专利名称：荧光分光光度法筛选催化非水相体系转酯化反应用酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种催化非水相体系转酯化反应的酶的筛选方法，具体说是利 用荧光分光光度法对酶能否在非水相中催化转酯化反应进行判定，并根据荧光 强度确定酶催化能力强弱，属于酶反应及荧光测定技术领域。
背景技术：
有些脂肪酶、酯酶和蛋白酶在水相中催化分解反应，却能在非水体系中催 化合成及转酯化反应。酶催化的转酯化反应甚至能对固体高分子聚合物进行改 性，将功能基团引入高分子化合物侧链。因此，如果能够通过酶催化转酯化反 应在棉纤维表面引入不同的基团，则可在不损害棉纤维的条件下通过改性赋予 棉纤维新的功能。
目前为止，酶催化反应的测定通常使用气相色谱或高效液相色谱，这些方 法中酶、反应底物和反应溶剂用量较多，并且测定样品前处理要求高，单个样 品测定时间较长。相比之下，荧光分光光度法测定需要样品量少，反应体系可 以以微升计，每次可同时测定多个样品。荧光分光光度法利用自身没有荧光的 荧光底物和酶催化反应的产物之一作用生成荧光衍生物，通过测定荧光衍生物 的荧光强度间接反映酶的催化能力。该方法要求酶催化反应和荧光衍生物产生 反应能同步发生。因此，这两个反应发生的条件必须相协调，而很多荧光底物 反应生成荧光衍生物的条件与酶催化反应条件不一致而导致测定无法进行，从 而限制了荧光分光光度法在酶催化领域的应用。
4 -肼基-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂二唑肼(^0-&!^12,2)是一种商业化荧光 底物，能用于醛类物质的荧光测定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题主要是提供一种判断非水相体系酶催化转酯 化反应发生的方法，同时可以比较能催化转酯化反应酶的活性。本方法操作简 洁，直观明了。
本发明的技术方案 一种判断非水相体系酶催化转酯化反应发生的方法， 同时可以比较能催化转酯化反应酶的活性。荧光分光光度法筛选催化非水相体 系转酯化反应用酶的方法，a、酶催化乙烯基酯和伯醇类物质发生转酯化反应，
反应产物之一的乙烯基醇通过酮式-烯醇式互变异构生成乙醛，使转酯化反应
不可逆；b、乙醛和4-胼基-7-硝基-2,l，3-苯并氧杂二唑胼(NBD-H.NH2NH2)
反应生成荧光衍生物，并通过测定该荧光衍生物的荧光强度来间接反映酶的催化能力；酶催化反应和荧光衍生物产生反应的反应式为:
<formula>formula see original document page 4</formula> (1)
<formula>formula see original document page 4</formula> (2)
现将方法中几个关键技术分述如下
(1) 酶的冷冻干燥
配制浓度为1.333g/L的酶溶液，加入酶溶液重量百分5%蔗糖作为冷冻干 燥保护剂，充分振荡溶解后，用移液枪分装到0.5mL离心管中，300 nL/管， 进行冷冻干燥，得冷冻干燥酶粉，备用；
所选用的酶、酶溶液配置为
蛋白酶bacillolysin用pH7.5、0.1mol/L的K2HP04-KH2P04缓冲溶液配制； 蛋白酶subtilisin Carisberg用pH7.5、0.1 mol/L的K2HP04-KH2P04缓冲溶
液配制；
脂肪酶LPL-3用pH7.5、 0.1mol/L的K2HP04-KH2P04缓冲溶液配制； 蛋白酶Alcalase 3.0 T用pH8.0、 0.1 mol/L的K2HP04-KH2P04缓冲溶液 配制。
(2) 配制NBD-H.NH2NH2异辛烷溶液
准确称取一定量的NBD-H.NH2NH2至预先定量好的异辛烷中，配制浓度 为200 )amol/L的NBD-H.NH2NH2异辛烷溶液，使用旋涡混匀器连续震荡直到 NBD-H.NH2NH2完全溶解，该溶液在配制后3天内使用；NBD-H.NH2NH2溶解 于甲苯和乙腈中时也照此操作；
(3) 酶反应及荧光测定
在装有冷冻干燥酶粉的0.5 mL离心管中依次加入①、200 pL200 pmol/L 的仰0-辻,2,2异辛烷溶液，@、0.211111101正丙醇，为15pL，和③、0.02mmo1 丙酸乙烯基酯为2pL或0.02 mmol月桂酸乙烯基酯为5pL;
