专利名称：：一种高通量检测溶剂产生菌溶剂产量的方法
技术领域：
：本发明涉及一种高通量检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法。
背景技术：
：目前，石油等化石燃料短缺、天然气和其他原料价格上扬、以及对温室气体减排的要求，已迫使人们将注意力转向可再生能源，关注生物燃料的发展前景。丁醇就是受关注的生物燃料之一。丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等；丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛垸值与汽油相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。因其有诸多优点，因此被广泛关注及应用，当今市场上丁醇已经供不应求。丁醇可由化学合成法和发酵法生产。化学合成法的主要路线包括两条，一是以丙烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛为原料，经醇醛縮合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。发酵法则是以粮食为原料，经发酵获得溶剂(包括丙酮、丁醇、乙醇，质量比约为3:6:1)，再经精馏后分别制得丙酮、丁醇和乙醇。发酵法生产溶剂曾经是仅次于乙醇发酵的全球第二大发酵工业。丁醇发酵中，溶剂毒性是影响溶剂产量的一个关键限制因素。在所产生的溶剂中，丁醇是毒性最大的，当其浓度达到13g/L，发酵就基本停止。研究发现，丁醇毒性的机制与其疏水性有关，它会破坏细胞膜的磷脂成份，使膜的流动性提高，可能会导致膜的不稳定，破坏与膜相关的功能，如抑制与膜结合的ATP酶活性、降低胞内ATP水平、抑制细胞维持胞内pH的能力、破坏细胞膜的pH梯度等。丁醇毒性对细胞膜的进一步影响是抑制糖和氨基酸的吸收，从而使代谢完全停滞。因此，需要筛选出丁醇耐受能力高的菌株以用于生产，而筛选菌株的前提是建立一种高效的检测菌株发酵产物含量的方法。目前溶剂(包括丙酮、丁醇、乙醇)产量测定一般用高效液相色谱或气相色谱进行，但此方法存在工作量很大、分析时间较长的缺点，对于一次筛选出较多的菌株，产物分析需数天时间。
发明内容本发明的一个目的是提供一种检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法。本发明的检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，包括如下步骤1)使发酵液中的丙酮与可溶性次碘酸盐反应，得到碘仿；2)检测所述碘仿的量，根据所述碘仿的量得到所述丙酮的量；3)根据所述丙酮的量，得到所述溶剂的量；所述溶剂为丙酮和如下有机溶剂中的至少一种乙醇和丁醇。其中，所述使丙酮与可溶性次碘酸盐反应的方法为向所述发酵液中加入可溶性碱、可溶性碘盐和碘。其中的丙酮可与次碘酸钠反应生成碘仿，碘仿不溶于水，可通过酶标仪检测得到碘仿的0D值，然后根据0D值与丙酮浓度间的换算关系式得到丙酮产量。本发明所述的溶剂产生菌产生的溶剂种类是已知的，且各产物与丙酮的质量存在一定比例关系，且比例值是已知的，如C/o^WwmacetoZmO;/fcwmDSM1731的发酵液中，丙酮、乙醇和丁醇的质量比为3:1:6(NutritionalfactorsaffectingtheratioofsolventsproductedbyC7oWr/i//wmflceto6w^//cww,AppliedandEnvironmentalmicrobiology,1986，169-172)，因此，可以根据丙酮的量计算出其它溶剂的量，进而得到总溶剂的产量。所述溶剂产生菌可以为丙酮丁醇梭菌和/或拜氏梭菌和/或糖丁酸梭菌，具体可如C/as^ZAwmaceto6w/y/ZcwmDSM1731、C7ost"V/z'wmace/oZw/)V/cwmATCC824。