专利名称：：检测烟草脆裂病毒的细胞株、单克隆抗体和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测烟草脆裂病毒的细胞株、单克隆抗体和试剂盒，属于检验检疫领域和生物
技术领域：
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背景技术：
：烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)属于烟草脆裂病毒属(Tobravirus)。TRV通过生于土壤的线虫(TrchodorusandParatrichodours)传播的。线虫往往会在排水不良的地方发现。TRV是这种土上引起病害的主要因素。在这种地方TRV持续存在，并通过当地的线虫传播到敏感植物种类上。许多种类的杂草是病毒主要的所在地，马铃薯以及其它一些农作物是次要场所。TRV分布广泛，可以侵染大量的植物种类，在马铃薯、烟草、观赏植物的块茎上会引起重要的经济损失。该病毒目前是我国的检疫生物之一。烟草脆裂病毒是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体，能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，也可以鉴定宿主植物生长点的基因，因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。目前，检测TRV的方法主要采用进口抗血清检测试剂盒进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以及用电镜直接观察组织中的病毒粒子。从已有报道看，目前国内外对TRV的血清学检测方法均基于TRV多抗血清而建立的，商品ELISA检测试剂盒也是多抗血清，然而多抗存在非特异性高、准确性和均质性差、产量有限等不足，难以满足日益增长的花卉生产中对病毒的检测需求；电镜检测需要昂贵的设备而不能普及应用。因而迫切需要建立快速、准确、简便的检测方法，为该病毒病的诊断提供技术支持。
发明内容本发明要解决的第一个技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强的检测烟草脆裂病毒的单克隆抗体及分泌该抗体的单克隆细胞株。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种含上述单克隆抗体的检测烟草脆裂病毒的试剂盒。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案检测烟草脆裂病毒的单克隆抗体，由细胞株3C3分泌得到，该细胞株的保藏号为CGMCCN0.2679。单克隆细胞株3C3，保藏号为CGMCCN0.2679。单克隆细胞株3C3用于制备检测烟草脆裂病毒的试剂的用途。检测烟草脆裂病毒的试剂盒，由以下试剂组成TRV单克隆抗体0.lml(浓度为lmg/ml)AP标记羊抗鼠IgG0.lml(Sigma公司产品，浓度为lmg/ml)对石肖基苯磷酸酉旨(p-nitrophenylphosphate,PNPP)0.15g阳性对照(含烟草脆裂病毒烟草叶片汁液)2ml3阴性对照(健康烟草叶片汁液)2ml以上试剂均保存于4t:下96孔ELISA反应板10块样品稀释液ELISA封闭液(10X)l瓶(质量-体积百分比浓度为20%的脱脂奶粉溶液，脱脂奶粉为光明公司产品)本研究通过TRV病毒的动物免疫、细胞融合、筛选、克隆和腹水制备，获得了l株TRV特异性单抗，并用这些单抗建立了对TRV有特异性反应、而与BBWVl、BBWV2、CarMV、CMV、PVX、PVY、SCMV、TMV、ToMV和TuMV等病毒均无反应的ACP-ELISA检测方法。单克隆细胞株3C3，保存于中国普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCCNO.2679，保藏日期2008年09月26日，地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101。烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗TRV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞(3C3)，并制备它的单抗腹水。