专利名称：蓝舌病病毒抗原的elisa检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及血清(浆)中蓝舌病病毒(BTV)抗原的双抗夹心ELISA检测方法及试齐u盒。
技术背景蓝舌病(Bluetongue disease, BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV) 引起，由库蠓等传播的反刍动物病毒性传染病。世界动物卫生组织(0IE)将其列为 上报动物疫病(0IE Terrestrial animal health code, 13th ed. 2004. Terrestrial Animal Health Code. Thirteenth Edition, Office International des Epizooties, Paris.)，在我国被列为一类动物疫病(http:〃www. ivdc.gov. cn/)。感染动物潜 伏期一般为5 12天，病程一般6 14天。反刍动物类感染后平均发病率30 40%， 死亡率20 30%，其中绵羊死亡率达80% 90%。近年来，蓝舌病在世界各地均有暴发。我国于1979年首次在云南宗师发现并分 离到BTV，至2000年已有29个省(市)检出羊BTV抗体，近年来牛群中发病也日益 严重。此病一旦暴发流行，就很难控制和消灭，因此及时准确地检测出BTV，对预防 和控制蓝舌病具有重大意义。蓝舌病病原也是牛/羊源原料或制品病毒安全性检测中 必检的主要疫病病原之一，在反刍动物的双边贸易中，各国出入境检验检疫机构规定 出口国必须提供无感染此病的健康证明。研制直接检测血清中BTV抗原的快速、便捷、适合现场使用的检测试剂盒具有很 强的实用价值和广阔的应用前景，对BT的防控具有重要意义。蓝舌病的确切诊断依赖于病毒的分离鉴定或特异性血清学试验，包括琼脂免疫扩 散、中和试验、ELISA及分子生物学检测等方法。以单克隆抗体(McAb)为基础的ELISA 以其高度的敏感性和特异性，且与相关病毒一鹿流行性出血热病毒(EHDV)均无交叉 反应，被国际动物卫生组织(0IE)确定为BTV血清学诊断的首选方法。该方法的快 速、经济及高通量，是其它检测方法所无法替代的。BTV是呼肠孤病毒科环状病毒属的典型病毒。环状病毒共有14个群，BTV群与EHDV 群有较强的交叉反应。通过血清中和实验证实，BTV群至少有24个血清型。因此，建 立一种可检出BTV群所有血清型的具有群特异性的ELISA检测方法并非易事。1989年 曾报道Hussein (Hussein A， Calisher C H， Holbrook F R， ef s丄1989. Detectionof bluetongue virus antigens in Culicoides variipennis by enzyme immunoassay. J Clin Microbiol, 27 (6): 1320-1323)等用捕获病毒的ELISA检测库蠓和BHK-21 细胞中的BTV，但未见可供使用的商品化ELISA试剂盒。在国内已有许多相关研究， 但尚无商品化的BTV检测试剂盒获准上市，国外仅见荧光抗体试剂，但价格昂贵，并 且很难获取，而商品化的BTV抗原检测试剂盒和BTV核酸检测试剂盒在国内、外均未 见上市。 发明内容本发明提供了血清(浆)中蓝舌病病毒(BTV)抗原的双抗夹心ELISA检测方法。本发明所提供的蓝舌病病毒抗原的ELISA检测方法，是用抗蓝舌病病毒VP7蛋白 的单克隆抗体作为包被及酶标抗体的双抗夹心ELISA检测方法。所述抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体可为一种BTV血清型群特异性抗蓝舌病 病毒VP7蛋白的单克隆抗体。具体来讲，本发明所提供的检测方法，可包括以下步骤1) 用抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体包被酶联板，洗板；2) 封闭经包被的酶联板，洗板；3) 加待测样品，洗板；4) 加酶标抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体，洗板；5) 加底物显色；6) 终止反应；7) 测定OD柳值。上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。步骤4)中的酶标抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体可为辣根过氧化物酶或碱 性磷酸酯酶标记的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。本发明还提供了一种检测蓝舌病病毒抗原的ELISA试剂盒。