使用旋涡混匀器震荡混匀，在酶的反应温度下于恒温震荡水浴中反应1.5h，反应结束后静置片刻，用移液枪吸取200 pL上清液至黑色不透明96孔 板中测定荧光强度，每个条件做3个平行样，测定结果取平均值，荧光测定条 件为激发光波长435nm，发射光波长535nm，激发时间ls，采取顶部阅读模式， 数据分析时采用相对荧光强度表示，以同批次测定中最高荧光强度为100%。
所选用的酶的反应温度为蛋白酶bacillolysin温度37。C;蛋白酶subtilisin Carlsberg温度37°C;脂肪酶LPL-3温度50°C;蛋白酶Alcalase 3.0 T温度50°C 。
本发明的有益效果乙醛是挥发性物质，酶催化转酯化反应产生的乙醛能
否完全和NBD-H.NH2NH2作用生成荧光衍生物也影响荧光分光光度法对酶催 化能力的测定，但和测定样品前处理要求高、单个样品测定时间长的气相色谱 和高效液相色谱相比较，荧光分光光度法测定需要样品量少，反应体系可以以 微升计，每次可同时测定多个样品，是一种较好的能直观反应酶催化活性的方 法。本发明操作简洁，能直观明了判定非水相中酶催化转酯化反应能否发生， 可以比较能催化转酯化反应酶的催化活性，并可以通过本发明方法对影响酶催 化反应的因素进行研究。
图l不同参试用酶催化转酯化反应的能力。1、脂肪酶LPL-3; 2、蛋白酶 Alcalase 3.0 T; 3、蛋白酶subtilisin Carlsberg; 4、蛋白酶bacillolysin。
图2不同转酯化酯底物对转酯化反应的影响。1、蛋白酶bacillolysin; 2、 脂肪酶LPL-3; 3、蛋白酶subtilisin Carlsberg; 4、蛋白酶Alcalase 3.0 T。
图3不同有机溶剂对转酯化反应的影响。1、蛋白酶bacillolysin; 2、脂肪 酶LPL-3; 3、蛋白酶subtilisin Carlsberg; 4、蛋白酶Alcalase 3.0 T。
具体实施例方式
实施例l:不同参试用酶催化转酯化反应的能力
实验用酶均为商品化酶制剂，蛋白酶bacillolysin (最适温度37°C，最适 pH7.5)购自日本东京化成工业株式会社，脂肪酶LPL-3 (最适温度50'C，最 适pH7.0)购自日本天野酶制品株式会社，蛋白酶subtilisin Carlbergs (最适温 度37。C，最适pH7.5)购自Sigma公司，蛋白酶Alcalase 3.0 T(最适温度50°C， 最适pH 8.5)购自Novozymes公司。NBD-H.NH2NH2购买于日本东京化成株 式会社，色谱纯。月桂酸乙烯基酯(色谱纯)购买于日本东京化成工业株式会 社。丙酸乙烯基酯(色谱纯)购买于Sigma。荧光测定所用1420 multilabel counter 型多功能分辨荧光仪为美国PerkinElmer公司生产。
按照上述方法研究上述4种酶的催化转酯化反应的能力，如图1所示。脂 肪酶LPL-3催化的反应体系荧光强度在1.5 h后进入平台期，反应2 h的荧光 强度比1.5 h的只增加了 2.3%，其余三种酶催化的体系荧光强度在实验时间内 一直呈现增长趋势。实验结果说明实验所用4种酶都能在异辛烷中催化丙酸乙烯基酯和正丙醇发生转酯化反应，催化能力是脂肪酶LPL-3〉蛋白酶Alcalase 3.0 T〉蛋白酶subtilisin Carlsberg〉蛋白酶bacillolysin。
反应进行到2h时，脂肪酶LPL-3催化体系的相对荧光强度为100%，蛋 白酶Alcalase 3.0 T催化体系的相对荧光强度为73.5%，蛋白酶subtilisin Carlsberg催化体系的相对荧光强度为43.4%，蛋白酶bacillolysin催化体系的相 对荧光强度为7.9°/。。
实施例2:研究不同转酯化酯底物对反应的影响
以醇部分结构相同、羧酸部分碳链长短不同的丙酸乙烯基酯和月桂酸乙烯 基酯作为酶催化转酯化反应的底物，研究不同分子大小酯底物对反应的影响。 实验所用4种酶分别催化丙酸乙烯基酯和正丙醇反应的能力均大于催化月桂酸 乙烯基酯和正丙醇反应的能力，说明小分子酯底物有利于酶作用。
实施例3:研究不同有机溶剂对反应的影响
以丙酸乙烯基酯和正丙醇为底物，比较不同疏水性有机溶剂异辛烷(log
P=4.5)、甲苯(logP=2.5)、乙腈(logP=-0.33)对酶催化能力的影响。这4种 酶的催化能力在异辛烷和甲苯、乙腈体系中呈现出一致的趋势，但是随着有机 溶剂疏水性的下降，这4种酶的催化活性迅速下降蛋白酶bacillolysin、脂肪 酶LPL-3、蛋白酶subtilisin Carlsberg和蛋白酶Alcalase 3.0 T在甲苯中的催化 能力分别只有在异辛垸中的11.5%、 10.1%、 10.8%和8.8%;在乙腈中的催化 能力分别只有在异辛垸中的5.7%、 4.1%、 5.3%和4.7%。与甲苯、乙腈相比， 疏水性较强的异辛烷比较适合做为酶催化转酯化反应的溶剂。 所得结果为