单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10—6，抗体类型及亚类均为IgGl，而单克隆抗体的轻链均为k链。Western-blot分析表明，该株单抗都能与TRV的22.3KD外壳蛋白亚基特异性结合。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测TRV的方法。病叶作1:400倍稀释、提纯TRV病毒浓度为18ng/mL(每孔的病毒绝对量为1.8ng)时，该方法仍能检测到病毒。本发明的优点是本发明首次制备了TRV的单克隆抗体，建立了抗原包被ELISA(ACP-ELISA)检测方法。TRV特异性单克隆抗体，具有特异性强、均质性好、可无限量生产等优点，从而使以单克隆抗体建立的ACP-ELISA血清学方法具有准确性强、易标准化和大规模生产等特点。此法也可有效用于田间TRV的检测。尽管少有文献报道TRV在我国的发生，但TRV作为检疫性病害，TRV抗体的制备具有重要的现实意义。TRV单克隆抗体的获得及检测方法的建立，将为该病毒病的快速诊断提供技术支持，同时为研究TRV侵染寄主的分子机理及基因沉默研究中打下基础。下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为纯化的TRV病毒粒子。图2为TRV外壳蛋白Western-blot检测，其中1:感病叶汁液；2:健康叶汁液。具体实施例方式实施例1:单克隆抗体的建立和筛选—.材料和方法1.病毒、培养基TRV，本实验室保存。RPMI-1640培养基、HT、HAT、抗体类型及亚类鉴定试剂盒、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG均为Sigma公司产品。2.烟草脆裂病毒的提纯以实验室保存TRVPpK20株系的基因组RNA1和RNA2的菌液相同体积混合共浸润本氏烟，10-14d后收集病叶，并参照Hsu等(HsuHT，KimJY，LawsonRH.Purificationoflilysymptomlessvirusanddetectionofthevirusinlilies.PlantDisease,1995，79:912-916.，百合无症病毒的纯化及在百合中的病毒检测，植物病害，1995，79:912-916)的提纯方法略作修改提纯病毒，即离心时在离心管底部加20%的蔗糖溶液垫，病毒提纯液经2%磷鸨酸(pH6.7)负染色后置日本JE0L公司的JEM-1200EX透射电镜下观察粒子形态。3.小鼠免疫、细胞融合、筛选与克隆参照青玲等(青玲，吴建祥，戚益军，等.蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体的研制及检测应用[J].微生物学报.2000,40(2):166-173.)报道的免疫程序用纯化的TRV病毒粒子免疫8周龄的BALB/C小鼠。参照吴建祥等(吴建祥，林福呈，李德葆，等.稻瘟病菌单克隆抗体的研制及其对附着胞形成的影响[J].微生物学报，2000，40(6):638645.)的方法将免疫小鼠的脾细胞和鼠SP2/0细胞融合。融合细胞培养5d后，用HAT培养基再换液一次，第10d用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-30%时，取上清用间接ELISA方法筛选抗体阳性？L筛选时包被抗原分别为提纯的TRV、TRV感染的本氏烟病叶汁液(1:30稀释)，并以健康叶汁液作阴性对照。选择强阳性反应的杂交瘤细胞，用有限稀释法连续克隆3次，最后一次克隆后检测为阳性的孔所得细胞株即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。4.腹水制备及抗体纯化单克隆抗体腹水制备按照施曼玲等的方法(施曼玲，吴建祥，郭维，等.芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用[J].微生物学报，2004，44(2):185-188.)进行，采用辛酸-硫酸铵方法(陈伯权，吴美英，叶群瑞.几种部分纯化单克隆抗体方法的比较[J].病毒学报，1990,6(2):122-126.)纯化单抗腹水，获得的纯化单抗于-7(TC保存。5.抗体类型及亚类鉴定和腹水效价测定采用Sigma公司的羊抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM标准抗血清，将纯化的腹水抗体作适当稀释后用琼脂双扩散法测定，24h后观察沉淀线，判断单克隆抗体的抗体类型及亚类。