专利名称：用于诊断非小细胞肺癌的血清标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学特别是基因诊断领域，尤其是DKK-1蛋白在诊断癌症中的应用。
背景技术：
肺癌是国际上癌症死亡的主要原因[l]。目前我们主要是根据临床病理特征对肺癌进行分期[2]，但有时候这些临床信息对预测病人的预后是不完全正确的或误导的[3，4]。利用分子诊断方法可能提供更为准确、客观和系统的癌症分期，然而，对于能够预测大部分实体瘤的标准分子标志物还未发现。据报道，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中已经发现了几种潜在的具有预后意义的生物的和分子的参数，包括K-ras突变体、c-erbB过表达和p53突变体。 1998年，Glinka A等在《Nature》杂志上发表研究文章(Nature, 1998 ;391(6665):357-362)宣布他们在非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎发育研究中发现了一种新的分泌性蛋白，命名为dickkopf-l (dkk-l)。他们的研究工作证实dkk-l是Wnt信号通路的抑制因子，是非洲爪蟾胚胎发育过程"头部(head induction)"形成的"引发者(inducer)"。稍后，1999年Fedi P等(J Biol Chem， 1999 ;274(27) :19465-72)采用条件色谱分离方法和PCR方法，从人平滑肌肉瘤细胞SK-LMS-1及相应cDNA文库中，分离获得了 dkk-1的人的同源基因，其mRNA转录本约为2kb，编码266个氨基酸。从此，科学家通过近5年的研究，初步揭示了 DKK-1作为Wnt信号通路抑制因子的分子机制。 在研究DKK-1的功能和作用机制的过程中，科学家亦注意到DKK-1与某些人类疾病有关。如骨质疏松症(Biochem Biophys Res Commun， 2004 ;318 (1) :259-264.N Engl J Med， 2002 ;346(20) :1513-1521)、多发性骨髓瘤引发的骨损害(N Engl JMed，
2003 ;349(26) :2483-2494)以及某些人类恶性肿瘤，如Mikheev AM等(Carcinogenesis,
2004 ;25(1) :47-59)利用人子宫颈癌Hela细胞系建立了两株非致瘤性的回复突变型(non-t咖origenic revertant)细胞系，并利用cDNA芯片技术发现DKK-1在上述两株非致瘤性的回复突变型Hela细胞系中高表达，其研究发现DKK-1表达的缺失是Hela致瘤性所必需的，因此认为DKK-1是一个候选肿瘤抑制基因;另外，Wirths O等(Lab Invest, 2003 ;83(3) :429-434)利用"抑制差减杂交技术(su卯ression subtractive hybridization即proach)"发现DKK-1在儿童肝母细胞瘤(h印atoblastoma)和Wilms'肿瘤中高表达，其结果表明32例儿童肝母细胞瘤中26例DKK-1高表达(26/32,81% ) 、6例Wilms'肿瘤中5例DKK-1高表达(5/6,83% )，而在20例肝癌病人中仅2例DKK-1高表达(2/20， 10% )、5株成神经管细胞瘤(medulloblastoma)细胞系中仅1例DKK-1高表达(1/5,20% )，在恶性胶质瘤和乳腺癌中未检测到DKK-1表达。 然而，现今对于DKK-1在各肿瘤中的表达机制并不完全清楚，需要更灵敏和更可靠的手段来对癌症进行检测。尽管现代外科技术和辅助化放疗水平已有很大提高，但肺癌仍然是所有恶性肿瘤中预后最差的一种癌症。因此，现在急需发现一种新的、具有诊断意义
3的生物标志物来对癌症进行早期诊断及为个体患者提供更好的辅助治疗方法。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种诊断肺癌的有效方法。 在本发明的第一个方面，提供了 DKK-1蛋白在制备肺癌，特别是非小细胞肺癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。在一个优选实施方式中，DKK-1蛋白与标记融合。优选标记选自生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。优选标记还选自可用于分离纯化蛋白质的标记，例如各种能够与层析柱结合的配体，从而能够使得分离纯化DKK-1的过程更加方便。优选试剂或试剂盒还含有抗-DKK-1特异性抗体。 在本发明的第二个方面，提供了一种肺癌，特别是非小细胞肺癌的诊断试剂盒，该试剂盒含有容器，容器中含有DKK-1蛋白；以及标签，所述标签说明所述试剂盒用于诊断肺癌。在一个优选实施方式中，DKK-1蛋白与标记融合。优选标记选自生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。优选标记还选自可用于分离纯化蛋白质的标记，例如各种能够与层析柱结合的配体，从而能够使得分离纯化DKK-1的过程更加方便。优选试剂或试剂盒还含有抗-DKK-1特异性抗体。 在本发明的另一个方面，还提供了抗DKK-1自身抗体的抗体在制备肺癌，特别是非小细胞肺癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。该抗体针对肺癌病人产生的自身抗体。
