专利名称：：卷烟主流烟气中有害酚的分离检测方法
技术领域：
：本发明涉及巻烟主流烟气中有害酚的检测方法，特别是涉及巻烟主流烟气中7种有害酚的分离检测方法。技术背景巻烟主流烟气中的有害酚类化合物主要包括邻、间、对-苯二酚，苯酚，邻、间、对-甲酚，是巻烟主流烟气的重要组分之一，对烟气香味产生直接影响，同时也是一类重要的有害成分。分离检测酚类化合物的方法已有许多文献报道，气相色谱和高效液相色谱法是巻烟烟气酚类物质分析中两种应用最为广泛的方法，并成功地对巻烟主流和侧流烟气中的7种主要有害酚类成分一一邻、间、对-苯二酚，苯酚，邻、间、对-甲酚进行了检测。但是，由于异构体间一甲酚和对一甲酚的结构以及物理化学性质极为相近，通常的气相色谱和液相色谱技术难以将其分离，目前都是合并在一起进行测定。近十年来，高效液相色谱(HPLC)法因不需要样品预分离和衍生化，具有操作简单、可直接进行样品测定等优点，在酚类化合物的分析中得到了广泛的应用。但是，在用这一方法进行酚类化合物的分析时，间甲酚和对甲酚还是不能分离，只能获得间甲酚和对甲酚混合物的测定结果，现有技术中用高效液相色谱法对巻烟主流烟气中有害酚的检测方法为1、主流烟气的捕集将样品巻烟在22士rC、相对湿度60士2X条件下平衡48h，在温度22士2。C、相对湿度60±5%条件下，用FiltronaSM400型直线型吸烟机按照YC/T29-1996规定的标准条件抽吸巻烟，每个孔道抽吸4支烟，用剑桥滤片捕集巻烟主流烟气。2、烟气样品的制备将l张捕集有粒相物的剑桥滤片折叠放入200mL锥形瓶中，准确加入50mL1%醋酸，室温下超声萃取20min，静置5min。取2mL萃取液，用O.45ym微孔滤膜过滤，得样品，处理好的样品必须在3天内进行分析，外标法定量。3色谱条件色谱柱Luna-(]18柱；流动相(a)冰醋酸水=1:99，(b)冰醋酸乙腈水=1:30:69;梯度洗脱流动相设置开始时含b流动相20X(体积)，16min时含b流动相60%(体积)，23min时含b流动相75X，34min时含b流动相100X(体积);柱流速lml/min;3柱温3CTC;进样量20ul;荧光检测波长设置如下表。时间(min)激发波长(nm)发射波长(nm)0284333527531582773191227231025273312使用上述方法不能分别检测间一甲酚和对一甲酚的含量。然而，间一甲酚、对一甲酚又有各自不同的生物活性间-甲酚含量与巻烟烟气的吸味(涩味)、刺激性高度相关，而对甲酚有记录可少量用于实用、烟用和化装品香精中，NI0SH(美国国家职业安全与健康协会)颁布了甲酚的推荐暴露限为2.3ppm。2006年美国EPA参照NI0SH将甲酚列为有害的空气及水污染物，并分类为GroupC，即可能的致癌物质，并根据NOAELs(中毒剂量和未观察到不良反应的剂量)，规定了口服参考剂量间-甲酚为0.05mg/kg/天，对-甲酚为0.005mg/kg/天。探索可准确测定巻烟烟气中七种有害酚各自含量的方法，将为控制巻烟产品有害成分的释放量提供更科学的数据。环糊精(CDs)是一种腔内疏水、腔外亲水的"锥筒状"大环分子化合物，该分子可与许多有机分子、无机分子或离子等客体分子形成敏感的主客复合体，并表现出良好的分子识别及选择性。近年来，用环糊精作为高效液相色谱流动相手性添加剂或固定相对手性、异构体进行分离已引起广大分析工作者的关注。e-环糊精是常用的食品添加剂，无毒、价廉，在分离异构体和手性化合物方面效果显著。但将e-环糊精(e—cd)作为液相色谱流动相添加剂，对巻烟主流烟气中间、对-甲酚进行分离尚未见报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中采用高效液相色谱法进行巻烟主流烟气中有害酚的检测时，只能测定间一甲酚和对一甲酚的混合含量的缺陷，提供一种巻烟主流烟气中7种有害酚的分离检测方法。