测定急性髓性白血病对用法尼基转移酶治疗的反应的方法

专利名称：测定急性髓性白血病对用法尼基转移酶治疗的反应的方法
测定急性髓性白血病对用法尼基转移酶治疗的反应的方法
背景技术：
目前没有可用的方法预测对法尼基转移酶抑制剂的反应。替匹法尼(Tipifarnib) 是第一个被临床试验的法尼基转移酶抑制剂(FTI)。Rowinsky等(2006)。其在包括AML、MM、 MDS和CML在内的血液病中表现出显著的活性，在AML和MDS中的完全反应率高达约15%。 Mesa 等 Q006) ；Lancet 等 Q007) ；Fenaux 等 Q007)；以及 Harousseau 等 Q007)。FTI 通过竞争性地抑制法尼基部分添加到包括Ras在内的很多重要信号分子而起作用。Rowinsky 等 O006)和 Cox 等 O002)。为了与细胞质膜内部小叶相互作用并参与各种信号传导途径，必须对一些与癌症相关的分子如Ras用法尼基转移酶进行法尼基化。Ras不是唯一的具有异戊二烯基化CAAX 框的癌症相关蛋白。法尼基转移酶抑制剂(FTI)是抑制碳法尼基部分与各种蛋白的C-端 CAAX模体共价连接的治疗剂。它们具有治疗癌症和增殖性疾病如白血病的功效。急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是可用FTI最有益地进行处理(address) 的疾病之一。如许多治疗方案中所反映的真实情况那样，某些患者对FTI治疗起反应而其他则不然。给不可能对治疗起反应的患者开药不是期需的。因此，有用的是，在给药之前首先了解患者将对这样的治疗预期会有如何的反应，以使非反应者不必接受徒然的治疗，并使那些最有机会受益于那些药物的患者得到适当的治疗和监控。此外，在那些对治疗起反应的患者之中，可能存在各不相同的反应程度。用非FTI治疗剂的治疗或FTI联用治疗剂的治疗对于那些对FTI没有反应或对单独的FTI的反应低于预期的患者而言可能是有益的。一直以来，ras基因的突变状况被认为是患者对FTI反应的候选生物标志。该理论基于以下临床前证据FTI能够阻断Ras转化的细胞以及在ras基因内部的特定点突变引起许多癌症中Ras途径的组成性激活。End等(2001) Reuter ^ (2000)以及Bos等(1989)。 因为普遍被接受的是肿瘤严重依赖一个或两个途径的激活(“癌基因插入”假说)，所述假说遵循的是，由特定途径促进其肿瘤的患者应对抑制该途径的药物起反应。Weinstein等 0006)。然而，途经可被多个事件激活，并且业已发现不存在对Ras突变的激活下，Ras可被增量调节。Ehmarm等Q006)。此外，在临床研究中证明在ras突变和对FTI反应之间不存在关联性。1(￡1印等0001)；和2007004878。当几个早期临床研究集中于显示高频率 ras突变的癌症时，反应率在那些试验中确实低得令人失望。Mes乂2006) ；Rao等Q004)； 和 Van Cutwem 等 0004)。发明概述我们根据N-Ras突变情况、总基因表达、和/或特定基因的定量PCR(qPCR)，分析了来自67位患者的骨髓，所述患者来自对用替匹法尼(R115777，ZARNESTRA )抑制法尼基转移酶的二期研究，所述研究在事先未经治疗的急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)低风险的老年人中进行。微阵列概况分析(microarray profiling)确定了两种基因的表达比(RASGRP1 APTX)，其提供了用于预测对替匹法尼的反应的最大准确性。我们证明了该分类物(classifier)可预测在来自复发或难治性AML的M个样品的独立组中对替匹法尼的反应，NPV和PPV分别为92%* % (优势比为4. 4)。因此，在新诊断的AML和复发或难治性AML两者中，该分类物使总反应率提高约50%同时维持高NPV，并显著提高患者的总存活期。在来自相同的临床研究的30个AML样品中，该二基因分类物也被 qPCR所验证，显示阴性预测值(negative predictive value,NPV)和阳性预测值(positive predictivevalue, PPV)分别为81%和50% (优势比4.3)。这些数据表明，简易的二基因表达测定可应用于诊断更可能对替匹法尼产生反应的AML患者群。微阵列技术已经应用于鉴定基因表达概况(gene expressionprofile)，通过该基因表达概况可预测各种癌症中对很多不同治疗方式(包括乳腺癌、弥散性大B细胞淋巴瘤和白血病的化疗或内分泌疗法)的反应和抗性。Ma等Q004) ；Chang等(2003) Jansen等 (2005) ；Potti 等(2006) ；Shipp 等(2002) ；Rosenwald 等(2002) ；Lossos 等(2004) ；Yeoh 等000 和Holleman等Q004)。我们事先已经使用基因表达概况分析确定了在复发或难治性AML中对替匹法尼的反应的分子预测物(molecular predictor)。20070048782。在此我们已经将这项工作扩展到已新诊断的AML上，这已促成了可预测临床效果的二基因表达比(RASGRP1 APTX)的鉴定。我们进一步显示了该分类物可用qPCR进行分析并且在复发或难治性AML中有预测功效。附图简述

