戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物的制备方法

专利名称：：戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于特异IgM(抗-HEV)检测的兔-人嵌合抗体质控物及其制备方法，属于临床检验学和生物
技术领域：
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背景技术：
：戊型肝炎病毒(h印atitisEvirus,HEV)曾称为经消化道传播的非甲非乙型肝炎病毒。1955年首次在印度暴发流行，当时认为是甲型肝炎病毒所致。70年初建立了HAV的检测方法，重新对当时肝炎患者的血清进行检测，结果未发现患者血清中抗-HAVIgM或IgG效价升高，因此确定为消化道传播的非甲非乙型肝炎病毒所致。1986年，我国新疆南部地区发生戊型肝炎流行，约12万人发病，死亡700余人，是迄今世界上最大的一次流行。1989年，Reyes等应用基因克隆技术，获得了该病毒基因组cDNA克隆，并正式命名为戊型肝炎病毒。HEV病毒体呈球状，无包膜，平均直径为3234nm，表面有锯齿状刻缺和突起，形似杯状，故将其归类于杯状病毒科(Caliciviridae)。本病毒对高盐、氯化铯、氯仿等敏感；在一708'C中易裂解，但在液氮中保存稳定。细胞培养未获成功；多种非人灵长类动物可感染HEV。HEV基因组为单正链RNA，全长约7.5kb，具有polyA尾，共有3个0RF，最长的第一个ORF约5kb，编码病毒复制所需的依赖RNA的RNA多聚酶等非结构蛋白。第二个0RF长约2kb,含有编码病毒核衣壳的基因。第三个0RF只有300余个核苷酸，与第一、二ORF有部分重叠。已知HEV有2个基因型，其代表株为缅甸株(B)和墨西哥株(M)。中国株与缅甸株属同一型，两者的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93%和98%;墨西哥株属另一型，其核苷酸和氨基酸序列与缅甸株的同源性分别为77%和89%。HEV主要经粪-口途径传播，潜伏期为1060d，平均为40d。经胃肠道进入血液，在肝内复制，经肝细胞释放到血液和胆汁中，然后经粪便排出体外。人感染后可表现为临床型和亚临床型(成人中多见临床型)，病毒随粪便排出，污染水源、食物和周围环境而发生传播。潜伏期末和急性期初的病人粪便排毒量最大，传染性最强，是本病的主要传染源。HEV通过对肝细胞的直接损伤和免疫病理作用，引起肝细胞的炎症或坏死。临床上表现为急性戊型肝炎(包括急性黄疸型和无黄疸型)、重症肝炎以及胆汁淤滞性肝炎。多数患者于发病后6周即好转并痊愈，不发展为慢性肝炎。孕妇感染HEV后病情常较重，尤以怀孕69个月最为严重，常发生流产或死胎，病死率达10%20%。对HEV的感染最好作病原学诊断，否则很难与甲型肝炎相区别。可用电镜或免疫电镜技术检测患者粪便中的HEV病毒颗粒。尽管体外培养HEV方法已经取得一定进展，然而病毒培养的周期长，故仍不适宜临床检测。虽然也可用RT-PCR法检测粪便或胆汁中的HEVRNA，然而，病毒核酸仅在急性感染前期才可被检测出来，随着抗体滴度的增加，病毒会迅速下降。目前，临床诊断常用的方法是检查血清中的抗-HEVIgM或IgG，如抗-HEVIgM阳性，则可确诊患者受HEV感染；如血清中存在抗-HEVIgG，则不能排除是既往感染；因为抗-HEVIgG在血中持续存在的时间可达数月至数年。IgMELISA常用于临床检测HEV急性期感染。然而，抗-HEVIgM检测敏感性低，常常因为假阴性结果的发生而导致不准确性，为了排除假阴性结果，在检测中需要阳性质控物作为对照，在检测中，只有阳性质控物的检测结果正确，才能保证检测结果的可靠性。一般来说，用于临床检验室的质控品需要具备良好稳定性，预期结果已知，无已知的生物传染危险性和单批可大量获得等性质。通常来说，用于抗-HEVIgM检测的质控物为来自于病人或者献血员的含有已知量抗-HEVIgM的血清或血浆与正常血浆或血清的混合物，使用此种阳性质控物有很多显而易见的缺点，如价格较昂贵，可能存在医学伦理问题，有潜在的传染危险性，在存在IgG和IgM的血清中PCR检测阳性率达51%。