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案巻烟主流烟气中有害酚的分离检测方法，包括主流烟气的捕集、烟气样品的制备和高效液相色谱检测，其中，在高效液相色谱检测的流动相中添加e-环糊精。间一甲酚和对一甲酚的分离度随着e-环糊精浓度的增加而增大，但e-环糊精浓度太高时，由于受溶解度的限制，在流动相中不能完全溶解，使流动相变浑浊，且易堵塞色谱柱，高效液相色谱流动相中的浓度为588/1。当e-环糊精在高效液相色谱流动相中的浓度为68/1时效果最佳，此时间一甲酚和对一甲酚的分离度为1.64。前述高效液相色谱检测的检测条件为色谱柱L皿a-d8柱；流动相(a)冰醋酸水=1:99，(b)冰醋酸乙腈水=1:30:69，含P-环糊精；梯度洗脱流动相设置开始时含b流动相20X(体积)，32min时含b流动相84X(体积)，33min时含b流动相100X(体积)；柱流速lml/min;柱温3CTC;进样量20yl。其它条件同现有技术测定巻烟主流烟气中有害酚的方法。发明人为了探索巻烟主流烟气中间一甲酚和对一甲酚的分离检测方法，进行了大量的实验，具体如下1、仪器和试剂仪器HP1100高效液相色谱仪；HP1100荧光检测器；Luna-(]18柱(5ym，4.6讓X150mm);英国菲尔创纳SM400型全自动吸烟机；瑞士METTLER公司TOLEDOAG104型电子天平(感量:0.lmg);德国TRANSSONIC公司T660/H型超声波振荡器；美国MILLIPOREDirectQ5型超纯水系统。试剂醋酸(液相色谱纯，美国Fluka公司)，乙腈(液相色谱纯，美国迪马化学试剂公司)，邻、间、对-甲酚(美国Fluka公司)，邻-苯二酚、e-环糊精(天津市科密欧化学试剂开发中心)，苯酚(重庆茂业化学试剂有限公司)，间、对-苯二酚(成都市科龙化工试剂厂)，去离子水(>5m，使用前经0.45ym滤膜过滤)，6种市售巻烟。(没特殊注明的皆为分析纯)2、方法2.l主流烟气的捕集将样品巻烟在22士rC、相对湿度60士2X条件下平衡48h，然后根据重量及吸阻选出合适烟支。在温度22士2i:、相对湿度60±5%条件下，用英国菲尔创纳SM400型全自动吸烟机按照YC/T29-1996规定的标准条件抽吸巻烟，每个孔道抽吸10支烟，用剑桥滤片捕集巻烟主流烟气。2.2烟气样品的制备将l张捕集有粒相物的剑桥滤片折叠放入200mL锥形瓶中，准确加入l^醋酸50ml，室温下超声萃取20min，静置5min。取2mL萃取液，用O.45ym微孔滤膜过滤，得样品，处理好的样品必须在3天内进行分析。进行HPLC分析，外标法定量。2.3液相色谱条件为了考察e-环糊精的添加是否可以分离检测甲酚以及是否会对其它酚类化合物的分离产生影响，分别采用不添加e-环糊精的流动相A与添加e-环糊精的流动相B对巻烟主流烟气中的酚类化合物进行了测定。同时以标准样品做对照。流动相A:(a)冰醋酸水=1:99，(b)冰醋酸乙腈水=1:30:69;梯度洗脱:开始时含b流动相20X(体积)；16min时含b流动相60X(体积)；23min时含b流动相75%(体积)；34min时含b流动相100X(体积)。流动相B:(a)冰醋酸水=1:99，(b)冰醋酸乙腈水=1:30:69，{3-环糊精的浓度为6g/1(另有注明的除外)；梯度洗脱开始时含b流动相20X(体积)，32min时含b流动相84X(体积)，33min时含b流动相100X(体积)。色谱柱Luna—Ci8(5ym，4.6mmX150mm);保护柱AglientSB-C18(5ym，12.5X4.6mm);柱流速lmL/min;柱温30°C;进样量20uL。荧光检测器分析条件由于不同的酚类化合物有其各自不同的最佳激发与发射波长，所以按下表设置的荧光检测器程序波长进行检测，可使各酚类化合物获得各自的最佳响应值。