图1描述了在AML中作为对替匹法尼反应的预测物的RASGRP1基因的性能。在新确诊的AML中使用RASGRP1基因分类物的准确率(A)和卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线(B)。图2描述了在AML中作为对替匹法尼应反的预测物的RASGRP1 APTX基因对的性能。通过卡普兰-迈耶分析作图描述了用2-基因分类物分层(stratify)的新确诊的AML 患者㈧和复发/难治性AML患者(C)的总存活期。显示了在新确诊的AML⑶和复发/ 难治性AMLG))中的2-基因分类物的准确率。图3通过qPCR描述了 RASGRP1 :APTX基因分类物的性能。(A) 20名反应者和10名进行性疾病患者正规化的RASGRP1 APTX Ct值。分别显示了 20个独立样品和10个在微阵列上运行的训练样品。横杠显示了组平均值。(B)显示了在所有30名新确诊AML患者中的RASGRP1基因分类物的准确率，用0截短值来将患者分层。(C)用卡普兰-迈耶分析对分层患者的相关总存活期作图。图4描述了在复发和难治性AML中作为对替匹法尼反应的预测物的RASGRP1基因的性能。在复发/难治性AML中使用RASGRP1基因分类物的准确率(A)和卡普兰-迈耶存活曲线(B)。图5描述了用RASGRP1 APTX基因表达比分层的非FTI治疗的AML患者的总存活期。用于RASGRP1和APTX两者的三个cDNA探针存在于有效的数据组中。我们首先计算每种基因的平均值，然后计算这些值的RASGRP1 APTX比。比例在1以上的患者归类为进展者，那些比例低于1的患者归类为反应者。然后进行卡普兰-迈耶分析。图6描绘了 Affymetrix和qPCR数据的相关性。通过线性回归分析比较了同时用 Affymetrix基因芯片和qPCR两者进行了分析的9个RNA样品。发明详述在该说明书中涉及的治疗剂是FTI。它们呈现多种形式，但共有干扰或削弱癌症和增殖性疾病相关蛋白的法尼基化的基本抑制功能。FTI优选是那些适用于治疗白血病如 AML的FTI。对FTI起反应的患者是指那些用FTI治疗后在骨髓中可见到超过50%母细胞下降的患者。多种FTI 在本发明范围之内，包括在 5，976，851 ；5, 972，984 ；5, 972，966 ； 5，968，965 ；5，968，952 ；6，187，786 ；6，169，096 ；6，037，350 ；6，177，432 ；5，965，578 ； 5，965，539 ；5，958，939 ；5，939，557 ；5，936，097 ；5，891，889 ；5，889，053 ；5，880，140 ； 5，872，135 ；5，869，682 ；5，861，529 ；5，859，015 ；5，856，439 ；5，856，326 ；5，852，010 ； 5，843，941 ；5，807，852 ；5，780，492 ；5，773，455 ；5，767，274 ；5，756，528 ；5，750，567 ； 5，721，236 ；5，700，806 ；5，661，161 ；5，602，098 ；5，585，359 ；5，578，629 ；5，534，537 ； 5，532，359 ；5，523，430 ；5，504，212 ；5，491，164 ；5，420，245 ；和 5，238，922 中描述的那些。 优选非肽类即“小分子”的治疗剂。更优选FTI为例如以下的喹啉或喹啉衍生物7- (3-氯苯基)-9- [ (4-氯苯基)-IH-咪唑基甲基]_2，3_ 二氢_1H，5H-苯并 [ij]喹嗪-5-酮，7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-IH-咪唑基甲基]_1，2_ 二氢_4H_吡咯并 [3，2，l-ij]喹啉-4-酮， 8-[氨基氯苯基)(1-甲基-IH-咪唑-5-基)，甲基]-6- (3-氯苯基)_1，2_ 二氢-4H-吡咯并[3，2，l-ij]喹啉-4-酮，和8-[氨基氯苯基)(1-甲基-IH-咪唑-5-基)甲基]_6_ (3_氯苯基)_2，3_ 二氢-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮。最优选的FTI是⑶-6-[氨基(4-氯苯基)(1_甲基-IH-咪唑-5-基)甲基]-4- (3-氯苯基)-1-甲基-2 (IH)-喹啉酮)。