以提纯病毒(lPg/mL)包被ELISA板，倍比稀释的腹水作一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG为二抗进行间接ELISA测定单克隆抗体的腹水效价。6.Western-blot检测参照于翠等的方法(于翠，吴建祥，周雪平.番茄花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用[J].微生物学报，2002，42(4):454-457.)进行，用提纯病毒进行外壳蛋白亚基的SDS凝胶电泳，将电泳胶切割后一部分用于考马斯亮蓝染色观察，另一部分进行电转移，然后将电转移所得的硝酸纤维素滤膜与不同的腹水单抗进行Western-blot分析。7.TRV的ACP-ELISA检测方法参照Jiang等(JiangJX，ChenZX，ZhouXP.ProductionofamonoclonalantibodytosugarcanemosaicvirusanditsapplicationforvirusdetectioninChina[J]JournalofPhytopathology.2003，151:361-364.，蒋军喜，陈正贤，周雪平，甘蔗花叶病毒的单克隆抗体的制备及其在中国的病毒检测应用，植物病理学杂5志，2003，151:361-364)操作步骤进行ACP-ELISA，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)30倍稀释的病叶汁液100yL/孔加入ELISA板，TRV提纯病毒为阳性对照，健康叶汁液为阴性对照，5000-10000倍稀释单抗腹水为一抗，8000倍稀释AP标记的羊抗鼠IgG结合物为二抗，硝基磷酸盐(PNPP)为底物，用680酶联免疫检测仪(BIO-RAD)测OD，值，以P/N>2.1作为阳性判断标准。8.ACP-ELISA方法对TRV和不同病毒的特异性测定用提纯的BBWV1(蚕豆萎蔫病毒I)、BBWV2(蚕豆萎蔫病毒II)、CarMV(香石竹斑驳病毒)、CMV(黄瓜花叶病毒)、PVX(马铃薯X病毒)、PVY(马铃薯Y病毒)、SCMV(甘蔗花叶病毒)、TMV(烟草花叶病毒)、ToMV(番茄花叶病毒)和TuMV(芜菁花叶病毒)(均为浙江大学生物技术研究所保存、提供)(lug/mL)包被ELISA反应板，以免疫抗原TRV为阳性对照，以包被缓冲液作阴性对照，用上述ACP-ELISA法，测定单克隆抗体的特异性反应。9.ACP-ELISA方法检测灵敏度检测将TRV病叶汁液作1:101:10240倍比稀释、提纯的TRV病毒(5mg/mL)作1:10001:128000倍比稀释后，分别作为抗原包被ELISA板，并以对应稀释度的健叶汁液和健叶提纯液为阴性对照。将3C3单克隆抗体(最终筛选得到的单抗)腹水作l:5000倍稀释后利用ACP-ELISA方法测定检测灵敏度。二.结果1.烟草脆裂病毒的提纯用改进的方法提纯本氏烟病叶样品，在电镜下观察提纯液中有高浓度的病毒粒子，形态呈两种长，短不同的杆状，粒子完整(图1)。2.杂交瘤细胞的融合、筛选、克隆免疫的BALB/C小鼠脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按510:1的比例在50%PEG下融合，用HAT培养基筛选，6块96孔细胞板的融合率为100%。融合10d后换用HT培养基，当每孔杂交瘤细胞覆盖孔底5%_30%时，采用间接ELISA方法检测细胞培养上清中抗体的分泌情况，有198孔表现阳性反应，阳性率为35%。选择8个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，最后获得1株3C3能分泌抗TRV的特异性抗体杂交瘤细胞株。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株能良好生长，并稳定分泌抗体。进行保藏，并用于下述实验。3.腹水抗体制备、抗体类型及亚类鉴定、效价测定注射单克隆杂交瘤细胞的BALB/C小鼠，约7-10d后腹部膨大，采集腹水，以后每天取一次，每只小鼠可取5-20mL腹水。抗体类型及亚类鉴定结果表明3C3的抗体类型及亚类均为IgGl，而单克隆抗体的轻链均为k链；单抗腹水间接ELISA效价均达10—2(表1)。