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、结果与讨论3.ie—环糊精对间一甲酚和对一甲酚的分离检测从附图i和附图2可以看出，当流动相中不添加e—环糊精时，无论是对混标样品还是巻烟样品，经反相c^柱分离，间一甲酚和对一甲酚这对异构体只能得到单一的色谱峰(见图l的a5、a6和图2的a5、a6)，而在流动相中添加P-环糊精后，即可实现混标样品和巻烟样品中对一甲酚和间-甲酚的分离，得到了两个分离度较大的色谱峰(见图l的b5、b6和图2的b5、b6)，采用单标进样，根据保留时间可确定峰5为对-甲酚，峰6为间-甲酚。由此可见，以e—环糊精作为流动相添加剂的反相高效液相色谱可分离甲酚异构体，这种分离是基于e—环糊精对于对一甲酚、间一甲酚和邻一甲酚异构体的选择性包接作用。e一环糊精的空腔结构外部有亲水的羟基，内部是亲脂的碳氢结构，甲酚结构中的甲基取代的苯环由于亲脂性将嵌入e—环糊精的空腔中，而酚羟基将与e—环糊精腔外的羟基发生氢键作用，由于对一甲酚、间一甲酚和邻一甲酚的甲基处于不同的位置，其空间结构的差异导致它们与e—环糊精的契合程度不同，所形成的包接物稳定性不同，从而得到不同的保留时间，因此可将甲酚异构体拆分。根据甲酚异构体在反相柱上的洗脱顺序，可以推测甲酚异构体进入e—环糊精空腔而形成的主客体复合物稳定性顺序为对一甲酚〉间一甲酚〉邻一甲酚，这一结果与文献报道的e—环糊精与甲酚异构体包结物的稳定常数是相符的。3.2e—环糊精浓度对间-甲酚和对-甲酚拆分的影响用混合标样为样品，添加不同浓度的e-环糊精进行实验研究。由图3可见，在流动相水相中分别添加2、4、6、8g/l的e-环糊精时，对-甲酚和间-甲酚分离度分别为0.62、1.06、1.64、1.73，说明甲酚异构体的分离度随着e-环糊精浓度的增加而增大。这可能是因为e-环糊精浓度的增加有利于增强它与同分异构体之间的相互作用，使得同分异构体之间的色谱行为差异扩大，得到不同的保留时间，从而达到分离的目的。但e-环糊精浓度太高时，由于受溶解度的限制，在流动相中不能完全溶解，使流动相变浑浊，且易堵塞色谱柱，因此经过比较，选择58g/i的e—环糊精溶液作为流动相添加剂，当e—环糊精的浓度为6g/1时，其分离度为i.64，且此时e-环糊精在溶液中完全溶解，总体效果最好。3.3工作曲线与检测限精密称取对-甲酚、邻-甲酚、苯酚、对-苯二酚、间-苯二酚、邻-苯二酚对照品各25mg，间-甲酚对照品5mg，用l^冰醋酸溶液定容至25ml，然后用l%冰醋酸溶液进行倍比稀释，配成质量浓度依次为0.2、0.4、1.0、2.0和4.0mg/mL的对照品溶液。以峰面积(Y)对质量浓度(X，mg/mL)进行线性回归，酚类化合物的回归方程见表l。表ie—环糊精加入前后酚的回归方程及检测限<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果表明，e-环糊精加入前相关系数在O.99975到0.99990之间，{3-环糊精加入后相关系数在O.99979到0.99998之间，浓度与峰面积呈良好的线性关系。以信噪比为3确定检测限，e-环糊精加入前后酚类成分的检测限均在ng级的水平，远远低于巻烟主流烟气中这几个有害酚的含量。3.4回收率抽吸相同巻烟10份，分成2组，每组5份，其中l组加入已知量(100yg)的酚类混合标样，另一组不加，进行萃取和HPLC分析。回收率=(加混合标样的样品测出量一未加混合标样的样品测出量)/标样加入量X100X，根据5次平行测定的结果，计算相对标准偏差(见表2)。表2e-环糊精加入前后酚类化合物的回收率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>e—环糊精加入后<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果表明，e-环賴月精加入前6利^酚的平均回4夂率为92.8%106.5%，加入后7种酚的平均回收率为92.9%102.4%，说明在流动相中加入e-环糊精并没有降低方法的准确性。3.5重复性将同一牌号，同批取样的巻烟样品分别进行5次抽吸，萃取和反相高效液相测定，同一巻烟样品进行5次平行测定，根据5次平行测定的结果计算相对标准偏差(见表3)。