并且，因为抗-HEVIgM常出现在病毒感染的早期，既急性期，在感染数月后抗体滴度将逐步衰退，通常来说，黄疸期出现的第26天，IgM抗体检出率为73%，1-4个月，检出率为50%，6-7个月时则只有6%，第八个月时则完全无法检出，这也增加了获得此类阳性质控物的难度，使其不能大量获得。为了克服传统质控物的上述缺点，人们不断寻求此类质控物的替代品。由鼠抗体可变区和人抗体恒定区组成的基因工程嵌合抗体质控物因此发展起来，在某种程度上克服了传统质控物的缺点。然而，此类质控物的制备涉及杂交瘤技术，重组DNA技术等，较为复杂，延长了质控物的制备周期，并且此类抗体的亲和力较之真实的人类标本低。
发明内容本发明的要解决的第一个技术问题是提供一种戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物。本发明要解决的另一个技术问题是提供戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物的制备方法。戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，为兔抗人HEV-lgG和人IgM嵌合抗体，以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺交联构成。所述兔抗人HEV-lgG为多克隆抗体。所述人IgM为市售产品，来源于戊肝IgM病毒抗体诊断试剂盒，北京万泰生物药业有限公司。戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物的制备方法，包括如下歩骤(1)用HEV抗原免疫新西兰大白兔，得到含多抗的血清；(2)纯化兔抗人HEV-lgG;(3)兔抗人HEV-lgG和人IgM交联形成嵌合抗体。所述用服V抗原免疫新西兰大白兔，得到含多抗的血清是指采用皮内多点注射免疫法，免疫新西兰大白兔，经一次基础免疫和多次加强免疫，得到含多抗的血清。所述纯化兔抗人HEV-lgG的方法是采用Amersham公司HiTrapproteinAHP纯化抗体。所述兔抗人HEV-lgG和人IgM交联形成嵌合抗体是指取纯化后的兔抗-HEVIgG和IgM适量，在MES交联缓冲液中交联，PBS透析去除小分子，即得。在本研究中，我们拟用一种化学交联方法建立的兔抗HEV-lgG和人IgM嵌合抗体替代传统的血清作为质控物。利用EDC(l-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺)作为此两种抗体的交联剂形成嵌合抗体，因为兔抗-HEVIgG可与商品试剂盒中标记了酶的抗原结合，人IgM能与试剂盒中包被在微孔板上的特异识别人IgMFc片段的抗人p链结合，故此嵌合抗体可用于抗-HEVIgM检测的质控物。临床诊断HEV常用的方法是检査血清中的抗-HEVIgM，如抗-HEVIgM阳性，则基本可确诊患者受HEV感染。为了避免检测中假阴性结果的出现，确保检测结果的可靠性，需要一种含有的HEV抗体的阳性质控物。检测中使用阳性质控作为对照，虽然不能增加检测灵敏性，但是可以提供信息帮助发现检测中可能存在的问题，提高HEV筛查过程的总体质量。在本研究中，我们采用化学的方法将兔抗-HEVIgG和人-IgM交联在一起得到嵌合抗体，可用于免疫分析中HEV检测的阳性质控物。首先我们通过用HEV基因重组抗原免疫家兔，获得的兔抗-HEVIgG多克隆抗体经过蛋白A-Sepharose亲和层析的方法加以纯化。兔抗-HEV多克隆抗体被纯化以后，我们用SDS-PAGE蛋白电泳分析其纯度和用紫外分析仪测定其260nm和280nm吸光度计算抗体浓度。实验结果表明纯化后的抗体纯度较好，没有其他杂质，并且浓度较高，可用于下一步的交联实验。纯化后的兔抗-HEVIgG和人-IgM因其含有氨基和羧基，故可用化学交联剂EDC将二者交联形成嵌合抗体。