在本发明包含用FTI和其它治疗剂治疗白血病方面，在该说明书中涉及的治疗剂是通过白血病细胞的基因表达分析说明的对生物途径有影响的那些治疗剂，所述白血病细胞接受过基于喹啉酮(quinilone)的FTI的治疗。只是在基因组内存在有表达蛋白质或多肽潜力的核酸序列(“基因”)，并不能决定蛋白质或多肽是否在既定的细胞中表达。即使是有，能够表达蛋白质或多肽的既定基因是否进行表达以及这样的表达发生至何等程度，还取决于很多复杂的因素。不管理解和评价这些因素的困难如何，对基因表达的分析可提供关于对既定刺激(如引入药物或其它治疗剂)的细胞反应的有用信息。基因活跃或者不活跃程度的相对指示可在基因表达概况中找到。本发明的基因表达概况用来鉴定和治疗可能受益于既定疗法的患者，或者排除患者接受该患者可能会对药物或疗法产生较少甚至不产生有益反应的既定疗法。建立基因表达概况的优选方法(包括那些用来得出相关生物途径解释的方法) 包括测定由可编码蛋白质或多肽的基因所产生的RNA量。这通过以下方法来完成反转录PCR(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、差示RT_PCR、RNA印迹分析和其它相关试验。 虽然可使用各别的PCR反应来实施这些技术，最好放大扩增由mRNA产生的副本DNA (copy DNA, cDNA)或副本RNA(copy RNA, cRNA)并通过微阵列对其进行分析。很多不同的阵列结构和它们的生产方法已为本领域技术人员所熟知并描述于以下在美国专利中例如美国专利号 5，445，934 ；5，532，128 ；5，556，752 ；5，242，974 ；5，384，261 ；5，405，783 ；5，412，087 ； 5，424，186 ；5，429，807 ；5，436，327 ；5，472，672 ；5，527，681 ；5，529，756 ；5，545，531 ； 5，554，501 ；5，561，071 ；5，571，639 ；5，593，839 ；5，599，695 ；5，624，711 ；5，658，734 ；和5，700，637。微阵列技术使得能够同时进行数千个基因的稳态mRNA水平的测量，因此其代表了一种强有力的工具，用于鉴定FTI的细胞生物学作用和鉴定基于这些作用的分析的可能的治疗效果。目前有两种微阵列技术被广泛使用。第一种是cDNA阵列，第二种为寡核苷酸阵列。尽管在这些芯片的结构中存在差异，但是几乎所有的下游数据分析和输出是相同的。 这些分析的结果通常是从标记的探针所收到的信号强度的测量结果，该探针用来检测来自样品的与微阵列上的已知位置的核酸序列杂交的cDNA序列。通常，信号强度与cDNA的量成正比，因此与在样品细胞中表达的mRNA也成正比。很多这样的技术都是有效且有用的。 可在6，271，002 ；6, 218，122 ；6, 218，114 ；和6，004, 755中找到测定基因表达的优选方法。通过比较这些强度来实施对表达水平的分析。最好是通过生成试样中的基因表达强度对在对照样品中的基因表达强度的比值矩阵(ratio matrix)来完成。例如，可将来自于已用药物处理的组织的基因表达强度与产生于相同的未用药物处理的组织的表达强度相比较。这些表达强度的比例显示在试样和对照样品之间基因表达的倍数变化。还可以多种方式展示基因表达概况。最常用的方法是将比值矩阵排列成树状图 (graphical dendogram)，该图中纵列表示试样，横排表示基因。将数据如此排列以使具有相似表达概况的基因互相接近。每一基因的表达比通过颜色显现出来。例如，小于1的比例 (表明是减量调节)可显示在谱(spectrum)中的蓝色部分，而大于1的比例(表明是增量调节)可在谱中显示为红色部分。商用计算机软件程序(包括来自Batelle的〃 0MNIVIZ PRO"软件和来自Stanford的〃 TREE VIEW"软件)可用来显示这种数据。表达上有差异的各种基因在经FTI治疗的患病细胞中被增量调节或者减量调节。 增量调节和减量调节是相对的术语，意思是在相对于某一基线而言的基因表达量中发现可检测出的差异(除去在用来测量的系统中噪音的影响)。在该情况下，所述基线就是未经治疗的患病细胞中的所测量的基因表达。在使用同样的测量方法时，经治疗的患病细胞中的目标基因相对于基线水平被增量调节或者减量调节。优选地，基于杂交的微矩阵探针的强度测量结果的倍数变化来区分上减量调节的水平。优选将1. 5倍的差异用于进行这样的区分。也即是说，当发现经治疗的细胞比未经治疗的细胞产生至少高于1. 5倍的强度或至少低于1. 5倍的强度时，则认为基因在经治疗与未经治疗的患病细胞之间存在表达差异。在基因表达测量中更优选1. 7倍的差异，最优选2或倍数更大的差异。一套基因(a portfolio of gene)是一组按以下来分类的基因使所获的有关该组基因的信息可提供用于作出临床相关判断(例如诊断、预后或治疗选择)的基础。