图1显示了蛋白表达与纯化。A. DKK1-MBP融合蛋白.M :蛋白分子量标志物；泳道l-5分别是，未加IPTG诱导的细胞蛋白，总细胞蛋白，IPTG诱导后的蛋白，诱导后细胞蛋白的上清，诱导后的包涵体蛋白，纯化的蛋白。B. ECPKA蛋白.泳道1 :纯化的ECPKA蛋白；M :蛋白分子量标志物. 图2.显示了 DKK1-MBP融合蛋白免疫后所获得的小鼠多克隆抗体的特异性。同一肺癌组织用不同抗体进行western blot检测.泳道1_2分别是小鼠多克隆抗体和商品化的兔多克隆抗体。 图3显示了癌症患者和正常对照血清中DKK1自身抗体ELISA值的滴度和ROC曲线。A:血清中DKK1自身抗体的滴度。通过ELISA方法检测抗DKK1 IgG自身抗体，抗体滴度与正常对照血清的吸光度值相比，其值> 1. 38，有统计学意义。非小细胞肺癌组和对照组的DKK1自身抗体滴度值之间的差异据有统计学意义(P < 0. 05) 。 B :DKK1自身抗体ELISA值的ROC曲线。ROC曲线代表了DKK1自身抗体ELISA值的敏感度和特异性之间的相关性。DKK1自身抗体ELISA值的敏感度和特异性分别为62%和84% (AUC，O. 80)。
图4显示了肺癌病人和正常对照血清中抗DKK1自身抗体的Westernblotting。l，抗DKKl多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA) ， 2-5 :正常对照血清
(i : ioo稀释)；6-9 :肺癌患者血清(i : ioo稀释)。 图5显示了肺癌细胞株和肺癌组织中DKK1的表达。A :western blotting检测5株肺癌细胞株中DKK1的表达，l，SPC-Al ;2，NCI-H446 ;3，A549 ;4，NCI_H460 ;5， NCI_H1299。B :非小细胞肺癌组织样本中DKK1蛋白的表达。 图6显示了癌症患者和正常对照血清中DKK1 ELISA值的滴度和R0C曲线。A :DKKl的血清滴度。DKK1滴度值与正常对照血清的平均吸光度值相比，其值〉1.55，有统计学意义。B:DKK1 ELISA值的ROC曲线。R0C曲线代表了 DKK1 ELISA值的敏感度和特异性之间的相关性。 图7显示了 在肺癌患者和正常对照血清中ECPKA自身抗体的滴度，通过ELISA方法检测抗DKK1 IgG自身抗体。抗体滴度值用它们各自的原始值与正常对照的原始平均值的比值表示。抗体滴度与正常对照的吸光度值相比无统计学意义(P < 0. 05)。
具体实施例方式
发明人采用ELISA技术，通过比较肺癌患者和非肺癌患者的抗DKK-1自身抗体的血清水平，确定了抗DKK-1自身抗体能够作为一种特异性非小细胞肺癌的诊断工具，并且为癌症患者能针对其实体瘤中的抗原产生自身抗体又增加了一个理论依据。DKK-1过表达诱导了血清中产生大量的DKK-自身抗体，这些自身抗体的存在可以作为癌症诊断的一个指标。 因此，发明人设计了一种试剂盒，利用DKK-1蛋白和标记蛋白的融合产物来检测血清中的抗-DKK-l自身抗体的存在。 如本文所用，术语"DKK-1"指非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎发育研究中发现了一种新的分泌性蛋白，命名为dickkopf-l (dkk-l)。该蛋白的序列可通过NCBI以登录号NP571078找到。本发明所指的DKK-1蛋白包括其完整的氨基酸序列，其分泌蛋白，其突变体，以及其功能上活性的片段。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生的保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。 在得到了 DKK-1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 —旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的DKK-1多肽。 一般来说有以下步骤 (1).