本发明所提供的检测蓝舌病病毒抗原的ELISA试剂盒，可包括作为包被及酶标抗 体的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。所述抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体为一种BTV血清型群特异性的抗蓝舌病 病毒VP7蛋白的单克隆抗体。所述酶标抗体可为经过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等标记酶标记的，优选 为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗蓝舌病病毒 VP7蛋白的单克隆抗体上。所述试剂盒还可包括显色液A液、显色液B液和终止液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液，所述终止液为2M貼04。为方便检测，所述试剂盒还可包括标准BTV阳性血清和标准BTV阴性血清。 此外，为方便使用，所述试剂盒还可包括检测用的洗涤液，如PBST等常规的洗涤试剂；封闭液，如PBST稀释的5%脱脂奶粉；包被液，如50mM碳酸盐缓冲液(pH 9. 5)等。本发明提供了一种蓝舌病病毒抗原的ELISA检测方法及试剂盒。用该试剂盒检测 了22种不同血清型的BTV标准病毒株，并以细胞病变反应(CPE)方法及市售直接荧 光素标记抗体BTV检测法进行验证，符合率100%，敏感性为100%，重复性CV值〈 10%，且与BTV相关病毒朋DV无交叉反应；用本发明的方法检测IOO份BTV阴性绵 羊血清，98份为阴性，特异性98%;用本发明的方法检测240份绵羊血清，与直接 荧光素标记试剂盒检测结果的符合率达95%。上述检测结果表明用本发明的试剂盒及 检测方法可对蓝舌病病毒抗原进行检测，具有较高的特异性及敏感性，可用于大规模 血清学检测、也适合做流行病学调查，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、蓝舌病病毒抗原的ELISA检测及其试剂盒的制备用本发明的方法对蓝舌病病毒抗原进行ELISA检测，具体方法包括以下步骤一、抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体的制备及鉴定1. BTV纯化选取BTV血清型5 (BTV-5)，以易感细胞朋K-21进行增殖培养， 将病毒培养液用PEG浓縮后，用浓度差为5X的CsCl梯度溶液进行差速离心，得到纯 化的BTV-5。纯化病毒经电镜观察、血凝试验(李洪源,王志玉等.病毒学检测.北京 人民卫生出版社，2006， 75-76.)及细胞病变效应实验(CPE)(殷震，刘景华等.动 物病毒学.北京科学出版社，1997,326-327.)验证具有典型蓝舌病特性。2. 动物免疫将纯化的BTV-5用PBS缓冲液稀释到300ug/mL，取0.5raL与弗氏 完全佐剂等体积充分混匀乳化。取BALB/c小鼠3只，背部皮下多点注射0.2mL。首次 免疫后15d进行二次免疫(佐剂改用弗氏不完全佐剂，免疫剂量和部位同首次免疫)， 2周后经尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法检测抗体效价，效价在1:8000以 上的小鼠即可进行加强免疫。加强免疫用无佐剂的病毒抗原0. 05mL尾静脉注射BALB/c 鼠，3天后即可进行细胞融合。3. 细胞融合及BTV群特异性单抗杂交瘤的筛选采用常规方法(朱立平，陈血清等.免疫学常用试验方法[M].北京人民军医出版社，2000， 23-74)进行细胞融 合及培养。用间接ELISA法检测细胞培养上清，将阳性上清孔细胞用有限稀释法进行 细胞克隆，经3 5次克隆，细胞株阳性率为100%者为BTV群特异性单抗阳性杂交瘤。4. BTV群特异性单抗阳性杂交瘤鉴定对所筛选单抗细胞株分别进行Ig亚类鉴 定，三株BTV群特异性单抗阳性杂交瘤细胞分别为IgGl、 IgG2b、 IgM亚类、K链；胞核型分析每个细胞内为96 120条染色体杂交瘤效价的测定分别为1: 27、 1: 26、 1:27;单抗杂交瘤的稳定性测定，所得到的3株杂交瘤细胞经2个月连续克隆培养，然 后在液氮中冻存6个月复苏，各细胞株分泌抗体的能力和稳定性均无改变，有较好的稳定性，以上结果表明获得了典型的单克隆融合细胞。5. 单克隆抗体的制备及特性鉴定同系鼠体内诱生法得到腹水，并用A蛋白亲 和层析法(朱立平，陈血清等.免疫学常用试验方法[M].北京人民军医出版社，2000, 57-58)纯化腹水得到单克隆抗体。纯化的单抗分别进行特异性测定，与鹿流行性出 血热病毒(EHDV)、背景源蛋白无交叉反应，具有良好的特异性；对单克隆抗体的效 价进行测定，三株单抗的效价分别为106、 108、 106。