在该情况下，各套基因所支持的判断包括用FTI的白血病治疗。多套基因表达概况可由基因组合组成。本发明一个方法包括比较各种基因的基因表达概况以确定是否个人可能对治疗剂的使用起反应。已经建立了区分反应者和非反应者的基因表达概况，各人的基因表达概况被安装在在介质上(如下面所描述的计算机可读的介质)。得到含有患病细胞(如AML 情况下的造血母细胞)的患者样品。然后从疾病患者细胞中获得样品RNA并进行扩增，优选通过微阵列得到关于合适的多套基因中的基因的基因表达概况。然后将样品的表达概况与先前确定为反应者和非反应者的那些概况进行比较。如果样品表达模式与FTI非反应表达模式一致，那么表明可使用FTI进行治疗。优选地，基于根据上述所读取的微阵列的强度测量结果来确定表达模式的一致性。可以同样的方式将基因表达概况分析用于监控治疗反应。在该方法的一方面，可将如上所述的基因表达分析应用于在整个疗程不同时期的经FTI治疗的患者。如果基因表达模式与反应者一致，则可继续患者的治疗。如果不一致，则可将患者的治疗改为使用另外的治疗剂如酪氨酸激酶抑制剂、改变剂量，或排除FTI治疗。这样的分析使得可以在可察觉的临床标志(clinical indicia)之前或面对另外的不明确临床标志时对介入和治疗进行调节。有可能会得到以下不明确的结果其中一些基因表达概况为在某些方面表明为反应者而在其它方面表明为非反应者的记录。例如，概况可显示三个基因被增量调节而与反应者一致，但另一个基因不被增量调节为对于应答者而言的一般情形。在这种情况下，可用统计学算法确定患者对药物反应或不反应的可能性。适用于这一目的的统计学算法已为人熟知且为可利用的。本发明的制品(article)表示了适用于治疗、诊断、预测、疾病分期和其它评价疾病方式的基因表达概况，其被简化(reduce)成为可自动读取的介质例如计算机可读介质 (磁介质、光介质等等)。该制品还可包括在这种介质中的用于评价基因表达概况的说明书。例如，该制品可包含含有用于比较上述多套基因的基因表达概况的计算机说明书的⑶ ROM。该制品还含有数字化记录到当中的基因表达概况，以便可用它们与来自患者样品的基因表达数据相比较。或者，可以不同的代表性形式来记录概况。图形记录就一种这样的形式。图1显示了这种纪录的图形显示的实例。诸如上面提及的合并到"0MNIVIZ"和"TREE VIEW"计算机程序中的那些聚类算法(clustering algorithm)可最好地参与这些数据的可视化。本发明的另外的制品是被安装来辨别本发明基因表达概况的上述核酸阵列(例如cDNA或寡核苷酸阵列)。使用聚类分析(包括以上所提及的算法)，可比较患者样品的表达水平，以建立具有某个统计学可信度的基因之间的调节关系。可基于这样的表达数据来构建动态图。这种遗传学网络图对于药物发现是有用的。例如，一旦鉴定出基本的目标基因，则用这种遗传学网络图来找出一系列潜在的上游调节基因。然后对所确定的基因或它们的表达产物进行将其用作药物靶标方面的分析。在一些实施方案中，所确定的特定基因的调节功能被用来确定用于治疗白血病的治疗剂。转录调节、RNA加工和RNA编辑都是通过由它们自己的基因所编码的蛋白质来完成。另外，DNA序列可通过位置效应实施对其它基因表达的远程控制。因此，基因表达经常被其它基因的表达所调节。相对于被调节的基因或下游基因，那些调节基因被称为上游基因。在一个简单的调节途径中A++ > B— > C++ > D，其中A，B, C，D是基因，++为上调解，一为减量调节。基因A是基因B的上游基因，B是C的上游基因。本领域技术人员会认识到的是，网络往往成环且内部相连。在一些实例中，基因的表达被作为正反馈或者负反馈的其自身的产物调节。聚类分析法被用于分类其表达水平相互关联的基因。聚类分析法详述于 Harfigan(1975)Clustering Algorithms, NY,John Wile 禾口 Sons,Inc 禾口 Everritt, (1980) Cluster Analysis 第 2 版· London HeinemanEducational books, Ltd。途径分析(pathanalysis)用于分解变量之间的关系及用于试验遗传网络的因果模型。在白血病细胞中，药物的多个主要靶标被鉴定为可用于治疗这种细胞的一种或多种药物的种类。根据本发明， 药物是干扰生物学系统的具有任何程度复杂性的任何化合物。药物的生物效应可为药物介导的以下变化的结果一种或多种RNA的转录或降解速率的变化、一种或多种多肽翻译或翻译后加工的速率或程度的变化、一种或多种蛋白质降解的速率或程度的变化、一种或多种蛋白质作用或活性的抑制或刺激的变化等等。除了优选的FTI之外，本发明优选的药物是那些调节MAPK/ERK信号转导途径、TGF-β、WNT或凋亡途径的药物。