专利名称：液体型凝血酶时间(tt)检测试剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及临床诊断试剂，具体涉及一种液体型凝血酶时间(TT)检测试剂的制备 方法，该方法还包括液体型凝血酶时间(TT)检测试剂的主要组成部分。
背景技术：
凝血酶时间(Thrombin time, TT)是在待测血浆加入一定量的凝血酶试剂，纤维蛋 白原变为不溶性纤维蛋白，测定凝固所需的时间。TT是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解 系统功能的一个简便试验，广泛应用于监控治疗高分子量肝素以及纤维蛋白溶解治疗，筛 选纤维蛋白原紊乱及一些严重的纤维蛋白原缺乏病症，对临床各科的疾病诊断具有重要意 义。凝血酶时间(TT)检测的原理是适量的凝血酶将血浆样品中的纤维蛋白原转变成纤 维蛋白，从而使血浆凝固，凝固所需的时间即为凝血酶时间(TT)。正常的凝血酶时间位 于12.0s 18.0s之间，与正常值差别3s以上即为异常。TT检测的临床意义主要表现在凝血酶时间延长见于血浆纤维蛋白原减低或结构异 常，纤维蛋白原降解物(FDP)增多；临床应用肝素，或在肝病、肾病及系统性红斑狼疮 时的肝素样抗凝物质增多；纤溶蛋白溶解系统功能亢进等。凝血酶时间縮短见于血液中有 钙离子存在，或血液呈酸性等。凝血酶时间检测测定过程受多种因素的影响，其中试剂的质量是最关键因素，由于 目前国内的凝血试剂普遍存在产品质量不稳定、敏感性差的问题，致使检测结果不稳定， 不同的临床检验实验室之间测得的结果难以比较，尽管采用WHO标准参照品，但仍难以 把误差降低到可接受的水平，因此目前临床实验室所使用的试剂绝大部分为进口产品，价 格昂贵。另一方面，由于液体制剂在使用的过程中不需复溶，不存在因所用水的质量或体 积差异给测定结果造成的误差，有利于测定标准化的实现，因此成为凝血酶时间(TT) 检测试剂的发展方向。发明内容(一)发明目的本发明的目的是提供一种具有敏感性高、使用方便、实验误差小、稳定性强、兼容性 好的液体型TT检测试剂的制备方法，最终目的是将应用该方法制成的检测试剂在临床检 验上广泛应用，使TT检验实现标准化。(二) 发明的优势本发明采用牛凝血酶为主要原料，采用独特的稳定系统制备新型液体型凝血酶时间 (TT)检测试剂。液体试剂具有使用方便的优点，不需复溶，避免各实验室使用蒸馏水 不同、复溶体积不准确而造成的测定偏差；试剂稳定性强，丌瓶后37"C能稳定30天以上； 同时，该试剂兼容性强，可满足使用不同型号血凝仪的检测需要。(三) 发明内容详述本发明的特征在于由牛凝血酶、缓冲液和稳定剂制备而成。液体TT检测试剂中各试 剂的终浓度依次为牛凝血酶(^5U/mL)， 50mMpH7.5 Tris-HCI， 0.5%聚乙二醇，0.25% 牛血清白蛋白，3%甘油，0.1%羟基丁酸盐甲苯，0.1%叠氮钠，40mM氯化钠，0.1%明胶。
具体实施方式
实施例一液体型凝血酶时间(TT)检测试剂的制备液体型凝血酶时间(TT)检测试剂由牛凝血酶试剂、产品稳定剂和TT缓冲液所组成， 其制备方法如下1. 产品稳定剂的制备依次称取5g聚乙二醇、2.5g牛血清白蛋白、lg羟基丁酸盐甲苯、lg叠氮钠，溶解于 50mM pH7.5 Tris-HCI缓冲液中，加入30mL甘油，混合均匀至外观为无色透明液体，定 容至1L， 4'C贮藏备用。2. 牛凝血酶试剂的制备将牛凝血酶冻干粉(500 U/mL， 1 mL /瓶)用产品稳定剂按比例稀释为终浓度为 5U/mL， 4'CC藏备用。3. TT缓冲液的制备称取6.06gTris碱、2.34g氯化钠加入蒸馏水适量使之溶解。另取lg明胶加入适量蒸 馏水，加热溶解后并入上述溶液中。然后用浓盐酸溶液调节pH值至7.5，再用蒸镏水定 容至1L，即得TT缓冲液。制备液体TT检测试剂主要技术指标如下1. 外观凝血酶试剂(液体)应为无色液体，透明无异物；缓冲液为无色液体，透明 无异物。2. 试剂重复性同一瓶试剂重复测定同一血浆样品，所测结果变异系数小于3%。3. 试剂批间差不同瓶试剂测定同一血浆样品，所测结果变异系数小于8%。4. 试剂稳定性在2'C 8'C存放不少于18个月。实施例二应用液体型凝血酶时间(TT)检测试剂的检测方法取待测血浆100uL， 37。C预温3分钟，然后分别加入凝血酶试剂100 uL (不需预 温)，以CA530血凝仪(日本Sysmex公司产品)或者手动测定凝固时间。 注意事项① 样本避免出现泡沫。② 标本采集和凝血试验必须使用一次性塑料或硅化玻璃容器。③ 用浊度法测定的血凝仪，溶血和较明显的黄疽及脂血会影响测定结果，此时 宜采用手工或者电子血凝仪测定。 红细胞比容在20-55%范围之外时，应调整抗凝剂用量。抗凝剂用量(mL)=0.00185*血液体积(mL) * (100-比容)。
