专利名称：：浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。
背景技术：
：大量研究发现，正常乳腺组织中存在着极少量的雌激素受体(Estrogenrec印tor:ER)和孕激素受体(Progesteronerec印tor;PR)，它们是具有高度亲和力的蛋白质。临床上通过对雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道乳腺癌ER、PR检测的阳性率分别为40%60%、30%左右。许多文献均已证实，ER、PR变化与乳腺癌病人预后密切相关，亦与其他公认的预后因素，如核分级、淋巴结转移及分期有关。Her-2，人表皮生长因子受体-2，是一种受体型的酪氨酸激酶。在20%-30%的乳腺癌中具有Her-2受体的过度表达。Her-2过度表达细胞表面的Her2蛋白水平较周围正常乳腺上皮细胞高出数十倍乃至数百倍。Her2是乳腺癌的预后因子，它的阳性状态与乳腺癌预后差相关。但是Her-2阳性乳腺癌患者只占2530%;而5060%Her-2阴性的患者是否能找到另外的分子标志，还有待研究。随着基因检测研究越来越多，更多的生物标志被作为预测乳腺癌复发风险的指标。在临床实际工作中，所用的方法尚不足以覆盖所有乳腺癌的风险评估，甚至不同的方法得到的结果之间也有出入，所以仍有必要寻找新的有价值的肿瘤标志物，不仅仅是为了诊断和预测复发风险，同时也可作为判断治疗敏感性的标志，甚至成为进一步研发药物的新靶点。在哺乳动物细胞中已发现了A-I共12型周期蛋白(cyclin)，它们在细胞周期的不同时相发挥作用。在Gl期发挥调控作用以cyclinD、C、E为代表，在M期则主要是cyclinA和B，cyclinA也作用于S期，而且即与CDK2结合也作用于CDK1，所以cyclinA2成为cyclins家族中的重要一员。目前对cyclinA2研究认为在受到各种刺激后可使细胞进入S期，当进入细胞周期后16个小时开始升高，24小时开始下降，维持时间短，cyclinA2与细胞癌变关系十分密切。
发明内容本发明的目的是提供一种浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。cyclinA2在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达完全不同，在乳腺癌内部也因细胞的恶性程度不同而完全不同，其精确的程度提供了判断乳腺癌分子特征的又一有价值的指标。CyclinA2单克隆抗体可用来制备浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。本发明所提供的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒，是免疫组化试剂盒，所述试剂盒包含CyclinA2单克隆抗体。本发明的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒为二抗试剂盒，其中一抗为CyclinA2单克隆抗体，二抗可为辣根过氧化物酶、生物素或胶体金等标记的IgG;所述试剂盒还包括进行免疫组化实验所需要的其他试剂，如封闭液，显色液及其他辅剂。一抗、二抗、封闭液，显色液及其他辅剂均可从商业途径获得。本发明的试剂盒还包含山羊血清，山羊血清作为封闭液。所述试剂盒还包含聚合物辅助剂。本发明的试剂盒还包含HRP标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体，HRP标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体作为二抗。所述试剂盒还包含增敏二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，本发明的二抗使用辣根过氧化物酶标记的，因此用增敏二氨基联苯胺显色。所述试剂盒还可包含苏木精。用本发明的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险，cyclinA2抗体的使用浓度是1:20的浓度，阳性的表达范围是580%，说明cyclinA2的精确表达和分布，并没有因抗体的浓度而影响结果。cyclinA2和Her2的Kapar分析没有相关性，说明两个指标把不同的患者分成了不同的层次，cyclinA2是另一个非常好的判断预后的指标。用本发明的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险是将乳腺组织制成石蜡切片，可以精确观察到不同区域细胞的表达量，结果更可靠。图1为cyclinA2的Kaplan-Meier生存曲线。图2为Her2的Kaplan-Meier生存曲线。图3为显微镜下观察免疫组化(HE)染色结果。具体实施例方式实施例1、用浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险一、cyclinA2作为预测乳腺癌复发风险的分子标志1)基因芯片分析从北京大学第三医院自2003年建立的乳腺癌组织标本库中选出6例3年内复发的浸润性乳腺癌患者的组织标本为复发组，再选择6例病理类型、治疗方法和流行病学特征均相同但3年以上未复发的同类患者为未复发组，另5例为进行良性乳腺病手术时取的正常乳腺组织为正常对照组，标本进行如下处理①采集的组织块在5分钟内放入液氮，②为确保采集的是肿瘤组织，对每一例组织进行细胞切片HE染色，并记录，以95%以上为肿瘤细胞的组织块进行基因芯片分析。Trizol法分别提取上述组织块的总RNA，其中5例正常乳腺组织的RNA相同比例混合作为对照。总RNA分别用反转录试剂盒反转录合成cDNA。