这些药物包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂、MEK激酶抑制剂、Ρ13Κ激酶抑制剂、MAP激酶抑制剂、凋亡调节剂及其组合。在这些药物中最优选的示例性药物是 Novartis的〃 GLEEVEC"酪氨酸激酶抑制剂、U-0126MAP激酶抑制剂、PD-098059MAP激酶抑制剂、SB-203580MAP激酶抑制剂、反义链(antisense)、核酶和DNA酶Bcl-XL抗凋亡剂。 其它有用药物的实例包括但不限于6，306，897的香豆素类化合物、6，284, 764的取代双环、 6，133，305的二氢吲哚和6，271，210的反义寡核苷酸。如所记录的，本发明的药物可为涉及基因疗法或反义疗法的治疗剂。序列与mRNA 序列互补的寡核苷酸可被引入细胞以阻断mRNA的翻译，从而阻断编码mRNA的基因的功能。 例如在Mrachan和Read，Human Molecular Genetics, 1996中描述了阻断基因表达的寡核苷酸的应用。这些反义分子可为DNA、稳定的DNA衍生物如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯、RNA、稳定的RNA衍生物如2' -0-烷基RNA、或其它反义寡核苷酸模拟物。可以通过显微注射、脂质体包被或通过包含反义核酸序列的载体的表达，将反义核酸分子引入细胞。在基因疗法的情况下，目标基因可被连接到病毒载体中，所述病毒载体通过感染受体宿主细胞来介导治疗剂DNA的转移。合适的病毒载体包括逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒等等。或者，治疗剂DNA可通过非病毒技术转移入细胞进行基因治疗，这些技术包括使用配体DNA缀合物或腺病毒配体DNA缀合物的受体介导的靶DNA转移、脂质转染法膜融合或直接显微注射。这些方法及其变型适用于离体和体外基因治疗。这些适合用基因来进行的基因治疗的分子方法的方案在由Paul D. Robbins, Human press, Totowa NJ，1996 编写的 Gene Therapy Protocols (基因治疗方案)中有所描述。可根据已知的方法(例如通过与可药用的载体混合)配制包含本发明药物的可药用的组合物。这种载体的实例和配制方法可在Remington，s Pharmaceutical kiences中找到。为了形成适用于有效给药的可药用组合物，这样的组合物将含有有效量的药物。药物的有效量可根据各种因素例如个体的病症、重量、性别和年龄而变化。其它因素包括给药的模式。可通过各种途径如皮下、局部、口服和肌内将药物组合物提供给个体。本发明的药物包括药物基础分子的化学衍生物。也就是说，它们可含有通常不是基础分子一部分的另外的化学部分。这样的部分可以改善基础分子的溶解性、半衰期、吸收等。或者，所述部分可削弱基础分子的不合乎需要的副作用或者减少基础分子的毒性。这样的部分的实例在很多教科书中有所描述，例如Remington，s WiarmaceuticaBciences。根据本文公开的方法所确定的化合物可按常规测试所确定的合适剂量来单独使用，以得到最佳的抑制作用或活性，同时使任何潜在毒性最小化。另外，其它药剂的共同给药或序贯给药可为期需的。可用多种治疗剂剂型在用于给药的常规赋形剂中给予本发明的药物。例如，可按口服剂型或者通过注射来给予药物，口服剂型例如为片剂、胶囊剂(各胶囊剂包括择时释放制剂和持续释放制剂)、丸剂、散剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂。 同样，它们还可通过静脉内(推注和输注)、腹膜内、皮下、有或无闭塞的局部、或肌内形式进行给药，所有使用的形式都为那些药学领域的普通技术人员所熟知。所需化合物的有效而无毒的量可用作调制剂。制品的日剂量在每位患者每天0. 01-1，OOOmg的较宽范围内变化。对于口服给药， 优选以有刻痕或无刻痕的片剂形式提供组合物，所述片剂含有0. 01,0. 05,0. 1,0. 5,1. 0、 2. 5,5. OUO. 0,15. 0,25. 0和50. 0毫克有效成分用于被治疗患者的症状调节剂量。通常以每天大约0. 0001mg/kg-大约100mg/kg体重的剂量水平提供药物的有效量。更具体的范围是每天大约0.001-10mg/kg体重。当联用药剂以达到所需的效果时，对剂量进行调整。另一方面，这些不同药剂的剂量可独立地被优化和联用，以达到协同的效果，其中病状的降低程度将比单独使用任一试剂时更大。有利的是，在本发明中使用的化合物或调节剂可按单个日剂量给药，或者总日剂量可以分成每天2、3或4次的单独剂量进行给药。此外，通过局部使用合适的鼻内赋形剂以鼻内形式，或者使用为本领域普通技术人员所熟知的透皮贴剂形式通过透皮途径，对本发明的化合物或调节剂进行给药。