分子相互作用的检测方法

专利名称：分子相互作用的检测方法
技术领域：
本发明涉及检测细胞中各种生物活性分子之间的动态相互作用的方法以及测定 调节生物活性分子的相互作用和功能的分子的方法。
背景技术：
一般说来，各种生理功能受到各种生物活性分子之间的动态相互作用的调节。如 果这种相互作用不能正确发生，出现的问题是引起疾病。例如，蛋白质在体内通过与其他蛋 白质相互作用执行它们的功能。一般说来，具有互补结构的两种蛋白质彼此相互作用，并且 生物活性化合物专一性地与三维蛋白质结构的特定部分相互作用。通常，两种蛋白之间的 相互作用强烈暗示它们功能上相关。此外，跟与疾病相关的蛋白的特定部分专一性相互作 用的生物活性化合物通过控制蛋白质的活性具有作为可诊断、预防、治疗或者减轻疾病的 治疗剂的可能性。因此，在新药开发领域，已经研究了用于测定新目标蛋白或者通过测定其功能和 性质已知的“诱饵(bait)，，与作为待分析和检测的相互作用伴侣的“捕获物(prey)，，之间 的相互作用来筛选生物活性分子作为药物候选的各种方法。因此，通过分析生物活性分子 之间的相互作用识别和分离新的目标蛋白对于得到有关生物活性化合物的活性、有效性和 反作用的有用信息来说被认为是非常重要的研究课题。另外，目标蛋白促进了生物学途径 和信号转换系统的理解，并提供了有关基础细胞调节和疾病机制方面的信息。这种信息对 于通过分析并测定与目标蛋白相互作用的生物活性化合物以开发新药物、改进现有药物并 揭示现有药物的新治疗用途来说是非常强有力的工具。现代医学面临着开发更安全和更有效的疗法的挑战。但是，目前正在使用的许多 药物都由在疾病模型中的生物学效果所规定，而不由它们的目标蛋白质和分子靶标所规定 (L. Burdine 等人，Chem. Biol. 11 :593，2004 ； J. Clardy 等人，Nature 432:829,2004)。天 然生物活性产品是药物开发的重要来源，但是它们的作用模式常常是未知的(J. Clardy等 人，Nature 432 :829，2004)。它们的生理学目标和分子靶标的说明对于理解它们的治疗效 果和副作用来说是必不可少的，从而能够改进第二代治疗剂的开发。此外，临床证实的化合 物的新靶标的发现可建议新的治疗应用(T. T. Ashburn等人，Drug Discov. 3 =673,2004)。在采用基于高通量细胞筛选的化学_生物领域，“目标筛选”被用于从大的化 合物文库中识别具有所需表型的小分子(R. L. Strausberg等人，Science300 =294,2003 ； B. R. Stockwe 11, Nature 432 :846，2004)。尽管这种筛选具有巨大利益，但该途径还是受到 目标识别的惊人的工作量的阻碍。但是，这种识别技术的发展在各种生物科学领域都非常 重要，包括基因组学、蛋白质组学和系统生物学，因为各种各样的细胞内分子相互作用的有 效检测，包括蛋白(或者小分子)_蛋白质的有效测定对于理解动态生物学过程和调节网络 来说是必须的。在目标筛选领域，一些技术，包括亲和色谱法(Phizicky，E.M.等人，Microbiol. Rev. ,59 94,1995 ；Mendelsohn A. R.等人，Science，284 1948，1999)，蛋白质小分子微阵列，噬菌体展示(Sche, P.P.等人，Chem. Biol.，6:707，1999)，酵母双/三杂交测定 (Licitra, E.J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 :12817，1996)，表达谱分析以及具有异 源缺失的酵母菌株的平行分析(Zhenget等人，Chem. Biol.，11 =609,2004)已经被用于分析 生物活性分子之间的相互作用。但是，这些技术都受到多种问题的困扰，包括高背景噪声、 假阳性、低灵敏度、蛋白质表达后的不适当折叠、间接性(indirectness)、蛋白质表达后缺 乏修饰，或者包括细胞相容性的限制目标的可接近性(accessibility)。另外，人工实验环 境的使用，例如体外结合条件或者非哺乳动物细胞有时导致实验结果的错误。因此，最优选的是在生理或者药物条件下考虑了高灵敏度和选择性的状态下直接 检查生物活性分子之间的相互作用。