交联后所得到的嵌合抗体经过商品试剂盒ELISA检测发现其仍保持较好的活性，表明交联剂EDC并没有影响嵌合抗体和包被在微孔板上的抗人IJ链及酶标抗原的反应。我们构建的此嵌合抗体阳性质控物不仅可用于IQC(lnternationalQualityControl,室内质量控制)也可用于EQA(ExternalQualityControl,室间质量评价)。因为此种质控物均一，稳定，安全，可提高临床实验室常规工作中批间，批内样本检测的一致性，而且可以客观的评价一实验室的测定结果与靶值的差异，使各实验室之间的结果具有可比性。传统的阳性质控通常是含有已知量的抗HEV抗体的阳性血清或血浆与阴性基质的混合物，我们构建的此嵌合抗体阳性质控，克服了传统的阳性质控的显而易见的缺陷，比如因为抗HEV-IgM在病毒感染六个月后既会消失，从而增加了获得高滴度抗HEV-IgM的难度，从而带来一系列的经济和伦理问题，并且传统的质控血清具有潜在的感染危险性。重组基因工程抗体含有鼠可变区基因和人恒定区基因，也可用于免疫分析中的阳性质控。此类基因工程嵌合抗体可持续大量获得，并保持较一致的均一性和特异性，然而，此类抗体的产生比本研究中的化学交联方法产生的嵌合抗体要复杂的多，因为其涉及杂交瘤技术和重组DNA技术等，延长了整个制备的周期。另外，针对一个抗原或单一抗原决定簇的单克隆抗体不能正确地模拟人类血清样本，因此，针对人血清中抗体的复杂性，在某些情况下需要多个基因工程抗体来识别不同抗原或者同一抗原的不同表位。相对此而言，我们构建的来自于多克隆抗体的嵌合抗体与真实的人类样本和抗原的亲和性相似，故更加适宜用作阳性质控。本发明的创新点在于本发明构建的用于免疫分析HEV的嵌合抗体质控物适用于EQA和IQC。利用化学交联方法构建抗HEVIgM质控物在国内外仍属首次。该指控物可在保持相对均一的前提下重复生产，相对稳定，易于高滴度大量获得，没有潜在的生物传染危险性，较为经济，不涉及医学伦理学问题，并且其与抗原的亲和力较高。是一种良好的阳性质控物。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一歩说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为SDS-PAGE电泳图*，*20kD处为IgG轻链，50kD处为IgG重链。图2为稳定性实验结果，图2-l为l:100稀释，图2-2为l:50稀释。具体实施例方式以下实施例中涉及的主要材料和试剂弗氏完全佐剂，SIGMA，美国弗氏不完全佐剂，SIGMA，美国蛋白电泳Marker,天根生化，中国Human-IgM,友谊中联，中国HiTrapproteinAHP，Amersham，美国MES，SIGMA，美国EDC,Pirece，德国无水乙醇，北京化学试剂公司，中国异丙醇，北京化学试剂公司，中国丙烯酰胺，北京化学试剂公司，中国过硫酸铵，北京化学试剂公司，中国SDS,Serva，德国氯化钾，北京化学试剂公司，中国氯化钠，北京化学试剂公司，中国磷酸二氢钠，北京化学试剂公司，中国TEMED，Biosharp，美国酶标仪，Labsystems，芬兰洗板机，拓普分析仪器有限公司，中国蛋白分析仪，Eppendorf，德国酶标板，Corning,美国纯化试剂的制备(1)中和液1MTris-HCl，pH9.0:，80ml蒸馏水溶解12.llgTris，加浓盐酸调pH至9.0(约7.5ml)，加水定容至lOOml。(2)Bindingbuffer:20mM磷酸钠，pH7.0，3.8012g磷酸钠溶于500ml水中，用7浓盐酸调pH至7.0(约1.5ml)。(3)Elutionbuffer:0.58%(v;v)冰醋酸NaCl(0.15M)溶液，NaCl(0.15M)溶液4.383gNaCl溶于500ml水中，再加入1.45ml冰醋酸。蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制(参见分子克隆下册P1716)(1)lXTris-甘氨酸电泳缓冲液可配5X储存液，900ml去离子水中加15.lgTris碱和94g甘氨酸，再加50mllO。/。