实验证明，本发明的检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，检测结果可靠准确，与高效液相色谱法检测结果相当，但操作上比其简单、检测速度快，而且成本低廉，因此，本发明方法可以实现高通量快速检测，在菌的溶剂产量检测中将会有广阔的应用前景。图i为丁醇标准品的高效液相色谱图。图2为乙醇标准品的高效液相色谱图。图3为丙酮标准品的高效液相色谱图。图4为C/oWn'A'Mmflceto^0^'cwmDSM1731发酵液的高效液相色谱图。图5为C/oy的'fi^maceto6w^//cwmATCC824发酵液的高效液相色谱图。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所使用的培养基及试剂如下酵母粉购自英国OXOID公司(目录号1023098)，蛋白胨购自英国OXOID公司(目录号594566)，牛肉膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，玉米粉购自普通超市，碘化钾、碘均购买于sigma公司；种子微培养用的RCM培养基的组成为葡萄糖5.0g/L;酵母粉3.0g/L;蛋白胨10.0g/L;牛肉膏10.0g/L;淀粉10.0g/L;氯化钠5.0g/L;醋酸钠3.0g/L;pH6.8，溶剂为水。115匸条件下灭菌20分钟。发酵培养基CGM培养基的组成为葡萄糖50g/L;硫酸镁0.4g/L;硫酸锰0.01g/L;硫酸铁0.01g/L;氯化钠1g/L;酵母粉4g/L;硫酸铵3g/L;磷酸二氢钾0.75g/L;磷酸氢二钾0.75g/L，溶剂为水；pH6.9。115。C条件下灭菌20分钟。含丁醇的RCM培养基的组成为向上述RCM培养基中添加丁醇，丁醇在RCM培养基中的终浓度为13-18g/L。115'C条件下灭菌20分钟。含丁醇的RCM固体培养基的组成为向上述RCM培养基中添加丁醇和琼脂，丁醇在RCM培养基中的终浓度为13-18g/L，琼脂在RCM培养基中的终浓度为2%(质量百分含量)。115'C条件下灭菌20分钟。氢氧化钠溶液用水配制终浓度为2.5mol/L的氢氧化钠溶液。碘溶液先将2.6g碘化钾溶于水中，再加入1.3g碘，定容至100mL。pH7.0的磷酸盐缓冲液将5.29gKH2P04和13.94gK2HP04溶于1L水中，pH7.0。生理盐水0.75%(质量百分含量)的氯化钠溶液。115。C条件下灭菌20分钟。下述实施例中，高效液相色谱法测定溶剂产量的步骤为(1)样品前处理将发酵液以12000rpm的速度离心lmin，取上清液，将上清液用(X22iim滤膜过滤，得到滤液，滤液进行后续检测。(2)色谱条件为Agilent1200液相色谱仪，示差检测器；BioRadAminexHPX-87H有机酸柱(30(P7.8mm),柱温15°C;上样量lO(il;流动相为0.05mMH2S04，流速0.5ml/min。丁醇、丙酮标准品均购自Sigma公司(目录号依次为34867-2.5L，650501-1L)，乙醇标准品购自sigma公司，产品目录号为459828;在如上色谱条件下标准品的保留时间依次为丁醇38.8分钟、丙酮26.8分钟、乙醇22.7分钟。实施例1、高通量检测C/oWW&wmflceto6wO;//cwmDSM1731发酵产生的溶剂产本实施例中所用的溶剂产生菌为ao^WwmflcetoZm/y/fcMmDSM1731(购自德国菌种保藏中心)，该菌发酵产生的溶剂为丙酮、乙醇和丁醇，且丙酮、乙醇和丁酉享的质量比为3:1:6(NutritionalfactorsaffectingtheratioofsolventsproductedbyC7oyW血m"c柳Z吵/Zc謂，AppliedandEnvironmentalmicrobiology,1986,169-172)。1)菌株大规模种子微培养将C/oW〃V/&maceto^O^'cwmDSM1731接入装有lmLRCM培养基的96孔深孔板中(每孔的容量为2mL)，37。C静置厌氧培养36h，得到种子培养液。