以两种荧光Cy5-dCTP和Cy3-dCTP标记总RNA，与22k的人表达谱基因芯片(由北京博奥生物芯片有限公司合成)杂交，用LuxScan10KA双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描，用LuxScan3.0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后用Lowess方法对芯片上的数据进行归一化；以SAM(SignificanceAnalysisofMicroarrays)软件进行分析，FDR控制在5%以内，以1.5标准筛选差异表达基因(differentiallyexpressedgenes)，同时用Cluster3.0软件进行聚类分析，比正常乳腺组织高出1.5倍为高表达，将高表达的做成聚类图。分别分析复发组和未复发组高表达基因和低表达基因的差异，并通过博奥生物网提供的geneanalysisdatabase查找功能基因和相关的癌症进展。基因芯片分析结果表明，在高复发组筛选出82个上调的差异表达基因，92个下调基因，CCNA2(cyclinA2)在11例(l例未出结果)乳腺癌患者中均比正常组基因表达水平高，平均增殖比率为正常组织的3.13倍，复发和未复发患者的平均增殖比率分别为3.69比2.74。2)RT-PCR步骤l)中提取的总RNA为模板，5例正常乳腺组织的RNA相同比例混合作为对照，用引物PI和P2进行RT-PCR检测cyclinA2的表达水平。引物P1和P2由Invitrogen公司合成，引物PI和P2的核苷酸序列为CAGGCTGCTGATGCAGAAAG;GAACAGACCAACCTGGCATTA。lu1(0.3-0.5g)2.510.5ul(lOmM)0.5ul(lOuM)0.5n1(lOuM)0.5u1(lOU/ul)补加无核酸酶的H20至lj25u195°C30s，58°C30s，72°C30s,35个循环；72°ClOmin。步骤l)中提取的总RNA为模板，用引物PI和P2进行PCR扩增cyclinA2基因，RealtimePCR反应体系如下:模板10XBufferdNTPs彌Sr-Taq酶RealtimePCR反应程序为95。C3rain;然后进行测序与NCBI上公布的序列比对。RealtimePCR结果表明，与对照相比，复发组和未复发组的cyclinA2表达水平均增高。对照组定量平均值为0.003729，未复发组定量平均值为0.004161，复发组定量平均值为0.009507。上述实验结果说明cyclinA2在乳腺癌组织和正常乳腺组织中表达完全不同。cyclinA2在乳腺癌内部也因细胞的恶性程度不同而完全不同，cyclinA2可作为判断乳腺癌分子特征的又一有价值的指标。二、评估浸润性乳腺癌复发风险浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒由如下物质组成封闭液(山羊血清)、试剂1(聚合物辅助剂)、I抗(CyclinA2单克隆抗体)、II抗(HRP标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体)、DAB显色试剂盒、苏木精。随机选择随访信息完整的浸润性乳腺癌患者281例，其中，复发组51例，未复发组230例，乳腺良性病变患者60例。281例患者的中位随访时间为33个月，范围为8103个月，短于12个月的随访时间的患者21例，只占7.5%，而92.5%的患者随访时间均超过12个月，无病生存率为81.5%，中位无病生存时间28个月，患者的OS为90.9%。281例患者离体的乳腺组织制成石蜡切片用于浸润性乳腺癌复发风险评估，方法如下1)将石蜡切片依次将放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精；PBS冲洗切片两次，每次5分钟；2)步骤1)处理过的切片加入3%HA浸泡10miri，然后用蒸馏水洗3次，然后加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min(中火)，冷却至室温，重复1次，切片置于PBS中5分钟，洗2次；3)甩去多余的PBS液，滴加山羊血清(中杉金桥生物有限公司)，室温20分钟;4)吸水纸擦千切片反面和正面组织周围的山羊血清，滴加I抗-CyclinA2单克隆抗体(Neomarkers公司，1:20稀释)，4。C过夜，切片置于PBS中2分钟，洗3次；5)滴加试剂1，37。C孵育20分钟，试剂1为聚合物辅助剂(PV-9000)(中杉金桥生物有限公司)，然后用PBS洗3次，每次5分钟；6)滴加II抗-HRP标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体(中杉金桥生物有限公司)，37'C孵育30分钟，然后用PBS洗3次，每次5分钟；7)增敏二氨基联苯胺(DAB)显色，使用中杉金桥生物有限公司的DAB显色试剂合JUL。8)苏木精复染，依次用70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯脱水，最后用中性树胶封片，镜检。以细胞核出现棕红或棕褐色颗粒为cyclinA2蛋白质表达阳性，以阳性细胞的百分数多少分为4组普通光学显微镜，20倍视野，计数200个细胞，按阳性细胞比例分别定义为《5%为阴性(0)，625%为(1+)，2650%为(2++)，>50%为(3+++)。图3所示为显微镜下观察免疫组化(HE)染色后的结果。a为正常乳腺组织；b为正常乳腺组织周围的癌细胞；C为浸润性乳腺癌阳性细胞少于5%;d为浸润性乳腺癌阳性细胞6-25%;e为浸润性乳腺癌阳性细胞26-50%;f为浸润性乳腺癌阳性细胞多于50%。计算cyclinA2的表达率，应用SPSS15.0统计软件，分析cyclinA2对预测乳腺复发的敏感度和特异度，做Kaplan-Meier生存曲线，并用logrank(Mantel-Cox)检验确定差异有无统计学意义。用Cox回归多因素分析，评价不同因素对DFS和OS的影响。cyclinA2在浸润癌病例中的表达率分析结果表明60例正常组织中91.6%为cyclinA2表达阴性，大多数仅见12个阳性细胞，有8.3%为弱阳性1+(625%)，未见2++及以上的表达。