专利名称：：一种乳及乳制品中卵磷脂含量检测的前处理方法
技术领域：
：本发明涉及一种乳及乳制品中磷脂含量的检测方法，特别涉及一种乳及乳制品中卵磷脂含量检测的前处理方法。
背景技术：
：卵磷脂被誉为与蛋白质、维生素并列的"三大营养素"。卵磷脂是生命的基础物质，人类生命自始至终都离不开它的滋养和保护。卵磷脂存在于每个细胞之中，更多的是集中在脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官。目前很多功能性乳制品添加各种卵磷脂以强化营养或增加速溶度。但关于乳制品中卵磷脂含量的检测方法很有限，不能满足实际需求，不能很好的评价产品质量。国家标准中现在还没有关于乳制品中卵磷脂含量的标准检测方法。《食品中磷脂测定方法的探讨》(李树立、鞠国全、李会旋、刘增然、庞津霞，食品工业科技，2004年第25巻第9期，133-134页)公开了一种利用三氯甲烷-甲醇溶剂提取食品中磷脂，经强酸消化后利用比色法检测磷含量，再折算为磷脂含量的方法。该法证明使用三氯甲垸-甲醇溶剂提取磷脂与使用乙醚、石油醚的方法提取磷脂相比具有较高的回收率。然而，经过实验证实，该方法的样品前处理方法应用于乳制品中抽提卵磷脂不够完全且步骤繁琐，仍然有需要改进之处。
发明内容本发明的目的是提供一种乳及乳制品中卵磷脂含量检测的前处理方法，其提取卵磷脂充分完全，检测回收率高，并且成本低廉。本发明提供了一种乳及乳制品中卵磷脂含量检测的前处理方法，包括如下步骤1)向所述乳或乳制品的样品中加入三氯甲烷-甲醇溶剂；2)过滤步骤l)所得溶液，用三氯甲垸-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液；3)除去所述滤液中的溶剂，得到粗脂肪；4)消化所述粗脂肪，至所得消化液无色透明，得到待测液；其中，上述步骤1)中，样品中加入三氯甲垸-甲醇溶剂后，在不断摇动下浸泡12-36小时，优选浸泡24小时。优选的，所述三氯甲烷-甲醇溶剂中三氯甲垸与甲醇的比例为2:(0.5-2)，更优选为2:1。所述三氯甲垸-甲醇溶剂的加入体积(mL)为所述样品重量(g)的6-10倍，优选8倍。所述样品的取样量为10.0-15.0g，优选为12.0-13.0g。本领域技术人员应该理解，实际分析实验操作中，样品称量往往需要更加精确，例如，分析天平可以精确至千分之一克。同时在称量时也会存在误差，只要取样量在上述数值附近，例如通过四舍五入能够达到上述数值，都应被理解为在上述范围之内。优选的，上述步骤3)中，将所述滤液置于65-75'C水浴中挥发除去溶剂。所述消化粗脂肪的方法为使用强酸湿法消化，包括如下步骤向所述粗脂肪中加几粒玻璃珠，加浓硫酸和浓硝酸各10ml，缓慢加热消化；加10ml浓硝酸，然后放置在电热板上加热反应。待反应结束后取下，稍冷却，再加入10ml高氯酸，重新放置电热板上加热反应，此时应把温度调低些。若消化液变黑，需取下再加入10ml浓硝酸后继续消化，直到消化液变成无色或淡黄色,且冒出白烟，在消化液剩下3-5ml时取下，冷却，转入50ml容量瓶中，加水定容，得到待测液。经上述前处理方法处理之后，用比色法对上述待测液进行检测，步骤如下A)制作磷标准曲线精确吸取磷贮备液O，2.5，7.5，10，15ml,分别于50ml容量瓶中，加显色剂定容后磷的浓度分别为0，2.5，7.5，10，15ug/ml。分别加入少量水，加入2滴二硝基酚指示剂，用6mol/LNaOH调至黄色，用0.2mol/LHNO3调至无色，用0.1mol/LNaOH调至微黄色，加入5.00ml钒钼酸铵试剂，用水定容至刻度。25-30。C下显色15分钟，用lcm光径比色皿，在440mn测定其吸光值，以吸光值为纵坐标，磷含量为横坐标绘制曲线或计算回归方程。B)检测待测溶液中的磷含量吸取5ml待测液于25ml容量瓶中，加入少量水,加入2滴二硝基酚指示剂，用6mol/LNaOH调至黄色，用0.2mol/LHNO3调至无色，用0.1mol/LNaOH调至微黄色，加入5.00ml钒钼酸胺试剂，用水定容至刻度。25-3(TC下显色15分钟，用lcm光径比色皿，在440nm测定其吸光值，与标准曲线比对，计算磷含量。