样本不宜采用草酸盐、EDTA和肝素作抗凝剂。
测定温度在37'C士0.5'C，需经常检査加热元件的温度。 ⑦实验器具必须清洁，不能有去坭剂存在。测定操作时佩戴一次性手套。实施例三液体型凝血酶时间(TT)检测试剂的稳定性检测本发明试剂的稳定性检测包括丌封后2-8'C稳定性、不开封2-8'C稳定性、未开封37°C 加速破坏试验、长时稳定性试验。开封后置于2-8。C贮藏条件下，30天之内正常质控血浆L-1测值在正常值范围内，且 变化不大，实验数据如表l所示。表1 2-8'C贮藏条件下本发明试剂的长期稳定性检测结果贮藏时间(月)凝血时间(s)112.9213.513.7414.214.2614.1了14.2814.2914.41015.01114.41214.8在2-8"C条件下将该试剂贮存12个月，每隔一个月对该试剂做稳定性检测，检测仪器 为CA530血凝仪，用与仪器配套的市售进口 TT试剂做对照，所用血浆为太平洋公司的 正常质控血浆L-l,检测结果如表2所示。
表2本发明液体TT试剂与市售TT试剂在2-8'C稳定性比较
贮存时间(月)正常质控血浆L-l检测凝固时间(s)本发明-TT市售进口-TT
113.612.8
213.813.1
313.412.9
413.912.6
514.113.2
613.913.0
714.312.9
813.812.9
914.513.1
1013.913.2
1114.212.8
1213.713.0
37'C加速破坏条件下，正常质控血浆测值在1个月保持基木稳定，处于正常值范围， 检测结果如表3所示。
表3 37'C加速破坏实验本发明FIB检测试剂稳定性检测
贮藏时间(灭)凝血时间(s)
112.9
13.5
1013.7
1513.3
2013.6
2513.4
3013.5
综上对以上各技术指标的考察结果证明，本发明方法生产的试剂操作简单、使用方便、
敏感性好，稳定性强，与国外TT检测试剂具有口j比性，适合临床应用，可作为新一代标 准化TT试剂替代进口试剂。
权利要求
1.一种液体型凝血酶时间(TT)检测试剂由牛凝血酶试剂、产品稳定剂和TT缓冲液所组成。
2. 按权利要求l所述方法，其特征在于牛凝血酶的活力单位^5U/mL。
3. 按权利要求1所述方法，其特征在于产品稳定剂由下述原料制成30~60mM pH7.5 8.0Tris-HCI，聚乙二醇0.4~1.0%，牛血清白蛋白0.1~0.5%，甘油2~5%，羟基丁 酸盐甲苯0.05~1.5%，叠氮钠0.1~0.5%。
4. 按权利要求3所述方法，其特征在于稳定剂以50mM pH7.5 Tris-HCI缓冲液配制。
5. 按权利要求3所述方法，其特征在于稳定剂中聚乙二醇的最适添加量是0.5%、牛 血清白蛋白的最适添加量是0.25%、甘油的最适添加量为3%、羟基丁酸盐甲苯最适添加 量是0.1%、叠氮钠最适添加量0.1%。
6. 按权利要求l所述方法，其特征在于缓冲液系由Tris-HCI、氯化钠和明胶所组成。 其中，Tris-HCI浓度为30 60mM，氯化钠浓度10~100mM，明胶浓度0.05 0.2%，缓冲液 pH7.4~ pH8.0。
7. 按权利要求6所述方法，其特征在于Tris-HCI缓冲液的最适浓度为50mM，最适 pH为7.5，氯化钠最适浓度为40mM，明胶最适浓度0.1%。
全文摘要
本发明涉及一种液体型凝血酶时间(TT)检测试剂的制备方法，该方法还包括液体型凝血酶时间(TT)检测试剂的主要组成部分。TT是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能的一个简便试验，广泛应用于监控治疗高分子量肝素以及纤维蛋白溶解治疗，筛选纤维蛋白原紊乱及一些严重的纤维蛋白原缺乏病症，对临床各科的疾病诊断具有重要意义。本发明采用牛凝血酶为主要原料，采用独特的稳定系统制备新型液体型凝血酶时间(TT)检测试剂。新颖的稳定系统解决了液体状态保持试剂稳定性的难题，具有敏感性高、使用方便、实验误差小、稳定性强、兼容性好、成本低等优点。
文档编号G01N33/86GK101666806SQ200810212929
公开日2010年3月10日 申请日期2008年9月7日 优先权日2008年9月7日
发明者肖国伟 申请人:上海长岛生物技术有限公司