以上结果表明获得了稳定表达抗 蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其中三株命名为2B4、 1C11及 2E3。6. 纯化单抗的储存将纯化并经鉴定的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体中 加入甘油至终浓度30%，混匀后分装，于-30。C储存。二、 抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记采用"简易过碘酸钠法"标记单抗(细胞和分子免疫学技术)，标记步骤如下1. 称取6mg HRP溶解于蒸馏水中。2. 于上液中加入0. 2mL新鲜配制的0. lmol/LNal04溶液，室温下避光搅拌20min。3. 将上述溶液装入透析袋中，对0.001mol/L， pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4°C 过夜。4. 加20ul 0.2mol/L、 pH9. 5碳酸盐缓冲液，使溶液pH上升至9. 0 9. 5，立即 加入lraL (3. 75mg/mL)单抗溶液，室温避光搅拌2h。5. 加0. lraL新配的4rag/mL Na朋4液，混匀，置4°C 2h。6. 将上述液装入透析袋中，对O. 15mol/mL pH7. 4 PBS透析，4°C 2h。7. 取出透析袋，置PEG8000干粉中浓縮袋内液体至5mL，吸出，-2(TC保存。三、 蓝舌病病毒抗原(BTV) ELISA试剂盒的组装 1.抗体预包被条的制备1. 1包被取等量纯化的不同单抗2B4、 1C11及2E3混合后，用包被液(0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6)稀释至浓度为0. 25Pg/ML,稀释后抗体包被96孔酶标板， 100nL/孔，4t:过夜。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干。1.2封闭用PBST稀释脱脂奶粉至终浓度5X作为封闭液，每孔加入该封闭液 lOOixL， 37t封闭1 h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，装入96孔酶标板专用包装袋，用封口机封口后4x:保存。2.抗体HRP标记及鉴定2. 1抗体HRP标记采用"简易过碘酸钠法"标记单抗(细胞和分子免疫学技术)， 标记步骤见步骤二。2. 2酶标结合物的鉴定(1) 鉴定酶标结合物活性和免疫反应性(2) 测定酶标记率(3) 确定标记抗体最佳使用浓度2. 3酶工作液配制(1) 稀释缓冲液的配置以三蒸水配制pH7.4的PBS，内含O. 1%增敏剂聚乙二 醇、0.5%蛋白胨、0.5%。酶保护剂、0.5%。硫柳汞以及1%。土温20。(2) 酶工作液配制以所配缓冲液将标记酶稀释至1000倍使用浓度。3. 阴、阳性对照的制备3.1筛选出的阴性血清，每毫升阴性血清各加入1000IU青霉素和链霉素，除菌 过滤后分装，作为阴性对照。3.2以PBST将表达的BTV VP7蛋白稀释至浓度为2 u g/mL，每毫升加入1000IU 青霉素和链霉素，除菌过滤后分装，作为阳性对照。4. 25XPBST的配制NaCl: 100. Og， KC1: 0. 2g， MC12 6H20: 2. 5g， KH2P04: 5. 0g， Na2HP04 : 28 . 5g， tween-20: 12. 5mL，硫柳汞2. 5g，用蒸馏水定容至1000mL，加入O. 02%叠氮纳作 为防腐剂，除菌过滤后分装。5. 底物液配制(1) 底物液A:以三蒸水配制pH5.0醋酸盐缓冲液，内含0.5%过氧化脲。(2) 底物液B: TMB 200mg，无水乙醇(或DMEM) 100mL。6. 终止液用三蒸水配制2mol/L H2S04溶液。四、用本发明的试剂盒对蓝舌病病毒抗原进行ELISA法检测 1.准备(1)预热试验使用前将血清样品、试剂盒内试剂及酶标板升至室温。(2)阴、阳性对照及样品阴阳性对照要设平行孔，当用整个酶标板时，最好将 对照置于板的不同部分。2.加入对照和待测血清取待测血清100uL加入酶标孔，每板设阴、阳性对照 各2孔，敲击已加样板的一侧，以确保样品均匀覆盖孔底。加样后的酶标板置湿盒中37'C孵育lh，然后用PBST洗板3次，甩干。4. 加酶标抗体加入酶工作液(配制方法以稀释缓冲液稀释酶标抗体，稀释倍数1:1000) ， 100uL/孔，湿盒中37。C孵育lh，取出后PBST洗板3次，甩干。5. 加底物液显色加入底物液A， 50"L/孔，然后加入等量底物液B，室温避光 5 15min。6. 终止用2mol/L H2S04终止显色反应，50uL/孔。7. 测OD，值酶标板置酶标仪上测定0D45。值。8. 判定结果被检血清(P)与阴性对照(N)的0D45。值之比大于或等于2. 1，即 P/N值^2. 1，确定为阳性，P/N值〈2. 1，则确定为阴性。用该试剂盒检测了 22种不同血清型的BTV标准病毒株，并以细胞病变反应(CPE) 方法及市售直接荧光素标记抗体BTV检测法进行验证，符合率100%，敏感性为IOO %，重复性CV值〈10X，且与BTV相关病毒EHDV无交叉反应；用本发明的方法检测 IOO份BTV阴性羊血清，98份为阴性，特异性98%;用本发明的方法检测240份绵羊 血清，与直接荧光素标记试剂盒检测结果的符合率达95%。上述检测结果表明用本发 明的试剂盒及检测方法可对蓝舌病病毒抗原进行检测，且特异性及灵敏度较高。