计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中P:样品中脂类磷含量，mg/100g;C:从标准曲线中査得的比色液中磷的浓度，Ug/ml;V:样液体积，ml;A:样液稀释倍数；M:样品的质量，g。C)结果计算740.53卵磷脂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中P:样品中脂类磷含量，mg/100g;740.53/30.97:由磷换算为卵磷脂的系数。本发明的前处理方法得到的待测溶液除上述比色法外，还可以应用于液相色谱法、重量法等。本发明的前处理方法使用直接浸泡的方法可以减少人工及成本的投入；长时浸泡且浸泡时在摇床上不断振摇，能够使脂类充分完全的被提取，其卵磷脂加标回收率达90%以上，与现有提取方法的检测结果相比，加标回收率提高了2倍。同时，本发明的方法不需要配备昂贵设备，成本低廉，操作简便，可以应用于多种磷脂检测方法。具体实施例方式本发明的实施方式意在解释发明，而不是限制本发明的保护范围，本领域任何普通技术人员都应该能够清楚地知道和理解，按照说明书中公开的比例范围是可以完整无误地实施本发明的，任何在因为牛乳乳源的不同和实验误差范围内的检测数值上的略微差别不应该作为本发明检测结果不同的理由。本发明旨在保护利用三氯甲烷-甲醇溶剂提取乳及乳制品中卵磷脂的前处理方法，而不是要将各数值特别严格地限定在某一个具体的数值上。实施例l:乳粉中的卵磷脂含量检测的前处理方法检测乳粉中卵磷脂的含量，其样品前处理方法包括如下步骤1)准确称取两份不同的乳粉样品(各约12.5g，具体称量值参见下表)，编号为乳粉1和乳粉2，做平行试验，每份样品按照后续步骤进行操作。加入100ml三氯甲烷-甲醇(体积比2:1)溶剂，放置在摇床上不断摇动，室温浸泡24小时。2)用滤纸过滤于250ml三角瓶中，用三氯甲垸-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液。3)将获得的滤液置于65-75X:水浴中蒸干挥发，除去溶剂，得到粗脂肪。4)消化粗脂肪，得到待测液在装有上述粗脂肪的容器中加几粒玻璃珠，向粗脂肪中加浓硫酸和浓硝酸各10ml，缓慢加热消化，不要产生剧烈喷溅；加10ml浓硝酸，然后放置在电热板上加热反应。待反应结束后取下，稍冷却，再加入10ml高氯酸，重新放置电热板上加热反应，此时把温度调低些。若消化液变黑，需取下再加入10ml浓硝酸后继续消化，直到消化液变成无色或淡黄色，且冒出白烟，在消化液剩下3-5ml时取下，冷却，定量地转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到待测液。同时做空白。利用比色法检测上述待测液，方法如下1、试剂1.1二硝基酚指示剂(2g/L)称取0.2g2，6-二硝基酚或2,4-二硝基酚C6H30H(N02)溶于100ml水中。1.2钒钼酸铵试剂A液25g钼酸铵(NH4)6Mo7024'4H20，溶于400ml水中。B液1.25g偏钒酸铵(NH4V03),溶于300ml沸水中，冷却后加250ml浓硝酸。将A液缓缓倒入B液中，不断搅匀，并用水稀释至1L，贮于棕色瓶中。1.3磷标准贮备液磷浓度为50ug/mL称取0.2197g经烘干的磷酸二氢钾(优级纯)，溶约400ml水中，加25mlH+浓度为12mol/L的硫酸，定容至1L，可长久贮存。1.4硝酸、高氯酸、硫酸优级纯2、仪器设备分析天平(瑞士mettlerXS204)、分光光度计(日本HITACHIU-1900);3、磷标准曲线的绘制精确吸取磷贮备液Oml，2.5ml，7.5ml,10ml，15ml，分别于50ml容量瓶中，分别加入少量水，加入2滴二硝基酚指示剂，用6mol/LNaOH调至黄色，用0.2mol/LHN03调至无色，用0.1mol/LNaOH调至微黄色，加入5.00ml钒钼酸铵试剂，用水定容至刻度。定容后溶液中磷的浓度分别为0，2.5，7.5，10，15ug/ml。25-3(TC下显色15分钟，用lcm光径比色皿，在440nm测定其吸光值，以吸光值为纵坐标，磷含量为横坐标绘制曲线或计算回归方程。