2)大规模微发酵用排枪取上述种子培养液0.1mL(剩余的0.9mL培养液放于4'C保存等初检后用于复检)，将其转接入对应的含有lmLCGM培养基的96孔深孔板中，37'C静置厌氧培养48h，得到发酵液；3)用本发明方法对溶剂产量进行检测将96孔深孔板离心，用排枪取上清液2.5pL加入至预加47.5去离子水的96孔板中，再向每孔中加100pL氢氧化钠溶液和100pL碘溶液反应，振荡均匀，用酶标仪在550nm处测定OD值，根据OD值换算出溶剂产量，计算公式如下总溶剂产量为发酵液中丙酮、乙醇和丁醇产量之和。丙酮产量(g/L发酵液)气OD值+0.0015)/0.1273;乙醇产量(g/L发酵液)=丙酮产量乂(10/3);丁醇产量(g/L发酵液)=丙酮产量乂2。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，通过本发明方法测得该菌株产生的丙酮产量为3.0g/L，乙醇产量为1.0g/L发酵液，丁醇产量为6.0g/L，总溶剂产量为10.0g/L。4)高效液相色谱检测取步骤2)的发酵液0.5mL按照上述高效液相色谱法进行前处理和检测。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，在如上色谱条件下发酵液中丁醇、丙酮和乙醇的色谱图如图4所示，该菌株产生的丙酮产量为3.01g/L，乙醇产量为1.01g/L，丁醇产量为5.94g/L，总溶剂产量为9.96g/L。通过以上实验表明，高效液相色谱法测得的该菌的溶剂产量与用本发明方法测得的该菌的溶剂产量相同，证明本发明方法可以用来检测菌的溶剂产量。实施例2、高通量检测aoWn'^/wflceto^0^'cwmATCC824发酵产生的溶剂产本实施例中所用的溶剂产生菌为C/o欣Wwmac"o^0;//cwmATCC824(购自美国标准品收藏中心)，该菌发酵产生的溶剂为丙酮、乙醇和丁醇，且丙酮、乙醇和丁醇的质量比为3:1:6(U.S.patent4777135,Methodforproducingbutanolbyfermentation,1988)。1)菌株大规模种子微培养同实施例1的步骤1，不同的是将C7o欲WwmacetoZm^Z/cwmATCC824接入装有lmLRCM培养基的96孔深孔板中。2)大规模微发酵同实施例1得步骤2。3)用本发明方法对溶剂产量进行检测同实施例1的步骤3实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，通过本发明方法测得该菌株产生的丙酮产量为3.1g/L，乙醇产量为1.03g/L，丁醇产量为6.2g/L，总溶剂产量为10.3g/L。4)高效液相色谱检测同实施例1的步骤4)。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，在如上色谱条件下发酵液中丁醇、丙酮和乙醇的色谱图如图5所示，该菌株产生的丙酮产量为3.17g/L发酵液，乙醇产量为1.06g/L发酵液，丁醇产量为6.36g/L，总溶剂产量为10.59g/L。通过以上实验表明，高效液相色谱法测得的该菌的溶剂产量与用本发明方法测得的该菌的溶剂产量相同，证明本发明方法可以用来检测菌的溶剂产量。实施例3、高通量检测丙酮丁醇梭菌突变株溶剂产量1)菌株大规模种子微培养本实施例中待检测菌株为从丙酮丁醇梭菌突变库中获得的300余株耐16g/L丁醇的突变株，其获得方法如下将丙酮丁醇梭菌(C/oWn'fl^maceto6w0^cwm)SMBl(对丁醇的耐受性为13g/L，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.2287。中国专利.-200810102673.2)接入RCM培养基中，37"C静置厌氧培养36h，此时菌体生长至对数生长中后期，取培养液用生理盐水离心洗涤两次，然后将沉淀悬浮于pH7.0磷酸缓冲液中，加入诱变剂(终浓度为1%(质量百分含量)的硫酸二乙酯)，37°C，160rpm作用20min，用25%(质量百分含量)的硫代硫酸钠终止反应，用RCM培养基洗涤菌体两次，取菌体稀释涂布含有浓度为16g/L丁醇的RCM固体培养基，37"C厌氧培养48h，可见单菌落约300个。