表lTRV单克隆抗体的特性单抗抗体类型腹水效价IgG含量(mg/mL)-------------------------------------3C31gGl，K链l(T55.424.Western-blot分析对提纯的TRV进行Western-blot分析表明，该株单抗都能与TRV的22.3KD外壳蛋白亚基特异性结合(图2)，说明所制备的单抗是针对TRV的22.3KD外壳蛋白亚基的特异6性抗体。5.ACP-ELISA的特异性检测ACP-ELISA检测表明，该株单抗仅对TRV有特异性反应，而与BBWVl、BBWV2、CarMV、CMV、PVX、PVY、SCMV、TMV、ToMV和TuMV等病毒均无反应(表2)，说明用这该株单抗建立的ACP-ELISA方法对TRV有很好的特异性。表2TRV单克隆抗体的特异性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>值。*加底物在室温反应30分钟后的0D46.检测灵敏度的确定灵敏度检测表明，用3C3单克隆抗体建立的ACP-ELISA方法对1:5100倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到l:ioo，对纯病毒的检测灵敏度可达18ng/mL，每孔的病毒绝对检出量为1.8ng。实施例2:烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA检测试剂盒一.试剂盒主要成分TRV单克隆抗体(纯化后)0.1ml(IgG含量lmg/ml)AP标记羊抗鼠IgG0.1ml(Sigma公司产品，浓度为lmg/ml)对硝基苯憐酸酯(p-nitrophenylphosphate,PNPP)阳性对照(含烟草脆裂病毒烟草叶片汁液)阴性对照(健康烟草叶片汁液)以上试剂均保存于4t:下96孔ELISA反应板样品稀释液即ELISA封闭液(10X)比浓度为20%的脱脂奶粉，脱脂奶粉为光明公司产^1.样品准备通常在样品处理后立即进行检测，处理样f样品的损失。待测样品假如是提取的植物汁液时，请用ELISA包被液以1:IO(汁液体积包被液体积)的比例进行稀释；也可以直接加入ELISA包被液研磨样品，比例为1:10-30(样品重量包被液体积)。应准备略多于检测所需的待测样品量，以确保加样过程的顺利进0.15g2ml2ml10块l瓶(质j体积百分:所用容器应当不与样品结合，以减少行。2.操作步骤(1)样品包被稀释好的样品以100iil/孔加入ELISA板，在37t:下孵育2h，或4t:(2)洗涤甩掉板孔中的溶液后每孔加满ELISA洗涤液(O.Olmol/LPBST，含体积_体积百分比浓度为0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液)，静置3min后倒掉，重复三次。洗好的板置于吸水纸上拍干。(3)封闭ELISA封闭液200iU/孔加入ELISA板，37t:下孵育lh，以封闭掉抗原没有结合的位点。(4)洗涤同(2)。(5)—抗将TRV单克隆抗体用ELISA封闭液以1:5000倍稀释后，100y1/孔加入ELISA板，37。C下孵育lh。(6)洗涤同(2)。(7)酶标二抗用ELISA封闭液将AP标记羊抗鼠IgG以1:1000倍稀释后，100ii1/孔加入ELISA板，37"下孵育lh。(8)洗涤用PBST洗涤4-6次后拍干。(9)PNPP显色PNPP以1:1(mg/ml)溶于硝基苯磷酸酯(PNPP)底物缓冲液中，100ii1/孔加入ELISA板，室温下显色0.5-lh。(10)终止反应3mol/L的NaOH50ii1/孔加入ELISA板。3.结果判定目测ELISA板，有明显颜色变化的孔为TRV阳性，而没有明显的颜色变化的孔为TRV阴性；也可用酶联免疫检测仪读数，405nm波长下测0D值。根据样品孔0D405值/阴性孔0D405值大于2.1为阳性，小于等于2.1为阴性。检测结果只有在阳性对照出现阳性结果而阴性对照没有颜色反应时有效。4.保存及有效期于28t:避光保存，有效期12个月。5.缓冲液配方ELISA包被液碳酸钠1.59g碳酸氢钠2.93g叠氮化钠0.2g加蒸馏水950溶解后调pH至9.6，定容至1000ml磷酸盐缓冲液(PBS，O.01mol/L，pH7.4):NaCl8gKC10.2gKH2P040.2gNa2HP0412H203g叠氮化钠0.2g加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000mlELISA洗涤液(O.01mol/LPBST):1000ml0.01mol/LPBS中力口0.5mlTween_20。