求得标准曲线方程Y=0.0317X+0.0015(R2=0.9998)4、含量测定吸取5ml待测液于25ml容量瓶中，加入少量水，加入2滴二硝基酚指示剂，用6mol/LNaOH调至黄色，用0.2mol/LHN03调至无色，用0.1mol/LNaOH调至微黄色，加入5.00ml钒钼酸胺试剂，用水定容至刻度。25-30。C下显色15分钟，用lcm光径比色皿，在440nm测定其吸光值，计算磷含量。计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式中P—样品中脂类磷含量，mg/100g;C—从标准曲线中査得的比色液中磷的浓度，ug/ml;V—-样液体积，ml;A—样液稀释倍数；M---样品的质量，g。5、结果计算740.53卵磷脂(mg/100g)=P(mg/100g)x-30.97式中p—…样品中脂类磷含量，mg/100g;740.53/30.97----由磷换算为卵磷脂的系数。两份乳粉样品中卵磷脂含量结果如下:样品名称称样量g吸光值A由标准曲线査得样液的磷浓度mg磷含量mg/100g卵磷脂含量mg/100g乳粉l12.43120.1213.777.58181,27乳粉212.50660.1524.759.49226.926、检出限计算最小分辨吸光值A由标准曲线査得样液的磷浓度mg磷含量mg/100g卵磷脂含量mg/100g0.0050.110.225.28(约为5.5)该方法的最低检出限为5.5mg/100g。7、回收率验证取卵磷脂标准品于样品中，制加标样，使用上述方法测定样品本底和加标样的卵磷脂含量结果如下-.样品名称称样量g磷含量mg/100g卵磷脂含量mg/100g样品本底12.53120.163.76加标样12.5066(0.0200g卵磷脂和12.4866g本底样品，折算卵磷脂含量为159.92mg/100g)6.27150.03回收率(％)=(150.03-3.76)/159.92*100=91.46%。该方法的加标回收率为91.46%。实施例2:乳粉中的卵磷脂含量检测的前处理方法检测乳粉中卵磷脂的含量，其样品前处理方法包括如下步骤1)准确称取两份不同的乳粉样品(各约10.0g，具体称量值参见下表)，编号为乳粉3和乳粉4，做平行试验，每份样品按照后续步骤进行操作。加入60ml三氯甲垸-甲醇(体积比2:1)溶剂，放置在摇床上不断摇动，室温浸泡12小时。2)用滤纸过滤于250ml三角瓶中，用三氯甲垸-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液。3)将获得的滤液置于65-75'C水浴中蒸干挥发，除去溶剂，得到粗脂肪。4)消化粗脂肪，得到待测液在装有上述粗脂肪的容器中加几粒玻璃珠，向粗脂肪中加浓硫酸和浓硝酸各10ml，缓慢加热消化，不要产生剧烈喷溅；加10ml浓硝酸，然后放置在电热板上加热反应。待反应结束后取下，稍冷却，再加入10ml高氯酸，重新放置电热板上加热反应，此时把温度调低些。若消化液变黑，需取下再加入10ml浓硝酸后继续消化，直到消化液变成无色或淡黄色，且冒出白烟，在消化液剩下3-5ml时取下，冷却，定量地转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到待测液。同时做空白。使用与实施例1中相同的比色法检测上述待测液，结果如下:样品名称称样量g吸光值A由标准曲线查得样液的磷浓度mg磷含量mg/100g:g/100g奶粉310.53120.1143.127.41177.10奶粉410.03120.1313.669.12218.11实施例3:乳粉中的卵磷脂含量检测的前处理方法检测乳粉中卵磷脂的含量，其样品前处理方法包括如下步骤1)准确称取两份不同的乳粉样品(各约15g，具体称量值参见下表)，编号为乳粉5和乳粉6，做平行试验，每份样品按照后续步骤进行操作。加入150ml三氯甲烷-甲醇(体积比2:1)溶剂，放置在摇床上不断摇动，室温浸泡36小时。2)用滤纸过滤于250ml三角瓶中，用三氯甲垸-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液。3)将获得的滤液置于65-75。C水浴中蒸干挥发，除去溶剂，得到粗脂肪。