探测活的哺乳动物细胞内的分子相互作用的技术例如 荧光共振能量转移技术(FRET) (Moshinsky，D. J.等人，Screen.，8(4) =447,2003)或者蛋白 质片段互补测定技术(PCA)都是可以利用的，但是它们受到特定空间定向或者相互作用伴 侣之间的距离的要求的限制。因此认为，开发上述的基本技术以便提供现有技术所不具备的各种优点是非常重 要的。首先，通过探测生理或者药物相关的生物活性物质或者分子之间的相互作用，可 极大地减少由人为实验设置所产生的误导性的结果。第二，不同于依赖总体表达谱或者复 杂的生物表型的间接读出方法，能够直接将生物活性分子之间的相互作用转化成清楚的读 出信号。因此，可避免有关生物活性分子和分子靶标的内在假阳性/阴性或者错误倾向的 推导。第三，对于生物活性分子之间的相互作用来说能够进行动态的单细胞分子的分析。单 个活细胞的动态分析提供了可在生理和药物条件下的广泛范围内分析异源细胞间不同时 发生的细胞内过程的有效方法。因此，上述的基本技术可被用于检测在广泛的组织和疾病状态的范围内在活细胞 内的各种生物相互作用(例如生物活性小分子和蛋白质之间的相互作用)和蛋白质修饰 (例如磷酸化)。为了满足上述的基本技术的需要并解决现有技术中出现的问题，本发明的发明人 不仅已经在体外研究了动态分子生物活性分子之间的相互作用，而且还研究了在体内的相 互作用。结果，本发明的发明人发现，生物活性分子之间的相互作用可通过分析各种生物活 性分子是否导致纳米组装阵列的形成或者生物活性分子是否共同定位在纳米组装阵列上 来分析和测定，由此完成本发明。

发明内容
发明目的本发明的目的在于提供直接测定作为专一性生物活性分子的诱饵与用于测定与 作为待测生物活性分子的捕获物之间的相互作用的方法，以及用于测定与诱饵相互作用的 捕获物的方法。本发明的另一目的在于提供分析和测定阻断、抑制、活化或者诱导诱饵和捕获物 之间的相互作用的目标分子的方法。为了实现上述目的，在第一种实施方式中，本发明提供了测定分子相互作用的方 法，所述方法包括下列步骤(i)将纳米组装阵列形成物质、诱饵和捕获物提供到同一场合
7或者系统；(ii)通过诱饵与捕获物之间的相互作用形成纳米组装阵列；以及(iii)检查纳 米组装阵列是否形成，由此测定诱饵_捕获物的相互作用。这里，诱饵-捕获物相互作用通 过分析捕获物与诱饵是否相互作用形成纳米组装阵列来检测。在第二种实施方式中，本发明提供了测定分子相互作用的方法，包括下列步骤
(i)将媒介(调节)物质和具有与其结合的诱饵的纳米组装阵列提供到同一场合或系统；
(ii)通过媒介物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)为形成的纳米组装阵列提供 捕获物；以及(iv)通过与在形成的纳米组装阵列上存在的诱饵的相互作用测定捕获物的 结合位置，以便测定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定诱饵_捕获物的相互作用。这 里，分子相互作用通过分析捕获物与纳米组装阵列上的诱饵是否共同定位来测定。在第三种实施方式中，本发明提供了测定分子相互作用的方法，包括下列步骤 (i)将结合有第一媒介(调节)物质的纳米装配阵列形成物质和结合有第二(调节)物质 的诱饵提供到同一场合或系统；(ii)通过第一媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳 米组装阵列，并通过第二媒介物质之间的相互作用将诱饵结合到形成的纳米组装阵列上；
(iii)给形成的纳米组装阵列提供捕获物；以及(iv)通过与结合到形成的纳米组装阵列上 的诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置以便确定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定 诱饵_捕获物相互作用。这里，诱饵_捕获物相互作用通过分析捕获物是否与纳米组装阵 列上的诱饵共同定位来测定。此外，本发明提供了测定阻断(抑制)或者活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相 互作用的目标分子的方法。通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加明显。