SDS(m/V)，用去离子水补至1000ml。(2)考马斯亮蓝染色液0.25g考马斯亮蓝R-250溶于100ml甲醇冰醋酸溶液中，滤纸过滤除去颗粒物质。甲醇冰醋酸溶液500ml甲醇、400ml水、100ml冰醋酸混合。(3)色液500ml甲醇、400ml水、100ml冰醋酸混合。(4)30%丙烯酰胺储存液29g丙烯酰胺，lgN,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于80ml水中，37'C使之完全溶解，加水定容到100ml，过滤，Ph<7.0。4'C避光保存。(5)10%过硫酸铵取lg过硫酸铵用水配成总体积10ml。(6)1.5mol/LTris:800ml的蒸馏水溶解181.6gTris碱，加浓硫酸调pH值到所需值，加水定容到1L。(7)10%SDS:用900ml水溶解lOOg电泳级SDS。加热到68°C并用磁力搅拌器搅拌溶解，若需要，加几滴浓盐酸调节Ph到7.2，用水定容到1L。(8)50mM/LTris-HCl:800ml的蒸馏水溶解6.06gTris碱，加浓硫酸调pH值到所需值，加水定容到1L。(9)100mM二硫苏糖醇20ml0.Olmol/L乙酸钠溶液(Ph5.2)溶解0.309DTT，过滤除菌，-20"储存。ELISA检测和交联试剂(1)包被缓冲液50mmol/l碳酸盐缓冲液(pH9.5)，碳酸钠0.32g，碳酸氢钠0.58g，加水稀释至200ml。(2)MES交联缓冲液:0.1MMES,0.9%NaCl，pH4.5-5.0，500ml水、10.66gMES、4.5gNaCl用NaOH调pH到4.5-5。PBS交联缓冲液10mMPBS,159mMNaCl，pH7,4500ML水、1.9gNa3PO:!*12H20、4.65gNaCl用HC1i周pH到7.4。实施例1:兔抗人HEV-IgG的制备一.材料1.新西兰大白兔，健康雄性，体重2.5kg左右，北京幸福动物养殖场。2.抗原NE2，批号20060829,含量1.817mg/ml，北京万泰生物药业有限公司。3.戊肝IgM病毒抗体诊断试剂盒，北京万泰生物药业股份有限公司。二.方法1.血清制备耳静脉采血，用1.5mle卯endorf离心管收集l-2ml血液，以便日后做对照。将兔血在室温下静置数小时，将血清移至一新的离心管中,5000rpm离心10分钟收集血清，置血清于1.5ml管中，-70。C保存。2.抗原制备取10ii1抗原原液，用注射用0.9%生理盐水稀释至lml(含量为20ug/ml)。取lml完全福氏佐剂与抗原等体积混合(用lml注射用水溶解抗原)，吸入两只5ml注射器内，反复推拉混合，使之乳化成油包水的乳化悬液(检测是否乳化2ml注射器，滴一滴乳剂于冷水表面，合格乳剂液滴应保持在水面完整而不分散。)3.基础免疫和加强免疫取5tU抗原原液，用注射用水稀释至lml，加入lml完全弗氏佐剂或不完全福氏佐剂(基础免疫用CFA，加强免疫用IFA)，共制成2ml乳剂，每只注射lml乳剂。免疫途径为背部皮内多点注射免疫法。每次免疫后每只兔取血约1.5ml做ELISA检测，将兔血在室温下静置数小时，将血清移至一新的离心管中，5000rpm离心10分钟收集血清，置血清于1.5ml管中，-70°C保存。4.透析袋处理把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，在大体积的2y。(W/V)碳酸氢钠和lmmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。酉己EDTA:500ml水、0.146gEDTA，用NaOH调pH到8.0;500mlEDTA中加10gNaHCO3。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在lmmol/LEDTA(pH8.0)中将之煮沸10分钟。冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。,用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。