权利要求
1、蓝舌病病毒抗原的ELISA检测方法，是用抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体作为包被及酶标抗体的双抗夹心ELISA检测方法。
2、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述抗蓝舌病病毒VP7蛋白 的单克隆抗体为一种BTV群特异性的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。
3、 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下 步骤1) 用抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体包被酶联板，洗板；2) 封闭经包被的酶联板，洗板；3) 加待测样品，洗板；4) 加酶标抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体，洗板；5) 加底物显色；6) 终止反应；7) 测定OD柳值。
4、 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述步骤4)中的酶标抗蓝舌 病病毒VP7蛋白的单克隆抗体为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记的抗蓝舌病病毒 VP7蛋白的单克隆抗体。
5、 一种检测蓝舌病病毒抗原的ELISA试剂盒，包括作为包被及酶标抗体的抗蓝 舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。
6、 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述抗蓝舌病病毒VP7蛋白的 单克隆抗体为一种BTV群特异性的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。
7、 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述酶标抗体为经过辣根过氧 化物酶或碱性磷酸酯酶等标记酶标记的。
8、 根据权利要求5或6或7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括显 色液A液、显色液B液和终止液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述 显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液，所述终止液为2M H2S04。
9、 根据权利要求5或6或7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括标 准BTV阳性血清和标准BTV阴性血清。
10、 根据权利要求5或6或7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括检 测用的洗涤液、封闭液和包被液中的一种或几种。
全文摘要
本发明公开了一种蓝舌病病毒抗原的ELISA检测方法及试剂盒。该检测方法是用抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体作为包被及酶标抗体的双抗夹心ELISA检测方法。该试剂盒包括作为包被及酶标抗体的抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体。用本发明的试剂盒及检测方法可对蓝舌病病毒抗原进行检测，具有较高的特异性及敏感性，可用于大规模血清学检测、也适合做流行病学调查，应用前景广阔。
文档编号G01N33/68GK101403759SQ20081022650
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者吕茂民, 尹惠琼, 李文超, 姝 杨, 章金刚, 高宏伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所