表3e-环糊精加入前后主流烟气酚类成分测定的重复性(yg/支)e-环糊精加入前<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>RSD2.18%1.78%4.33%2.47%2.71%3.72%3.86%结，艮表明:卩糊精加入前主流烟气中6种有害酚类成分的相对标准偏差为1.03%4.00%，{3-环糊精加入后主流烟气中7种有害酚类成分的相对标准偏差为1.78%4.33%，说明e-环糊精添加剂法用于测定巻烟主流烟气中7种有害酚类成分的含量是可靠的。将e-环糊精加入前后各酚类化合物的测定值进行比较，发现e-环糊精加入后几种酚类物质的测定值略小于e-环糊精加入前对应的酚类物质的测定值，只有间-苯二酚的测定值在e-环糊精加入前后相差几乎一倍，但是通过对比图2中的a图谱和b图谱发现加入e-环糊精后，间-苯二酚(图2b中的2号峰)的后面出现了一个明显的杂峰8，所以我们认为e-环糊精加入前后间-苯二酚含量的巨大差异是由杂峰的引入造成的，e-环糊精的加入起到了分离杂峰的作用此外，如表4所示，将e-环糊精加入后测得的对-甲酚和间-甲酚各自含量的加和值与e-环糊精加入前间-甲酚和对-甲酚混合物测定值进行比较，发现e-环糊精加入前后间-甲酚和对-甲酚的含量比值是o.98，说明e-环糊精添加剂法对对-甲酚与间-甲酚异构体的拆分准确可靠。表4e-环糊精加入前后对-甲酚、间-甲酚含量(yg/支)比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.6样品分析发明人以e-环糊精为流动相添加剂的反相高效液相色谱法对5种国产市售烤烟型巻烟主流烟气中酚类化合物的含量进行了分析，如表5所示。表5部分巻烟中酚类成分含量(yg/支)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>354.541.8295.7729.7211.423.784.82463.512.62109.0941.3915.536.007.57549.032.10104.7251.2318.107.349.42结果显示，在所分析的5种巻烟主流烟气中二元酚类成分的总含量约为一元酚成分总量的4倍，二元酚类成分中邻-苯二酚的含量最高，其次是对-苯二酚，间-苯二酚的含量较少。我们首次用高效液相色谱法测定了巻烟主流烟气中对-甲酚和间-甲酚各自的含量，结果表明:巻烟主流烟气中对-甲酚的含量最高，约是间-甲酚或邻-甲酚的23倍，其次是邻-甲酚，而间-甲酚含量最低。与现有技术相比，本发明提供了一种以e-环糊精为流动相添加剂的高效液相色谱测定巻烟主流烟气中有害酚的方法，该方法采用了程序荧光波长检测，这样可以让每种酚在其最佳的激发和发射波长处进行检测，保证检测灵敏度，并用含e-环糊精的流动相梯度洗脱，使各种酚在色谱柱上获得最佳的分离效果，并且，在甲酚异构体的分离检测效果随着e-环糊精浓度的增加而增加的前提下限定了e-环糊精的最高浓度，避免了因为色谱柱被e-环糊精阻塞而使昂贵的色谱柱报废。本发明方法不但不会影响邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、苯酚和邻甲酚的分离测定，还成功地解决了以往高效液相色谱测定方法中间一甲酚和对一甲酚异构体不能分离检测的问题，可以同时测定巻烟主流烟气中七种有害酚的含量，这种方法可望应用于巻烟产品有害酚类物质的日常检测中。图l:混合标样中7种酚成分的液相色谱图，a:流动相中未加入e-环糊精，b:流动相中含有6g/L的e-环糊精；图2:巻烟样品主流烟气中7种酚成分的液相色谱图，a:流动相中未加入e-环糊精，b:流动相中含有6g/L的e-环糊精；图3:混合标样中7种酚成分的液相色谱图，a:没有添加e—环糊精，b:添加2g/l的f3-环糊精，c:添加4g/i的e-环糊精，d:添加6g/i的e-环糊精，e.