作为透皮释药系统的形式的给药，贯穿整个剂量方案的剂量给药将理所当然是连续的而非间歇的。对于使用超过一种活性剂的联合治疗(其中活性剂是独立剂量制剂)，活性剂可同时进行给药，或者它们中的每一种单独错开的时间进行给药。利用本发明的化合物或调节剂的剂量方案依照多种因素进行选择，这些因素包括患者的类型、种类、年龄、体重、性别和医学病况；治疗条件的严格性；给药的途径；患者的肝肾功能；所使用的具体药物。普通的医师或兽医能够很容易地确定和开出所需要用来预防、制止或阻止病症进展的有效量的药物。使药物浓度准确而最佳地定在产生功效而无毒性的范围内，需要基于对靶位点的药物有效性的动力学的方案。这涉及到对药物的分布、平衡以及清楚的考虑。本发明的药物可形成有效成分，并且通常与合适的药物稀释剂、赋形剂或载体 (在本文中一并称作“载体”材料)混合进行给药，所述载体材料根据预定的给药方式(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等等)而合适地选择，并与传统的药学实践一致。例如，对于以片剂或胶囊剂形式的口服给药，活性药物组分可与无毒的可药用口服惰性载体如乙醇、甘油、水等等相结合。此外，当有需要或有必要时，合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可合并到混合物中。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、凝胶、天然糖 (例如葡萄糖或β -乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成橡胶如阿拉伯树胶、黄芪胶或藻酸钠、 羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。用于这些剂型的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、 硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等等。对于液体形式，活性药物组分可与适当矫味的助悬剂或分散剂结合，所述助悬剂或分散剂例如为合成的和天然的树胶，例如黄氏胶、阿拉伯树胶、甲基纤维素等等。其它可用的分散剂包括甘油等等。对于肠胃外给药，无菌的混悬剂和溶液剂是期需的。当需要进行静脉内给药时，可使用通常含有适当防腐剂的等渗制剂。本发明药物还可以脂质体释药系统的形式进行给药，例如小的单层泡囊 (unilamellar vesicle)、大的单层泡囊和多层泡囊。脂质体可由多种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱构成。本发明的药物还可通过使用化合物分子与之相偶联的单克隆抗体作为单独载体进行递药。本发明的药物还可与作为可靶向的药物载体的可溶性聚合物进行偶联。这样的聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺酚(polyhydroxyprop ylmethacry 1-amidephenol)、聚轻乙基天冬酉先月安 ) (polyhydroxy-ethyIaspartamidephen ol)或用棕榈酰残基取代的环氧乙烯-赖氨酸共聚物(polyethyl-eneoxicbpolylysine)。 此外，本发明的药物可与一类用于实施药物控释的可生物降解聚合物相偶联，所述聚合物例如为聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性分子的嵌断共聚物。对于口服给药，药物可以胶囊剂、片剂或大丸剂形式进行给药，或者备选地将其与饲料混合。胶囊剂、片剂或大丸剂由与适当载体如淀粉、滑石粉、硬脂酸镁、或磷酸二钙结合的有效成份组成。通过将有效成分与适当细碎粉末化的惰性成分(包括稀释剂、填充剂、崩解剂和/或粘合剂)紧密混合从而得到均一的混合物，来制备出这些单位剂型。惰性成分是一种不与药物进行反应并且对被治疗动物无毒性的成分。合适的惰性成分包括淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、植物树胶(vegetative gum)和油等等。这些制剂可含有在量上有很大变化的活性和非活性成分，这取决于很多因素如被治疗的动物种类的大小和类型以及感染的类型和严重性。还可通过简单地将化合物与饲料混合或者通过将化合物施用于食物的表面来给予有效成分。化合物或调节剂可备选地通过注射由溶解在惰性液体载体中的有效成分组成的制剂来进行肠胃外给药。注射可以是肌内注射、管腔内(intraluminal)注射、气管内注射或者皮下注射。可注射的制剂由与合适的惰性液体载体混合的有效成份组成。可接受的液体载体包括植物油如花生油、棉籽油、芝麻油等等和有机溶剂如丙酮缩甘油(solketal)、 甘油甲醛等等。作为备选，还可使用肠胃外水性制剂。植物油是优选的液体载体。通过在液体载体中溶解或悬浮有效成分使最终的制剂中含有0. 005-10%重量的有效成份，来制备所述制剂。本文引用的所有参考通过引用结合到本文中。通过下列非限制性实施例来进一步说明本发明。实施例1材料和方法临床评价本研究利用了 67个骨髓样品，其收集自标签公开、多中心、非比较性的2期研究，所述研究在158名事先未经治疗的高风险AML老年人中研究了替匹法尼(R115777， ZARNESTRA )对法尼基转移酶抑制的功效和安全性。已在其他地方对临床结果进行了 公布。Lancet 等(2006)。样品收集和处理