用本发明的编码人DKK-1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。 本发明中，DKK-1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体 内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、 启动子、标记基因和翻译控制元件。 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DKK-1编码DNA序列和合适的转录/ 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术 等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载 体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋 白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞 如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgC12。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用 蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。 本发明的抗-DKK-l自身抗体指的是病人对于过表达的DKK-1产生的自身抗体。这 种抗体是多克隆的。它可以与DKK-1蛋白反应并结合，从而通过与DKK-1蛋白融合的标记 被检测。 本发明还包括对DKK-1DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单 克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于DKK-1基因产物或片段。 较佳地，指那些能与DKK-1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的 抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。 抗DKK-1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的DKK-1蛋白。
血样或尿液中的DKK-1的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标， 也可作为肿瘤早期诊断的依据。 抗体可以通过ELISA、 Western印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同 位素示踪等方法来检测。这些方法都是常规的免疫检测方法。ELISA—般都先使用一抗或 其结合配体包被酶标板，然后添加样品，孵育适当时间令其充分反应，清洗去未结合的抗体 或其结合配体，然后添加合适的二抗。二抗可以是与标记结合，一般常用的是辣根过氧化物 酶标记。使用物种特异性的二抗能够提高灵敏度，排除干扰。 本发明也包括试剂盒，以进行这里描述的任何方法。在一个非限制的实例中，所述 试剂盒将以适当的容器形式包含这些试剂中的一种或多种。所述试剂盒也可包含用于RNA 分离、扩增细胞中RNA的纯化的试剂、标记等。 试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器
通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并
且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含
第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包
含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于
商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发
明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规
条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York :ColdSpring Harbor Laboratory
Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1 1.材料和方法 1. 1细胞株和组织样本 在本实施例中，采用人肺癌细胞株SPC-A1，NCI-H446，A549，NCI-H460(来自ATCC) 和NCI-H1299 (购自上海市胸科医院)，所有细胞均呈单层生长，在最适培养基中加入10 % 胎牛血清(Hyclone公司)，培养条件5X C02，37。C。肺癌肿瘤和癌旁正常组织用来做 Western blot，这些标本来自于上海交通大学附属上海胸科医院经手术治疗的病人。肺癌 肿瘤样本在采集前均获得了患者的知情同意。本研究中所采用的临床材料均获得了公共机 构道德委员会的许可。临床分期是根据国际抗癌委员会TNM分期进行的。
1. 2血清样本 87例(57例女性、30例男性，年龄段为30-81，其平均年龄是62. 5)正常对照患者 和93例(61例男性，32例女性，年龄段为33-79，其平均年龄是60. 3)肺癌病人的血清样本 在采集前均获得了患者的知情同意，这些肺癌血清样本来自于上海交通大学附属上海胸科 医院。这些肺癌患者血清包括53例腺癌，23例鳞状细胞癌(SCCs)，5例腺鳞癌，8例支气管 癌和4例大细胞癌。本研究中所采用的这些癌症患者的血清样本符合以下标准(a)均为 新诊断的肺癌患者且以前未经过治疗，(b)这些肿瘤的病理诊断均为肺癌I-IV期。血清样本在诊断时采集，分装(10ul/管)保存于-7(TC。这些血清样本在使用时解冻且稀释的血
清样本不重复使用。 1. 3DKK1和ECPKA蛋白的纯化 DKK1编码序列通过RT-PCR获得。弓|物分别为5'GGAATTCCATATGATGGCTCTGGGCGCAG 3，和5'CGGGATCCTTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAAGC3，(模板用的是肺癌组织cDNA)。获得的DNA 片段经限制性内切酶Ndel/BamHI双酶切后插入经Ndel/BamHI酶切后的载体pMalC2X(New England Biolabs， Inc. ， Ipswich, MA)，最后得到的质粒为pMal-DKKl。 pMal-DKKl编码 DKK1-MBP(MBP指的是麦芽糖结合蛋白，它的编码序列在pMalC2X上)融合蛋白，可通过 BL21(DE3)诱导表达。DKKl重组蛋白通过Amylose Resin亲和柱子(New England Biolabs， Inc. ， Ipswich, MA)纯化，并通过SDS-PAGE检测(图1A)。 ECPKA (细胞外蛋白激酶A)编码序列也是通过RT-PCR获得(肺癌组织cDNA)。弓| 物为5' catatgggcaacgccgccgccgc 3'禾P 5' GGATCCTAAAACTCAGAAAACTCCTTGCCAC3'。获 得的DNA片段先插入简单载体pGEM-T(Promega， USA)并用限制性内切酶Ndel/BamHI双酶 切，后将获得的ECPKA编码片段插入经Ndel/BamHI双酶切的载体pET_28a(+) (Novagen， Wi scons in ， USA) 。 ECPKA在BL21(DE3)中诱导表达。ECPKA蛋白通过Ni-NTA His-Bind resin 柱子(GE Healthcare UK Ltd.)纯化禾口 SDS-PAGE(图IB)检测。 从图1中可见，通过原核表达，获得了 DKKl-MBP融合蛋白和ECPKA蛋白，分子量分 别为70KD和41KD(见图1)。
实施例2 由于无法获得商品化的DKK1重组蛋白，我们采用了上述实施例1中纯化表达的重 组DKK1融合蛋白DKK1-MBP来检测血清样本中的DKK1自身抗体。血清中的抗DKK1 IgG自身 抗体通过ELISA方法检测。纯化的重组人DKK1融合蛋白DKK1-MBP作为抗原包被96孔板， 100 ill/孑L (lmg/mL，PBS稀释)，4。C孵育过夜。用洗脱液(0. 01M PBS，0.1% tween-20，PH 7.4)洗去未结合的抗原，5%脱脂奶粉(光明奶粉有限公司)，100iU/孔，室温封闭2h。为 除去血清中可能存在的抗麦芽糖结合蛋白(MBP)的抗体，100iU稀释的血清样本(1 : 400 稀释，稀释液0. OIMPBS， pH 7.4，5% nonfat dry milk，0. 5% Tween 20)预先加入MBP 室温孵育30min，然后加入血清样本，37°C ， lh ;用洗脱液(0. 01M PBS， 0. 1 % tween-20， 7. 4)洗3遍，然后加入100iil/孔(1 : 3000稀释，稀释液0. 01M PBS，pH 7. 4，5%脱脂牛 奶，O. 5%Tween 20)抗人IgG-HRP (Proteintech group, inc， USA) 二抗，室温孵育2h;用洗 脱液洗5遍，然后加入100 ii 1/孔ABTS (2， 2'-吖嗪-二 - (3-乙基苯并噻唑啉磺酸)底物 显色液(ImM ABTS，29mM无水拧檬酸，41mM磷酸二氢钠，PH 4. 2， 0. 03% H202) ， 37°C ， 15min。 最后在ELISA读数仪(微量滴定板读数仪基准；Bio-Rad， ) 410nm波长处读取吸光度值。