用已灭菌的牙签将单菌落转接入含有lmLRCM培养基的96孔深孔板中(每孔的容量为2mL)，37。C厌氧培养36h，得到种子培养液。2)大规模微发酵用排枪分别取上述种子培养液0.1mL(剩余的0.9mL培养液放于4"C保存等初检后用于复检)转接入对应的含有lmLCGM培养基的96孔深孔板中，37'C厌氧培养48h，得到各菌株的发酵液。3)用本发明方法进行检测将96孔深孔板离心，用排枪取上清液2.5pL加入至预加47.5pL去离子水的96孔板中，加100^L氢氧化钠溶液和100^L碘溶液反应，振荡均匀，用酶标仪在550nm处测定。根据实施例1中所述方法换算得到各菌株产生的总溶剂产量值，挑选其中值比较高的16株进行下述高效液相色谱检测(如表1所示)。实验设3次重复，结果取平均数。4)高效液相色谱检测从4'C保存的菌液中吸取初筛选出的16株突变株的种子培养液，取0.1mL，接入含有lmLRCM培养基的96孔深孔板中，37C厌氧培养36h作为种子液，各取0.3mL转接入含5mLCGM培养基的厌氧试管中，37°(3厌氧发酵48h，得到发酵液;将各发酵液分别按照上述高效液相色谱法进行检测。实验设3次重复，结果取平均数。检测结果如表1所示。表l、16株突变株的总溶剂产量情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例4、高通量检测环境来源未知菌株的溶剂产量与实施例1不同的是待检测菌株来源于环境样品十月份采集刚刚收获后的土豆田土壤8份，将土样分别加入装有10mLRCM培养基的厌氧管中，混合后，在10(TC沸水中加热90s，杀死营养体细胞，于37。C温箱中培养2-4天。定期观察，挑出有气泡产生的厌氧管1管，应用亨盖特滚管技术，分离单菌落用于产溶剂检测。共获得了200株菌。按照上述实施例1中所述方法进行检测其溶剂产量。结果表明，两种方法测得的溶剂产量值相同。最终确定共有3株菌株的总溶剂产量均超过10.0g/L，这些菌株将是丁醇发酵生产研究的潜在资源。权利要求1、一种检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，包括如下步骤1)使发酵液中的丙酮与可溶性次碘酸盐反应，得到碘仿；2)检测所述碘仿的量，根据所述碘仿的量得到所述丙酮的量；3)根据所述丙酮的量，得到所述溶剂的量；所述溶剂为丙酮和如下有机溶剂中的至少一种乙醇和丁醇。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述使丙酮与可溶性次碘酸盐反应的方法为向所述发酵液中加入可溶性碱、可溶性碘盐和碘。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述溶剂产生菌为丙酮丁醇梭菌和/或拜氏梭菌和/或糖丁酸梭菌。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述丙酮丁醇梭菌为C/o^^Z/"mflceto6w(y//cwmDSM1731禾口/或C/oWn'cfem<2ceto6wy//cwmATCC824。全文摘要本发明公开了一种高通量检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法。该方法，包括如下步骤1)使发酵液中的丙酮与可溶性次碘酸盐反应，得到碘仿；2)检测所述碘仿的量，根据所述碘仿的量得到所述丙酮的量；3)根据所述丙酮的量，得到所述溶剂的量；所述溶剂为丙酮和如下有机溶剂中的至少一种乙醇和丁醇。实验证明，本发明的检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，检测结果可靠准确，与高效液相色谱法检测结果相当，但操作上比其简单、检测速度快，而且成本低廉，因此，本发明方法可以实现高通量快速检测，在菌的溶剂产量检测中将会有广阔的应用前景。文档编号G01N33/00GK101446579SQ200810240859公开日2009年6月3日申请日期2008年12月26日优先权日2008年12月26日发明者张天瑞,张延平,寅李申请人:中国科学院微生物研究所