在用替匹法尼治疗之前从同意的患者收集骨髓样品并就地处理单核细胞。用PBS 稀释骨髓抽吸物并用菲可-泛影酸盐(1.077g/ml)进行离心。用PBS洗涤富集的白血病血细胞2次，用10% DMSO重新悬浮于FBS中，立即于_70°C —80°C下冻干。用Trizol试剂盒 (Qiagen, Santa Clarita，CA)从细胞样品中提取总RNA。通过评价Agilent生物分析仪上核糖体泳带的存在来确定RNA的质量。对质量高的样品作进一步处理用于微阵列分析。根据制造商说明书(Qiagen，Santa Clarita，CA)，从相同的Trizol处理过的骨髓样品中分离出DNA。分析样品的总基因表达、N-Ras突变和/或特定基因的qPCR(图1)。N-Ras突变状态根据前述的PCR和RFLP分析来确定N_ras中活化突变的分析。End等Q001)。 N-ras基因的外显子1和2在单个多重反应中同时扩增，并将等分试样用于第二轮的PCR。 在第二轮扩增子中对天然的限制酶位点或引物造成的限制酶位点处切割的抗性表明存在已消除位于被分析的基因座上的所述位点的突变。用于特定基因座分析的限制酶是Bsl I (N-ras 密码子 12 和 13)、Msc I (N-ras 密码子 61，位置 1 和 2)，和 Bfa I (N-ras 密码子 61， 位置幻。消化反应过夜，在Agilent生物分析仪上分析PCR产物。微阵列分析按照Affymetrix (Santa Clara，CA)的方案进行cDNA和cRNA的合成。由于很多样品的产量低，因而如先前所描述的进行两轮线性扩增。20070048782。为进行杂交，通过在40mM Tris-乙酸、pH 8. 1、IOOmM乙酸钾、30mM乙酸镁中94°C下温育!35min，将11 μ g的 cRNA随机片段化。将片段化的cRNA与U133A阵列在设置为60rpm的烤炉中于45°C下杂交 16小时。杂交后，(用含有Triton X-100 (0. 005% )的6x SSPE和0. 5x SSPE)洗涤阵列， 并用链霉抗生物素-藻红蛋白(SAPE ;Molecular Probes, Eugene, OR)染色。用Agilent G2500A GeneArray 扫描仪(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)对被结合的标记探针定量。将每个阵列的总荧光强度缩放到(scale)统一的值600。通过计算对信噪比(原始平均信号/噪音)的信号来量化芯片性能。如果芯片的信噪比低于20或者如果芯片上的存在呼应(present call)低于30%，则不用它们做进一步的分析。如果基因在至少10% 的芯片中被呼应为“存在”，则仅将其用于进一步的分析。大约12，000个Affymetrix探针组保持遵循这种截断。通过确定基于主要组分分析的异常值和通过分析基因强度的正常分布，进一步控制基因表达数据的质量(Partek Pro V5. 1)。已将微阵列的数据存放于NCBIs Gene Expression Omnibus (GEO, http //www, ncbi. nlm. nih. gov/Reo/)中并可通过 GEO 系列登记号GSEXXXX得到。反应定义在临床论文中报道了对替匹法尼的反应，其被定义为具有完全反应(CR)、部分反应(PR)或血液改善(HI)的患者，Lancet等Q006)。简言之，HI被定义为任何骨髓胚细胞计数(bone marrow blast count)低于5%或骨髓胚细胞(bone marrow blast)减少至少一半。进行性疾病(PD)被定义为在骨髓胚细胞或循环胚细胞(circulating blast) %中比基线增加> 50%，或者出现新的循环胚细胞(曾经至少连续2次)。稳定的疾病(SD)被定义为不符合CR、PR、HI或PD标准的任何反应。统计学分析