1) 实验所用4种酶在异辛烷中催化丙酸乙烯基酯和正丙醇，发生转酯化 反应的能力是脂肪酶LPL-3〉蛋白酶Alcalase 3.0 丁>蛋白酶subtilisin Carisberg> 蛋白酶bacillolysin。
2) 实验所用4种酶催化丙酸乙烯基酯和正丙醇反应的能力均大于催化月 桂酸乙烯基酯和正丙醇反应的能力。
3) 与甲苯、乙腈相比，疏水性较强的异辛烷更适合做为酶催化转酯化反 应的溶剂。
权利要求
1、荧光分光光度法筛选催化非水相体系转酯化反应用酶的方法，其特征是a、酶催化乙烯基酯和伯醇类物质发生转酯化反应，反应产物之一的乙烯基醇通过酮式-烯醇式互变异构生成乙醛，使转酯化反应不可逆；b、乙醛和4-肼基-7-硝基-2，1，3-苯并氧杂二唑肼NBD-H.NH2NH2反应生成荧光衍生物，并通过测定该荧光衍生物的荧光强度来间接反映酶的催化能力；步骤为(1)酶的冷冻干燥配制浓度为1. 333g/L的酶溶液，加入酶溶液重量百分5％蔗糖作为冷冻干燥保护剂，充分振荡溶解后，用移液枪分装到0.5mL离心管中，300μL/管，进行冷冻干燥，得冷冻干燥酶粉备用；所选用的酶、酶溶液配制为蛋白酶bacillolysin用pH7.5、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液配制；蛋白酶subtilisin Carlsberg用pH7.5、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液配制；脂肪酶LPL-3用pH7.5、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液配制；蛋白酶Alcalase 3.0T用pH8.0、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液配制；(2)配制NBD-H. NH2NH2异辛烷溶液准确称取一定量的NBD-H.NH2NH2至预先定量好的异辛烷中，配制浓度为200μmol/L的NBD-H.NH2NH2异辛烷溶液，使用旋涡混匀器连续震荡直到NBD-H.NH2NH2完全溶解，该溶液在配制后3天内使用；NBD-H.NH2NH2溶解于甲苯和乙腈中时也照此操作；(3)酶反应及荧光测定在装有冷冻干燥酶粉的0.5mL离心管中依次加入①、200μL 200μmol/L的NBD-H.NH2NH2异辛烷溶液，②、0.2mmol正丙醇为15μL，和③、0.02mmol丙酸乙烯基酯为2μL或0.02mmol月桂酸乙烯基酯为5μL；使用旋涡混匀器震荡混匀，在酶的反应温度下于恒温震荡水浴中反应1.5h，反应结束后静置片刻，用移液枪吸取200μL上清液至黑色不透明96孔板中测定荧光强度，每个条件做3个平行样，测定结果取平均值，荧光测定条件为激发光波长435nm，发射光波长535nm，激发时间1s，采取顶部阅读模式，数据分析时采用相对荧光强度表示，以同批次测定中最高荧光强度为100％；所选用的酶的反应温度为蛋白酶bacillolysin温度37℃；蛋白酶subtilisinCarlsberg温度37℃；脂肪酶LPL-3温度50℃；蛋白酶Alcalase 3.0T温度50℃。
全文摘要
荧光分光光度法筛选催化非水相体系转酯化反应用酶的方法，属于酶反应及荧光测定技术领域。本发明通过a、酶催化乙烯基酯和伯醇类物质发生转酯化反应，反应产物之一的乙烯基醇通过酮式-烯醇式互变异构生成乙醛，使转酯化反应不可逆；b、乙醛和4-肼基-7-硝基-2，1，3-苯并氧杂二唑肼(NBD-H.NH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub>)反应生成荧光衍生物，并通过测定该荧光衍生物的荧光强度来间接反映酶的催化能力；本发明操作简洁，能直观明了判定非水相中酶催化转酯化反应能否发生，可以比较能催化转酯化反应酶的催化活性，并可以通过本发明方法对影响酶催化反应的因素进行研究。
文档编号G01N21/64GK101430279SQ200810194918
公开日2009年5月13日 申请日期2008年10月27日 优先权日2008年10月27日
发明者颖 张, 王树根, 范雪荣, 谷家栋 申请人:江南大学