5.ELISA检测抗体滴度(l)兔血清包板取1(H4兔血清用包被缓冲液稀释至100(^1(1:100),从这1000W稀释后的血清中取用包被缓冲液稀释至1000ri(1:1000)(2)包被首先将稀释后的兔血清(1:100和1:1000)于碳酸盐缓冲液中包被聚苯乙烯固相，每种稀释度包被两孔，每孔100W，4。C下过夜，形成固相抗体，用洗板机洗板五次，拍干。(3)封闭20%小牛血清封闭，每孔150W，37。C2小时，用洗板机洗板五次，拍干。(4)加酶加入酶标记抗体各IOOW，轻拍混匀。37'C温育40分钟；(5)洗涤用洗板机洗板五次，拍干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)(6)显色加入酶底物A，B液各50W,温育显色测定.37'C闭光15分钟。加终止液每孔各50W，终止反应。(7)测定:用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。6.亲合层析纯化兔抗HEV-IgG(1)试剂及样品制备血清10000xg离心10分钟，去除细胞和脂类，0.45ym滤膜过滤。试剂如上所述，所有配制试剂的水及化学物质均需高纯度，使用前用0.45ym滤膜过滤。(2)收集管准备于每个收集管中加入1MTris-HCl，PH9.0中和收集组分以防止酸性洗脱液影响抗体效价，比例为310iU/ml收集组分。(3)装柱注射器中装满Bindingbuffer,安装至层析柱上，逐低加入Bindingbuffer以防止将气泡带入柱中。(4)打开柱末端螺旋盖。(5)10倍柱体积的Bindingbuffer以lml/min(30滴/min)的流速洗柱(lml柱)。(6)上样注射器上样lml。(7)10倍柱体积的Bindingbuffer洗柱，至无蛋白流出(OD<0.2)。(9)测OD值。(10)5倍柱体积的20%乙醇洗柱,4-8度储存于20%乙醇中。7.蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验配制5%分离胶(适用于分子量为60-200kD的蛋白质)，小心注入玻璃板间隙内，至高度为llcm,上覆水饱和异丁醇层，隔离空气，室温聚合30-60分钟，倾去覆盖物，吸水纸吸干残留液体，配制积层胶，注入分离胶上端，高度为lcm,小心插入梳子，避免气泡产生，室温聚合30-45分钟。20ul样品加入等体积2X上样缓冲液混匀，IOO'C加热5分钟。每孔上样20iU，首先以8V/cm进行，待样品进入分离胶后调整为15V/cm，直至溴酚兰抵达分离胶底部。考马斯亮兰蓝染色将凝胶浸泡于考马斯亮兰染液中，振荡染色4小时，脱色液脱色至蛋白条带清晰时，分析抗体的条带。分离胶和基层胶配制方法如下(1)分离胶配制(单位ml):水2.330%丙烯酰胺5.01.5mol/LTris(pH8.8)2.5腦SDS0.110%过硫酸铵(交联剂)0.1TEMED(催化剂)0,004(2)5%积层胶的配制(单位ml):水3.430%丙烯酰胺0.831.5mol/LTris(pH6.8)0.6310%SDS0.0510%过硫酸铵0.05TEMED0.0058.蛋白浓度测定测纯化后的0D值，用下述公式计算蛋白浓度蛋白浓度(mg/ml)=1.45A28。_0.74A260三.结果1.动物免疫新西兰大白兔2只，健康雄性，体重2.5kg左右，免疫前耳缘静脉取血，用1.5ml离心管收集l-2ml血液，制备阴性对照血清，以便日后做对照。取10nl抗原原液，用注射用水稀释至lml(含量为20ug/ml)。基础免疫取lml弗氏完全佐剂与抗原等体积混合(用lml注射用水溶解抗原)，加强免疫则用弗氏不完全佐剂共制成2ml乳剂，每只家兔注射1ml乳剂，免疫途径为皮内多点注射免疫法。每次免疫后每只兔取血约1.5ml，ELISA检测抗体滴度，具体免疫情况见表1。每次免疫的时间间隔为两个星期。