用受试者工作特征(ROC)分析来检验个别基因和/或多基因分类物总预测值。 下列基因过滤标准用于鉴定在反应者和有进行性疾病的患者之间表达有差异的基因在 100%的灵敏度下鉴定“反应者”的特异性>=40%，T-试验ρ值(带不等方差的log2转换的数据)< 0. 05，倍数变化> 2。用AUC(R0C曲线下面积)将通过这些标准的基因分等级。为了建立分类物，将反应得分用以计算每名患者对替匹法尼治疗反应的机会。该得分被定义为加权表达信号与作为权的t统计量的线性组合。从训练集(training set)的 ROC曲线测定阈值，以确保100%的灵敏度和最高的特异性。为了确定预测物中需要包含多少种基因，进行了留一法交叉验证(LOOCV)。记录基于不同数目基因的“留外(leaveout)” 样品的反应得分。基于错误分类的差错率、灵敏度、特异性、测量两个预测组的卡普兰-迈耶曲线的分离的P值，来评估含不同数目基因的预测物的性能。从而选出最佳的预测物。Geman等人Q004)首先引入最高得分配对(Top Scoring Pair，TSP)算法。大体上，该算法基于事件频率的绝对差(Dij)将所有基因对(基因i和j)进行分类，其中在级别 C1-C2之中的样品中，基因i比基因j有更高的表达值。在有多个最高得分对(top scoring pair)的情况下(全部共有同样的Dij)，我们通过二次分级得分(secondary rank score) 选出最高得分对，所述二次分级得分测量在基因对内发生基因表达水平从一个类别颠倒为另一个类别的大小。在所有样品中绝对Di j最高频率> 2倍的最高得分对将被选作候选对。 然后在独立测试数据组(ind印endenttesting data set)中评定候选对。在训练数据集中进行留一法交叉验证(L00CV)，以评价该算法是怎样进行的。基于最大错误分类的差错率来评价预测物的性能。使用R(R开发核心小组(R Development Core Team), 2006)完成所有的统计学分析。实时定量RT-PCR对于每个样品，用High Capacity cDNA Transcription 试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)按照厂商说明书将1 μ g总RNA(于OD26tl进行评价)进行反转录。为使RNA进行最适宜的转变，将样品置于25°C下孵育lOmin，然后37°C下孵育 30min。使用 ABIPrism 7900HT 序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)进行QPCR，所有的样品以一式三份运行。每个反应含有5μ1含UNG的TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) >4. 5 μ 1 11 cDNA> 0. 5 μ 1 20x Assay on Demand Gene ExpressionAssay Mix、或9pmol 正向禾口反向弓|物以及 2. 5pmol 探针(AppliedBiosystems, Foster City，CA)，总反应体积为 10μ1。对所有引物、 探针组所作出的选择归因于小的扩增子大小(小于100个核苷酸)，并使用了 FAM荧光探针。使用的引物和探针是ΑΡΤΧ(产品号4331182Applied Biosystems)和RASGRP1(产品号 4351372AppliedBiosystems)。通过以下来计算RASGRP1 APTX表达比从样品集中减去平均Ct来正规化原始Ct值，除以标准差，然后计算每种基因(APTX-RASGRP1)正规化Ct值之差。Ma等Q004)。结果本研究检验了在法尼基转移酶抑制剂替匹法尼的2期临床试验中登记的患者的白血病骨髓样品的基因表达概况，所述2期临床试验在患有先前未经治疗的低风险急性髓细胞性白血病的老年患者中进行。Lancet等Q006)。在用替匹法尼治疗之前，收集了来自67名患者的骨髓，并用菲可(Ficoll)密度离心法富集白血病骨髓细胞(表1)。将来自13 名反应者(9CR，4HI)、8名稳定疾病患者和13名进行性疾病患者的高质量总RNA进行扩增、 标记并与Affymetrix U133A基因芯片进行杂交。对总共30个样品用qPCR进行评价以确证特异性基因，对32个样品的N-Ras突变状态进行评价。
表1.经概况分析的患者的比较
权利要求
1.一种测定急性髓性白血病(AML)患者对替匹法尼反应的方法，所述方法包括测量所述患者中的二基因表达比(RASGRP1 APTX)。
2.权利要求1的方法，其中所述AML选自新确诊的AML、复发或难治性AML。
全文摘要
一种简易的二基因即RASGRP1:APTX表达测定，用于诊断急性髓性白血病(AML)患者群，所述患者更可能对使用替匹法尼(RI15777.ZARNESTRA)的法尼基转移酶抑制有反应。
文档编号G01N33/48GK102317772SQ200880015763
公开日2012年1月11日 申请日期2008年3月13日 优先权日2007年3月12日
发明者H·范, M·拉波尼, Y·王 申请人:维里德克斯有限责任公司