添加8g/i的e-环糊精；各附图中的数字所代表的峰1:对-苯二酚、2:间-苯二酚、3:邻-苯二酚、4;苯酚、5:对-甲酚、6:间-甲酚、7:邻-甲酚。各附图中的横坐标为保留时间，纵坐标为荧光强度(LU)。具体实施例方式本发明的优选实施方式巻烟主流烟气的捕集将巻烟在22士rC、相对湿度60士2X条件下平衡48h，在温度2211±2°C、相对湿度60±5%条件下，用英国菲尔创纳SM400型全自动吸烟机按照YC/T29-1996规定的标准条件抽吸巻烟，每个孔道抽吸10支烟，用剑桥滤片捕集巻烟主流烟气。主流烟气样品的制备将l张捕集有粒相物的剑桥滤片折叠放入200mL锥形瓶中，准确加入l^醋酸50ml，采用德国TRANSS0NIC公司T660/H型超声波振荡器在室温下超声萃取20min，静置5min。取2mL萃取液，用O.45ym微孔滤膜过滤，得主流烟气样品，处理好的样品必须在3天内进行分析。用外标法定量。液相色谱分析采用Luna-ds柱(5ym，4.6mmX150mm)和HP1100高效液相色谱仪进行液相色谱分析，采用HP1100荧光检测器进行检测；流动相(a)冰醋酸水=1:99，P-环糊精的含量为6g/1;(b)冰醋酸乙腈水=1:30:69，e-环糊精的含量为6g/1。梯度洗脱开始时含b流动相20X(体积)，32min时含b流动相84X(体积)，33min时含b流动相100X(体积)。所有试剂均为分析纯。色谱柱LUNAC18(5ym，4.6mmX150mm);保护柱AglientSB-C18(5ym，12.5X4.6mm);柱流速lmL/min;柱温30°C;进样量20yL。荧光检测器分析条件由于不同的酚类化合物有其各自不同的最佳激发与发射波长，所以按下表设置的荧光检测器程序波长进行检测，可使各酚类化合物获得各自的最佳响应值。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>采用上述色谱条件进行检测，即可对巻烟主流烟气中间一甲酚和对一甲酚异构体的含量进行分离测定，同时还不会影响邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚，苯酚和邻甲酚的分离测定权利要求1.卷烟主流烟气中有害酚的分离检测方法，包括主流烟气的捕集、烟气样品的制备和高效液相色谱检测，其特征在于在高效液相色谱检测的流动相中添加β-环糊精。2.按照权利要求l所述巻烟主流烟气中有害酚的分离检测方法，其特征在于13-环糊精在高效液相色谱流动相中的浓度为58g/1。3.按照权利要求2所述巻烟主流烟气中有害酚的分离检测方法，其特征在于13-环糊精在高效液相色谱流动相中的浓度为6g/1。4.按照权利要求1一3任一所述巻烟主流烟气中有害酚的分离检测方法，其特征在于高效液相色谱检测的检测条件为色谱柱L皿a-C18柱；流动相(a)冰醋酸水=1:99，添加{3-环糊精，(b)冰醋酸乙腈水=1:30:69，添加{3-环糊精；梯度洗脱流动相设置开始时含b流动相20X(体积)，32min时含b流动相84X(体积)，33min时含b流动相100X(体积)；柱流速lml/min;柱温3Q。C;进样量20yl。全文摘要本发明提供了一种卷烟主流烟气中有害酚的分离检测方法，以克服现有技术中采用高效液相色谱法进行卷烟主流烟气中有害酚的检测时，只能测定间-甲酚和对-甲酚的混合含量的缺陷，在高效液相色谱的流动相中添加一定量的β-环糊精即可解决此问题，在成功的对间-甲酚和对-甲酚异构体进行分离检测的同时，还不会影响邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚，苯酚和邻甲酚含量的分离测定，这种方法可望应用于卷烟产品有害酚类物质的日常检测中。文档编号G01N1/22GK101592638SQ20081030186公开日2009年12月2日申请日期2008年5月30日优先权日2008年5月30日发明者刘钟祥,静周,婕张,彭黔荣,敏杨,蔡元青,谢建玲,赖东辉申请人:贵州中烟工业公司;贵州大学