4)消化粗脂肪，得到待测液在装有上述粗脂肪的容器中加几粒玻璃珠，向粗脂肪中加浓硫酸和浓硝酸各10ml，缓慢加热消化，不要产生剧烈喷溅；加10ml浓硝酸，然后放置在电热板上加热反应。待反应结束后取下，稍冷却，再加入10ml高氯酸，重新放置电热板上加热反应，此时把温度调低些。若消化液变黑，需取下再加入10ml浓硝酸后继续消化，直到消化液变成无色或淡黄色,且冒出白烟，在消化液剩下3-5ml时取下，冷却，定量地转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到待测液。同时做空白。使用与实施例1中相同的比色法检测上述待测液，结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4:牛乳中卵磷脂检测的前处理方法检测牛乳中卵磷脂的含量，其样品前处理方法包括如下步骤1)准确称取两份不同的牛乳样品(各约12.0g，具体称量值参见下表)，编号为牛乳1和牛乳2，做平行试验，每份样品按照后续步骤进行操作。加入150ml三氯甲烷-甲醇(体积比2:0.5)溶齐ij，放置在摇床上不断摇动，室温浸泡24小时。2)用滤纸过滤于250ml三角瓶中，用三氯甲垸-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液。3)将获得的滤液置于65-75'C水浴中蒸干挥发，除去溶剂，得到粗脂肪。4)消化粗脂肪，得到待测液在装有上述粗脂肪的容器中加几粒玻璃珠，向粗脂肪中加浓硫酸和浓硝酸各10ml，缓慢加热消化，不要产生剧烈喷溅；加10ml浓硝酸，然后放置在电热板上加热反应。待反应结束后取下，稍冷却，再加入10ml高氯酸，重新放置电热板上加热反应，此时把温度调低些。若消化液变黑，需取下再加入10ml浓硝酸后继续消化，直到消化液变成无色或淡黄色，且冒出白烟，在消化液剩下3-5ml时取下，冷却，定量地转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到待测液。同时做空白。使用与实施例1中相同的比色法检测上述待测液，结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例5:功能性乳饮料中卵磷脂检测的前处理方法检测功能性乳饮料中卵磷脂的含量，其样品前处理方法包括如下步骤1)准确称取两份不同的功能性乳饮料样品(各约13.0g，具体称量值参见下表)，编号为乳饮料1和乳饮料2，做平行试验，每份样品按照后续步骤进行操作。加入150ml三氯甲垸-甲醇(体积比2:2)溶剂，放置在摇床上不断摇动，室温浸泡24小时。2)用滤纸过滤于250ml三角瓶中，用三氯甲烷-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液。3)将获得的滤液置于65-75'C水浴中蒸干挥发，除去溶剂，得到粗脂肪。4)消化粗脂肪，得到待测液在装有上述粗脂肪的容器中加几粒玻璃珠，向粗脂肪中加浓硫酸和浓硝酸各10ml，缓慢加热消化，不要产生剧烈喷溅；加10ml浓硝酸，然后放置在电热板上加热反应。待反应结束后取下，稍冷却，再加入10ml高氯酸，重新放置电热板上加热反应，此时把温度调低些。若消化液变黑，需取下再加入10ml浓硝酸后继续消化，直到消化液变成无色或淡黄色，且冒出白烟，在消化液剩下3-5ml时取下，冷却，定量地转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，得到待测液。同时做空白。使用与实施例1中相同的比色法检测上述待测液，结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例6:不同前处理方法检测乳制品中的卵磷脂含量的对比例取卵磷脂标准品于样品中，制加标样，使用下述前处理方法处理乳粉样采用与实施例1相同的比色法测定样品本底和加标样的卵磷脂含量。前处理方法(1)按照实施例1所述的前处理方法处理样品；(2)用100ml乙醚浸泡24小时不振摇；(3)采用文献《食品中磷脂测定方法的探讨》中对样品的前处理方法。对比结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>方法(1)回收率(%)=(150.03-3.76)/159.92*100=91.46%。