图1是显示根据本发明的第一种方法构造的用于测定X和Y之间的直接相互作用 或者X和Y通过A的间接相互作用的示意图。在图1中，X、Y和A是相同或不同物质，并且 N是纳米组装阵列形成物质；图2(a)是显示根据本发明的第二种方法构造的当通过A和B之间的直接相互作 用或者A和B通过C的间接相互作用诱导的纳米组装阵列形成时用于测定探针X和Y之间 的相互作用的示意图。在图2中，A、B和C是相同或不同物质，X和Y是相同或不同物质， 并且N是纳米组装阵列形成物质；图2(b)是显示根据本发明的第三种方法构造的当通过第一种媒介(调节)物质 A、B、C和D之间的相互作用诱导的纳米组装阵列形成时测定X和Y之间的相互作用同时通 过第二种媒介(调节)物质E和F之间的相互作用测定物质X与形成的纳米组装阵列结合 的示意图。这里，A、B、C和D是相同或不同物质，E和F是相同或不同的物质，X和Y是相 同或不同物质，并且N是纳米组装阵列形成物质；图3示出了通过铁蛋白的自组装形成的纳米单元阵列的结构；图4是显示测定物质FKBP和FRB通过媒介雷帕霉素(雷帕霉素)彼此相互作用 形成纳米组装阵列的示意图；图5是显示通过细胞中的FKBP-FRB相互作用的纳米组装阵列形成的荧光显微照片；图6是显示在各个时间点通过FKBP-FRB相互作用的纳米组装阵列形成的共聚焦 显微照片；图7是显示与FKBP和FRB结合的荧光蛋白彼此交换的情形的荧光显微照片；图8和图9是显示两种蛋白质FKBP和FRB之间的专一性相互作用的荧光显微照 片；图10是显示人干细胞中通过FKBP-FRB相互作用形成纳米组装阵列的荧光显微照 片；图11是显示其中使用雷帕霉素的竞争性化合物处理H(506的情形的荧光显微照 片；图12和图13是显示对于各种荧光蛋白的粘附的影响的观察结果的荧光显微照 片；图14是显示在细胞核中通过使用连接有NLS(核定位信号)的铁蛋白，并通过 FKBP-FRB相互作用形成纳米组装阵列的荧光纳米照片；图15是显示IkB a和RelA的测定材料以各种方式(A、B和C)彼此相互作用形成 纳米组装阵列的示意图；图16是显示如图15A的情况下，通过IkB a和RelA蛋白之间的相互作用的纳米 组装阵列形成的荧光显微照片；图17是显示如图15B的情况下，通过FRB和FKBP之间的相互作用以及使用雷帕 霉素处理的IkB a和RelA之间的相互作用的纳米组装阵列形成的荧光显微照片；图18是显示如图15B的情况下，通过FRB和FKBP之间的相互作用以及使用雷帕 霉素处理的IkBa和RelA之间的相互作用的另一种大的纳米组装阵列形成的荧光显微照 片；图19是显示各种荧光蛋白的影响的荧光显微照片；图20是显示通过使用雷帕霉素处理的FRB和FKBP之间的相互作用以及使用生理 信号TNFa处理的IkB a and bTrCP之间的相互作用的大的纳米组装阵列形成的荧光显微 照片；图21是显示根据通过TNFa的IKKb_IkB a相互作用的大纳米组装阵列形成的荧 光显微照片；图22是显示通过铁融合蛋白的RNA与调节蛋白之间的多重相互作用的大纳米组 装阵列形成的示意图；图 23 是显示通过 PAZ 与 miRNA 结合、let_7b (miRNA)与 lin28_MS2bs (mRNA)结合 以及lin28-MS2bs(mRNA)与MS2CP结合的大纳米组装阵列形成的荧光显微照片；图24和图25显示根据由雷帕霉素在96孔板中的FRB-FKBP相互作用的纳米组装 阵列的形成，使用In-Cell Analyzer 1000 (GE)高速成像的荧光显微照片；图26是显示通过使用In-Cell Developer (GE)的算法定量分析成像结果得到的 结果的示意图；图27是显示通过FKBP蛋白的专一性突变(mt)和FRB-FKBP相互作用的纳米组装 阵列的形成和对接的示意图28是显示通过FKBP蛋白的专一性突变(mt)和FRB-FKBP相互作用的纳米组装 阵列的形成和对接的荧光显微照片；
