子囊，如果无自体荧光或荧光极淡，说明孢子囊具有活性，如果发出亮蓝色自体荧光，说明活性丧失。本发明提供了一种简单、便捷、有效的白菜霜霉孢子囊离体繁殖方法和一种白菜霜霉孢子囊活性的快速荧光检测方法，为大白菜抗病育种和种质资源抗病评价以及防治效果评价奠定技术基础，具有较高实际利用价值。
文档编号G01N21/76GK101402919SQ20081015176
公开日2009年4月8日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者刘跃庭, 崔铁军, 芳 廖, 罗加凤, 郭京泽, 黄国明 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心