方法(2)回收率(%)=(105.21-3.76)/160.12*100=63.36%。方法(3)回收率(%)=(43.08-3.76)/162.34*100=23.60%。本发明方法的加标回收率最高，可达90%以上，明显优于其它方法。本发明的前处理方法得到的待测溶液除上述比色法外，还可以应用于液相色谱等、重量法等。本发明的前处理方法使用直接浸泡的方法可以减少人工及成本的投入；长时浸泡且浸泡时在摇床上不断振摇，能够使脂类充分完全的被提取。同时，本发明的方法不需要配备昂贵设备，成本低廉，操作简便，可以应用于多种磷脂检测方法。权利要求1.一种乳及乳制品中卵磷脂含量检测的前处理方法，包括如下步骤1)向所述乳或乳制品的样品中加入三氯甲烷-甲醇溶剂；2)过滤步骤1)所得溶液，用三氯甲烷-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液；3)除去所述滤液中的溶剂，得到粗脂肪；4)消化所述粗脂肪，至所得消化液无色透明，得到待测液；其特征在于步骤1)中，所述样品中加入三氯甲烷-甲醇溶剂后，不断摇动下浸泡12-36小时。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述浸泡的时间为24小时。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述三氯甲垸-甲醇溶剂中三氯甲烷与甲醇的体积比为2:(0.5-2)。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述三氯甲烷-甲醇溶剂中三氯甲烷与甲醇的体积比为2:1。5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述三氯甲烷-甲醇溶剂的加入体积(mL)为所述样品重量(g)的6-10倍。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述三氯甲垸-甲醇溶剂的加入体积(mL)为所述样品重量(g)的8倍。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述样品的取样量为10.0-15.0g，优选12.0-13.0g。8.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述除去滤液中的溶剂的方法为所述滤液置于65-75i:水浴中挥发除去溶剂。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化粗脂肪的方法为使用强酸湿法消化。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述强酸湿法消化包括如下步骤向所述粗脂肪中加几粒玻璃珠，加浓硫酸和浓硝酸各10ml，缓慢加热消化;加10ml浓硝酸，加热反应；待反应结束后，稍冷却，再加入10ml高氯酸，加热反应，至消化液变成无色透明或淡黄色透明，且冒出白烟；在消化液剩下3-5ml时，冷却，转入容量瓶中加水定容，得到待测液。全文摘要本发明涉及一种乳及乳制品中卵磷脂含量检测的前处理方法，包括如下步骤1)向所述乳或乳制品的样品中加入三氯甲烷-甲醇溶剂；2)过滤步骤1)所得溶液，用三氯甲烷-甲醇溶剂洗滤渣数次，合并滤液；3)除去所述滤液中的溶剂，得到粗脂肪；4)消化所述粗脂肪，至所得消化液无色透明，得到待测液；其中，步骤1)中，所述样品中加入三氯甲烷-甲醇溶剂后，不断摇动下浸泡12-36小时。本发明的前处理方法，长时浸泡且浸泡时在摇床上不断振摇，能够使脂类充分完全的被提取，其卵磷脂加标回收率达90％以上。同时，本发明的方法不需要配备昂贵设备，成本低廉，操作简便，可以应用于多种磷脂检测方法。文档编号G01N1/34GK101387587SQ20081016726公开日2009年3月18日申请日期2008年10月17日优先权日2008年10月17日发明者刘美霞,王丹慧申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司