表l:动物免疫免疫次数抗原剂量乳剂量取血ELISA初次免疫共lOullml/只(10ng/ml)阴性对照一次加强共5ullml/只(5ngml)二次加强共5ullml/只(5ng/ml)取血检测三次加强共5ullml/只(5ng/ml)取血检测四次加强共6ullml/只(5ng/ml)取血检测五次加强共5ullml/只(5ng/ml)取血六次加强共5ullml/只(5ng/ml)取血检测2.ELISA检测抗体滴度结果ELISA方法检测阴性对照血清和各次加强免疫后血清抗体滴度，以发现是否产生免疫效果。取10W兔血清用包被缓冲液倍比稀释至1:100,1:1000，1:10000，1:105。每个稀释度均做副孔，经过包被，封闭，加酶和显色后，双波长450nm/630nm测定OD值。具体结果见表2。实验结果表明，与阴性对照值相比，随着免疫次数的增加，两只家兔抗体滴度逐渐增加，两只家兔抗血清各稀释度OD值最终最高分别可达0.844,1.650，，2.051，0.133;和1.591,3.125,3.032，0,364，表明免疫达到预期效果，产生了较高滴度的抗体，并且发现l:IOOOO稀释效果较好。表2:ELISA实验结果f稀释阴性一次二次三次四次五次六次兔号倍数对照加强加强加强加强加强加强1:1000.0750.8521.1121.5920.2591.0310.8440.0870.8130.6701.2250.2940.9750.6861:10000.0111.1242.7782.8821.4281.9751.477l号0.0071.1702.7462.8340.9381.6941.6501:100000.1050.3551.8812.0391.2601.4691.6740.0240.3011.7551.9221.3541.4922.051121:1050Oil0.0220.0660.0880.09601460.1310.0190.02000580.02500670.1600.1331:10600130.0220.0180.0140.Oil00130.0120.0110.Oil00150.01000120Oil0.0101:1000.0091.0632.2552.0930.8241.4961.5910.0080.6562.3132.1320.9591.7830.7441:10000.0191.3563.8823.6453.1802.8172.7272号0.0221.5193.6103.6073.1533.0603.1251:100000.0540,7393.3873.5661.9553.1822.9430.Oil0.6993.3483.4752.4113.0813.0321:1050.Oil0.0210.1350.2830.0850.4030.3640.Oil0.0470.2600.1760.1870.4520.2831:1060.0120.0100.Oil0.0230.Oil0.0100.0120.0100.Oil0.Oil0.0510.0130.0230.Oil*表中数值为450nm/630nm下OD值第六次加强免疫后，兔颈动脉放血，置于50ml离心管中，兔血清离心，分装小管，2号兔38ml,l号兔14ml以备日后纯化。3.抗体纯化实验结果葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变TO及离子强度可洗脱结合于SPA-S印harose柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。在此步实验中，我们采用Amersham公司HiTrapproteinAHP纯化抗体。首先按照上文所述方法配制中和液，Bindingbuffer,Elutionbuffer,上述所有试剂经0.45um滤膜过滤。亲合层析收集洗脱组分，通过蛋白浓度测定和蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果判断纯化后抗体的浓度和纯度。用公式计算蛋白浓度蛋白浓度(mg/ml)=1.45A加)-0.74A260,。实验结果表明纯化后抗体浓度可达10mg/ml，并且抗体纯度达到预期要求，没有杂带(见图1)。