血清DKKl水平也通过ELISA方法检测。首先，商品化的特异性针对人DKK1的兔抗 多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA)l : 100稀释包被96孔板，4°C 孵育过夜。然后洗去未结合的抗体，封闭液(0.01M PBS，pH 7.4，5%脱脂牛奶，0. 5%TWeen 20) 100iil/孔，37。C，lh ;倒掉封闭液，血清样本以1 : 50稀释，100iil/孔，37。C，lh ;洗去 未结合的物质，加入鼠多克隆抗体(1 : 50稀释)，该抗体特异性针对重组DKK1融合蛋白 (图2验证了该特异性的抗体)，100 1/孔，37°C ， lh ;洗去未结合的抗体_酶复合物，加入 羊抗鼠IgG-HRP第二抗体(1 : 1000稀释)，100iil/孔，37t:，lh ;洗脱液洗5遍后，加入ABTS底物显色液，37°C ， 15min，后用ELISA读数仪在410nm波长处读取吸光度值。
通过Western Blot分析，我们发现鼠多抗和商品化的兔抗DKK1多抗一样，都能用 来Western Blot检测DKK1-MBP融合蛋白。
实施例3 上述的肿瘤组织和细胞株用裂解液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0) ， 150mmol/ L NaCl，O. 5% NP40，0.5X脱氧胆酸钠)和蛋白酶抑制混合剂(Pierce)裂解。裂解产物 的蛋白浓度用BCA检测试剂盒(Pierce, USA)检测，同时用BSA做标准曲线。采用12% 变性聚丙烯酰胺凝胶(4%的聚丙烯酰胺浓縮胶)，30 g/泳道，电泳后转至硝酸纤维素膜 (Bio-Rad)。 5%脱脂奶粉(PBS-Tween 20稀释)封闭，然后用商品化的兔抗人多克隆抗体 DKKl(hDKKl ;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA)4。C孵育过夜。后用HRP-结合 的二抗室温孵育lh。 PBST洗膜后用增强化学发光试剂盒(Pierce, USA)反应。
结果显示35-KDa DKK1蛋白在4株细胞中是过表达的(图5A)，但Western blot 分析临床样本或癌旁正常组织或两者时，并未发现DKK1表达水平在这些组织中有明显差 别(图5B)。虽然有研究报道，DKK1在肺癌、食管癌、肾母细胞瘤、肝母细胞瘤、HCC和多发 性骨髓瘤中均呈高表达。诱导外源性DKK1的表达可提高哺乳动物细胞的细胞转移和侵袭 活性。但在本研究中，我们没有发现肺癌组织中DKK1的表达高于其癌旁正常组织。本研究 与其它研究结果的差异可能是由于组织样本采集位置不同所致。因此，现有技术中的这种 观点并不是完全可靠的。
实施例4 用实施例1制备的纯化的重组人DKK1融合蛋白(100ng/泳道)，10% SDS-PAGE，电 泳后转至硝酸纤维素膜，膜经过封闭、洗脱后各条带用上述肺癌病人或者正常人血清稀释 液(l : IOO稀释)孵育，但在孵育血清样本前用MBP(稀释于5X脱脂奶粉(PBST稀释))， PBST洗3遍，抗人IgG-HRP孵育，最后用增强化学发光试剂盒(Pierce公司)反应。
采用ELISA方法检测了 93例肺癌患者和87例正常对照血清样本中的抗DKK1自 身抗体水平，如图3A所示，抗DKK1自身抗体的滴度显著高于正常对照的平均水平。93例肺 癌患者血清中抗DKK1自身抗体平均值为1.57±0. 53(F1 SD)。相反，87例正常对照患者血 清中DKK1平均水平值仅为1士0.42(F1 SD);正常对照和非小细胞肺癌患者之间具有显著 的差异(P < 0. 001 (Mann-Whitney U test)，应用ROC曲线(图3B) 93例肺癌患者和87例 正常对照的资料(图3A)，基线的设置是为了提供最适的DKK1自身抗体诊断准确性和可能 的比值(最小的假阴性和错误的假阴性)[62% (57/93)的敏感度和84% (74/87)的特异 性]。 血清中DKK1自身抗体的免疫学检测结果见图4。选择DKK1自身抗体水平较高的 患者血清与纯化的DKK1融合蛋白进行免疫交叉反应(图4， 6-9)，正常对照血清与DKK1蛋 白没有免疫交叉反应(图2， 2-5)。从图4我们可以看出条带(6-9)的分子大小与阳性对照 大小一致(1)。 本实验证明患者血清中存在DKK1的自身抗体，而正常人血清中没有DKK1的自身 抗体。阳性对照所用的抗体是用兔多克隆抗DKK1抗体(Santa Crutz公司)，作为实验过程 的阳性对照。 也检测了自身抗体DKK1水平与癌症分期的关系，但并未发现它在NSCLC患者的4个分期中有明显的差异。在NSCLC患者中，DKK1自身抗体诊断的敏感性从I到IV期分别 为64.3% (18/28) ，70% (7/10) ，57. 4% (27/47)和62. 5% (5/8)。 上述结果提示了循环系统中DKK1自身抗体的检测可能作为一种潜在的有价值的