ELISA封闭液0.Olmol/LPBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%(W/V，质量体积百分比浓度)硝基苯磷酸酯(PNPP)底物缓冲液乙二醇铵48.5ml8氯化镁0.05g叠氮化钠0.lg加蒸馏水400ml溶解，HC1调pH至9.8后加蒸馏水至500ml。4"保存。TRV单克隆抗体按照实施例1方法制备。阳性对照含烟草脆裂病毒烟草叶片汁液冷冻干燥，使用时加入2毫升0.Olmol/LPBS。阴性对照健康烟草叶片汁液冷冻干燥，使用时加入2毫升0.Olmol/LPBS。实施例3:对田间及实验室样品进行检测应用1.用3C3单克隆抗体建立的ACP-ELISA方法，利用本专利生产的烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA检测试剂盒对浙江大学生物技术研究所提供的i:5100倍稀释的病叶汁液检测均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到i:ioo。2.用3C3单克隆抗体建立的ACP-ELISA方法，利用本专利生产的烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA检测试剂盒对中国农业大学农学与生物技术学院病毒检测实验室提供的l:5IOO倍稀释的病叶汁液检测均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到i:ioo。3.用3C3单克隆抗体建立的ACP-ELISA方法，利用本专利生产的烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA检测试剂盒对清华大学生物系病毒检测实验室提供的l:5IOO倍稀释的病叶汁液检测均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到i:ioo。4.用3C3单克隆抗体建立的ACP-ELISA方法，利用本专利生产的烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA检测试剂盒对浙江大学生物技术研究所提供的浸润发病的本氏烟提纯病毒样品，检测灵敏度达18ng/mL，每孔的病毒绝对检出量为1.8ng。权利要求检测烟草脆裂病毒的单克隆抗体，由细胞株3C3分泌得到，该细胞株的保藏号为CGMCCNO.2679。2.单克隆细胞株3C3，保藏号为CGMCCNO.2679。3.单克隆细胞株3C3用于制备检测烟草脆裂病毒的试剂的用途。4.一种检测烟草脆裂病毒的试剂盒，由以下试剂组成TRV单克隆抗体0.1ml，IgG含量lmg/ml;AP标记羊抗鼠IgG0.lml，浓度为lmg/ml;对石肖基苯磷酸酉旨(p-nitrophenylphosphate,PNPP)0.15g;阳性对照(含烟草脆裂病毒烟草叶片汁液)2ml;阴性对照(健康烟草叶片汁液)2ml;以上试剂均保存于4t:下；96孔ELISA反应板10块；样品稀释液(10X)1瓶(20%的脱脂奶粉)。5.根据权利要求4所述的一种检测烟草脆裂病毒的试剂盒，其特征在于，所述TRV单克隆抗体由细胞株3C3分泌得到，该细胞株的保藏号为CGMCCNO.2679。全文摘要本发明涉及一种检测烟草脆裂病毒的细胞株、单克隆抗体和试剂盒，属于检验检疫领域和生物
技术领域：
。检测烟草脆裂病毒的单克隆抗体，由细胞株3C3分泌得到，该细胞株的保藏号为CGMCCNo.2679本发明的优点是本发明首次制备了TRV的单克隆抗体，建立了抗原包被ELISA(ACP-ELISA)检测方法。TRV特异性单克隆抗体，具有特异性强、均质性好、可无限量生产等优点，从而使以单克隆抗体建立的ACP-ELISA血清学方法具有准确性强、易标准化和大规模生产等特点。此法也可有效用于田间TRV的检测。TRV单克隆抗体的获得及检测方法的建立，将为该病毒病的快速诊断提供技术支持，同时为研究TRV侵染寄主的分子机理及基因沉默研究中打下基础。文档编号G01N33/577GK101735318SQ20081022590公开日2010年6月16日申请日期2008年11月5日优先权日2008年11月5日发明者任鲁风,吕玉峰,吴建祥,周琦,周雪平,李建光,梁新苗,武晓云,江丽辉,汪万春,汪琳,边勇,邓丛良,马新颖,高文娜申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局;浙江大学生物技术研究所