ELISA检测纯化后抗体活性，结果见表3，实验结果表明，抗体活性较好，可进行交联实验。表3:抗体活性检测稀释倍数OD值OD值(复孔)阳性1:1001.9911.478对照1:10003.7283.9321:100003.7193.817纯化700Pg/ml4.4314.373后样70Pg/ml5.9094.239品(4)74g/ml4.0554.496实施例2:抗体交联一.方法1.兔抗HEV-IgG与人IgM交联(1)取用MES交联缓冲液透析后的(约180U1)及(约427"1)(lmglgG及lmglgM)(2)平衡EDC至室温(3)混合透析后的上述两种蛋白。(lmglgG及lmglgM)(4)取2.5mgEDC，溶于250ul水中，取100u1加入至反应体系。(5)室温反应2小时。(6)用PBS透析过夜(1000ml)透析过夜，其间换液三次，间隔放于4度，并且搅拌。2.ELISA测定嵌合抗体滴度(1)每孔加入样品稀释液。(2)依次加入阴性对照，EDC交联产物和阳性对照(均做两孔)。(3)37。C温育30分钟，洗扳5次。(4)加入酶标抗体IOOW，轻拍混匀。37'C温育30分钟；洗扳5次。(5)加入酶底物A，B液各50W,温育显色测定.37'C闭光15分钟。(6)加终止液每孔各50W，终止反应。(7)测定用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。3.嵌合抗体与阳性血清稀释度比较(1)每孔加入样品稀释液。(2)用20%小牛血清将嵌合抗体和阳性血清按下列比例稀释1:IO，I:20,1:40,1:80，1:160,1:320,1:640。(3)依次加入阴性对照，各稀释度的嵌合抗体和阳性血清,阳性对照IOW。(4)37。C温育30分钟，洗扳5次。(5)加入酶标抗体IOOW，轻拍混匀。37'C温育30分钟；洗扳5次。(6)加入酶底物A，B液各50W，温育显色测定。37'C闭光15分钟。(7)加终止液每孔各50W，终止反应。(8)测定用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。二.结果EDC(l-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺)是一种可用于交联羧基和氨基的交联物，并且交联操作简单，利用此交联剂，我们可将两种含有羧基和氨基的抗体交联在一起形成嵌合抗体。所得到的嵌合抗体用戊肝IgM检测试剂盒检测是否有活性，并用未交联的兔抗-HEV-IgG作为对照。实验结果表明未交联的兔抗-HEV-IgGP/N(阳性和阴性的OD值)比值为2.5，而嵌合抗体P/N比值为198，说明嵌合抗体在ELISA检测中可达到质控物的标准。表4:嵌合抗体与阳性血清各稀释度比较稀释比例1:101:201:40h801:1601:3201:640嵌合抗体1.4090.8230.7270.5620.2780,1430.112阳性血清0.7860.8320,7110.5270.3160.1180.085阳性:1.814阴性0.006Cutoff=0.26+0.006实验结果可知，嵌合抗体与阳性血清的滴度均为1:160，因此构建的嵌合抗体更加类似于阳性血清。实施例3:交联抗体稳定性实验一.方法将交联物进行l:50，1:IOO稀释、放置于各条件下、保存不同时间后应用戊肝检测试剂盒进行ELISA检测。1.倍比稀释原液稀释液成分含20%小牛血清的稀释液(含防腐剂硫柳汞，庆大)15稀释以阳性样本原液进行1:50，取600W加稀释液至35ml以阳性样本原液进行1:100，取30014加稀释液至35ml2.具体条件将研究样本在37'C、室温、4°C、_20"以及-701:至室温反复冻融3次的样本稳定性。具体条件见表5:_表5:嵌合抗体稳定性研究__放置条件放置时间_37°C，相对湿度60-80%1天3天7天2周3周_￡J_室温(20-25°C，相对湿度20-25%)1天3天7天2周3周4周_^J5_2-8。C3天7天2周3周4周6周__-20。C2周4周<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3.