非侵袭性标志物来辅助诊断肺癌。在肿瘤发生过程中，DKK1蛋白作为一种抗原可以激发大
量自身抗体的产生，这有利于我们对正常个体和肺癌病人进行初步筛查。 在早期NSCLC(I期)中有64. 3%的患者其DKK1自身抗体水平的升高提示其可能
对NSCLC患者的早期诊断是非常重要的。 实施例5 为验证在血清样本中DKK1和DKK1自身抗体水平是否有差异，我们采用上述实施 例3的ELISA方法从48例NSCLC和35例正常对照血清中检测了 DKK1水平。结果如图(图 6A)所示，NSCLC患者的DKK1平均水平高于正常对照。48例肺癌患者血清中DKK1平均水 平为3. 568±0. 4926 (Fl SD)，相反，35例正常对照血清中DKK1的平均值仅为1±0. 1016 (Fl SD) 。NSCLC患者和正常对照血清中的DKK1水平有显著性的差异(P < 0. 0001，Mann-Whitney U test)。应用ROC曲线引出48例癌症患者和35例正常对照的资料(图6B)，基线的设置是 为了提供合适的诊断DKK1的准确性和可能的比值(最小的假阴性和错误的假阴性)[62. % (30/48)的敏感度和82.86% (29/35)的特异性]。 DKK1水平升高的患者中仅有53.3X (16/30)的病人同时有DKK1自身抗体的升 高。由于DKK1和它的自身抗体在血清中并不一定是同时升高的，因此，将两者结合起来诊 断癌症患者和正常对照。结合DKKl和它的自身抗体后使用同样的基线时，检测的敏感度可 提高至81. 25% ，而特异度仍保持在82. 86% 。
实施例6 采用实施例5相同的方法，使用实施例1中所述的ECPKA融合蛋白检测了 NSCLC患 者中ECPKA自身抗体的水平。结果如图7所示。在NSCLC患者血清中ECPKA自身抗体的平 均水平也高于正常对照的平均水平，但与DKK1自身抗体相比，ECPKA自身抗体在区别NSCLC 患者和正常对照时其敏感度和特异性较低。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
10
权利要求
DKK-1蛋白在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的用途。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DKK-1蛋白与标记融合。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述标记选自生色团、化学发光基团、荧光 团、同位素或酶。
5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒还含有抗-DKK-1特异性 抗体。
6. —种肺癌诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有容器，所述容器中含有DKK-1蛋 白；以及标签，所述标签说明所述试剂盒用于诊断肺癌。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌。
8. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述DKK-1蛋白与标记融合。
9. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标记选自生色团、化学发光基团、荧 光团、同位素或酶。
10. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有抗-DKK-1特异性抗体。
全文摘要
公开了DKK-1蛋白在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的用途。还公开了一种肺癌诊断试剂盒，含有容器，所述容器中含有DKK-1蛋白；以及标签说明所述试剂盒用于诊断肺癌的标签。
文档编号G01N33/68GK101762708SQ200810207819
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者李宗海, 王华茂, 石必枝, 蒋华, 顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所