cyclinA2在浸润癌病例中按表达率多少分为阴性(0)，l+、2+十、3+++四个组，每组病例数及所占比例如表l所示。分别以无病生存率(DFS)和总生存率(OS)做Kaplan-Meier生存分析，Kaplan-Meier生存曲线如图l所示，cyclinA2表达率和患者的复发风险改变在DFS组有明显统计学意义，logRank(Mantel-Cox)检验，(p=0.047)，而0S没有不同。阴性到2++组复发率随着表达率增高而增高，而在异常高表达组(3+++)，复发的风险反而比中等表达组复发率低，在阴性组复发率为7.6%，1+和2++分别为21.8%和25.3%，而在3+++组则为10%。综合上述实验结果，使用浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险时，cyclinA2蛋白质表达阳性的细胞比率为6-50%浸润性乳腺癌复发风险较大。表1.CyclinA2表达分布情况cyclinA2定义表达率例数复发事件百分数—0^5%6557.7+625%1102421.82650%751925.3+++>50%30310总例数2805118.2三、浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒与目前常用的分子标志的比较采用免疫组化SABC法分析281例患者的离体的乳腺组织中人类表皮生长因子受体2(Her2)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达。免疫组化SABC法中所用I抗为ER(ZETA公司1:400稀释)、PR(ZETA公司1:400稀释)或Her2(DAK0公司1:400稀释)。Her2应用美国FDA批准的Herc印test评分系统，阴性(0)为完全没有或少于10%的细胞膜染色；1+为大于10%的细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色；2++为大于10%的细胞呈现弱到中度完整的细胞膜着色；3+++为大于10%的细胞呈现强的完整的细胞膜着色。雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达分成4组，0为阴性、根据阳性细胞表达的多少分成l+、2++和3+++，阴性(0)为无表达，1+为低度表达，2++中度表达，3+++高表达。"ER+或/和PR+"表示"ER和PR均为阳性"和"ER或PR有一个是阳性"。Her2在浸润癌病例中按表达率多少分为阴性(0)，l+、2++、3+++四个组，每组病例数及所占比例如表2所示。分别以无病生存率(DFS)和总生存率(OS)做Kaplan-Meier生存分析，Kaplan-Meier生存曲线如图2所示。Her2表达率与患者的复发风险有明显统计学意义，logRank(Mantel-Cox)检验，p=0.05，而OS没有不同；与cyclinA2相同，从阴性到2++，随着表达增高而复发率增加，而3+++复发却低于2+。表2、Her2表达分布情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达率结果中ER+或/和PR+有178例，ER-和PR-有130例。性程度和复发风险。cyclinA2可作为判断乳腺癌恶性程度的较为精确的指标，而且和生存密切相关；cyclinA2和Her2—样均能将患者分成不同的预后，但两者并不吻合，而是互为补充，所以两者结合可以更好地预测乳腺癌的复发风险，特别是在Her2阴性的患者。cyclinA2是核表达蛋白，而且在正常组织基本是阴性或1-2个阳性细胞，并且不随抗体浓度增加而增加，所以本方法的特异性和敏感性均在95%以上。权利要求1、一种免疫组化试剂盒，该试剂盒包含CyclinA2单克隆抗体。2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含HRP标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体。3、根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含山羊血清。4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含聚合物辅助剂。5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含增敏二氨基联苯胺显色试剂盒。6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含苏木精。7、根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒用于浸润性乳腺癌复发风险评估。8、CyclinA2单克隆抗体在制备浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒中的应用。全文摘要本发明公开了一种浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。该试剂盒是一种免疫组化试剂盒，所述试剂盒包含CyclinA2单克隆抗体。所述试剂盒还包含HRP标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体、山羊血清、聚合物辅助剂、增敏二氨基联苯胺显色试剂盒、苏木精。用本发明的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险是将乳腺组织制成石蜡切片，可以精确观察到不同区域细胞的表达量，结果更可靠。文档编号G01N33/577GK101424691SQ20081023994公开日2009年5月6日申请日期2008年12月15日优先权日2008年12月15日发明者侯宽永,季加孚,李惠平,雷玉涛申请人:北京大学第三医院;李惠平