样本分装分装前将生物安全柜清洁消毒，紫外照射30分钟；选用DNAse的螺口离心管(盖子有密封圈)，在生物安全柜内分装液体制备物，分装量为每支0.5ml(共60管)。4.鉴定应用商品试剂对各浓度、不同温度保存样本进行ELISA检测，观察其稳定性。实验中使用同一批次试剂，同一仪器、相同耗材并经同一人员操作、严格按操作说明进行。二.结果将交联后得到的嵌合抗体进行1:50，1:100稀释，在生物安全柜内分装，分装量为每支0.5ml(共60管)，每个条件下设副管，放置于各温度条件下37°C、室温、4°C、-20°C，-70。C以及反复冻融3次，保存不同时间后应用戊肝检测试剂盒进行ELISA检测样本稳定性。实验中注意使用同一批次试剂，同一仪器、相同耗材并经同一人员操作、严格按操作说明进行。实验结果见图2。实验结果表明，嵌合抗体在37。C至少保持稳定一个月，在室温、4'C则至少为两个月，而在较低温度如-2(TC，-70匸和反复冻融条件下不太稳定。因此，我们认为室温两个月内可能是此嵌合抗体的较适宜保存条件。权利要求1.戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，其特征在于为兔抗人HEV-IgG和人IgM嵌合抗体，以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺交联构成。2.根据权利要求1所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，其特征在于所述兔抗人HEV-lgG为多克隆抗体。3.根据权利要求l所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，其特征在于所述人IgM为市售产品。4.戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物的制备方法，包括如下步骤(1)用HEV抗原免疫新西兰大白兔，得到含多抗的血清；(2)纯化兔抗人HEV-lgG;(3)兔抗人HEV-lgG和人IgM交联形成嵌合抗体。5.根据权利要求4所述用HEV抗原免疫新西兰大白兔，得到含多抗的血清是指采用皮内多点注射免疫法，免疫新西兰大白兔，经一次基础免疫和多次加强免疫，得到含多抗的血清。6.根据权利要求4所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物的制备方法，其特征在于所述纯化兔抗人HEV-lgG的方法是采用Amersham公司HiTrapproteinAHP纯化抗体。7.根据权利要求4兔抗人HEV-lgG和人lgM交联形成嵌合抗体是指取纯化后的兔抗-HEVIgG和IgM适量，在MES交联缓冲液中交联，PBS透析去除小分子，即得。全文摘要本发明公开了一种戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物及其制备方法，属于临床检验学和生物
技术领域：
。戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，其特征在于为兔抗人HEV-IgG和人IgM嵌合抗体，以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺交联构成。本发明的创新点在于本发明构建的用于免疫分析HEV的嵌合抗体质控物适用于EQA和IQC。利用化学交联方法构建抗HEVIgM质控物在国内外仍属首次。该质控物可在保持相对均一的前提下重复生产，相对稳定，易于高滴度大量获得，没有潜在的生物传染危险性，较为经济，不涉及医学伦理学问题，并且其与抗原的亲和力较高。是一种良好的阳性质控物。文档编号G01N33/576GK101676726SQ200810222520公开日2010年3月24日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者括张,瑞张,李金明,王露楠申请人:卫生部北京医院