图29是显示竞争性化合物H(506对与图28的纳米组装阵列的表面对接的抑制效 果的荧光显微照片；图30和图31是显示通过FKBP (F36M)突变和DHFR蛋白-MTX化合物相互作用的 纳米组装阵列的形成和对接的荧光显微照片；图32是显示FKBP (F36M)突变蛋白的数量受到调节的情况下得到的纳米组装阵列 的荧光显微照片；图33是显示在FKBP (F36M)突变蛋白的数量受到调节的情况下得到的变化时间点 的纳米组装阵列的模式的荧光显微照片；图34是显示通过FRB-FKBP相互作用，包括使用作为FKBP相互作用媒介(调节) 化合物的AP1510处理的纳米组装阵列的形成和对接的示意图；图35和图37是显示通过FRB-FKBP相互作用，包括使用作为FKBP相互作用媒介 (调节)化合物的AP1510处理的纳米组装阵列形成和对接的荧光显微照片；图36是显示对于各种荧光蛋白的影响的观察结果的荧光显微照片。
具体实施例方式在本发明中使用的术语定义如下。在本文中，术语“生物活性化合物“指的是与生物分子包括蛋白质、核酸、多糖或脂 类，在体内结合以调节生物分子的功能或活性的化合物。所述生物活性化合物从有机体中 提取或者通过化学合成制备。各种抗生素例如在器官移植之后用于减少免疫排斥的“环孢 霉素A” (Novartis AG)和“H(506” (Fujisawa)是从微生物、植物或者海洋生物中提取的。 在检验其药物活性并使用动物模型和人类模型进行临床实验之后，这些天然或合成的生物 活性化合物被开发为新药。在本文中，术语“生物活性分子”可被定义为在有机体的生命过程中执行调节功能 例如促进或抑制有机体的功能的物质。这种生物活性分子可通过天然产物例如动物或植 物得到，或者从微生物、动物和植物细胞系的代谢产物中提取或纯化。此外，其还可以通过 化学合成得到。生物活性分子的例子可包括核酸、核苷酸、蛋白质、缩氨酸、氨基酸、多糖、脂 类、维生素和化学化合物。在本文中，术语“诱饵”指的是用于测定与其他生物活性分子相互作用的生物活性 分子。在本文中，术语“捕获物”指的是待探测(分析)或者测定的生物活性分子，其为 “诱饵”的相互作用伴侣。在本文中，术语“目标分子”指的是待测物质。根据所需用途，目标分子可以是与 诱饵相互作用的捕获物。目标分子也可以是活化、诱导、阻断或者抑制诱饵与捕获物之间的 相互作用的物质。也就是说，目标分子包括所有待识别的分子。在它们中，阻断或抑制诱饵 与捕获物之间的相互作用的分子被定义为“阻断剂分子”，活化或诱导其相互作用的分子被 定义为“活化剂分子”。在本文中，术语“纳米组装阵列”指的是可以通过分子的重复组装或相互作用很容易观察到的大的阵列。所述组装包括自组装。术语“纳米组装阵列形成物质”指的是具有 能够形成纳米组装阵列的性质和功能的所有物质。在本文中，术语“媒介(调节)物质”指的是诱导纳米组装阵列形成的物质。这意 味着包括能够通过与纳米组装阵列形成物质直接或间接结合、相互作用或融合以诱导形成 纳米组装阵列的所有物质。介导或调节媒介(调节)物质的物质还可被定义为广义上的媒 介(调节)物质。媒介(调节)分子不仅包括诱导纳米组装阵列形成的特定化合物或者蛋 白质，还包括例如特定突变等现象和特定生理信号。例如，纳米组装阵列的形成可通过来自 生理信号的蛋白质之间的相互作用、RNA和蛋白质之间的相互作用、特定蛋白质的特定突变 的使用或者仅仅与特定化合物相互作用的蛋白质的使用而被诱导，在本发明的说明书中这 些现象和信号被称为“媒介(调节)物质”。下面，将详细描述本发明。在一个方面，本发明涉及体外或体内测定特定分子“诱饵”(例如特定生物活性分 子)与待分析和测定的分子“捕获物”(例如另一种生物活性分子)之间的相互作用的方法。在第一方面中，本发明提供了测定分子相互作用的方法，包括下列步骤(i)将纳 米组装阵列形成物质、诱饵和捕获物提供到同一场合或者系统；(ii)通过诱饵与捕获物 之间的相互作用形成纳米组装阵列；以及(iii)检查纳米组装阵列是否形成，由此测定诱 饵-捕获物相互作用。优选地，每种诱饵和捕获物可以以连接标记物的状态被提供。这里， 在步骤(i)中，能够介导或调节诱饵和捕获物之间的相互作用的媒介(调节)物质可被另 外提供。媒介(调节)物质还可以以连接标记物的状态被提供。能够形成纳米阵列的物质(此后称为“纳米组装阵列形成物质”)可以以直接或间 接与其连接的任何检测物质诱饵的状态被提供，同时纳米组装阵列形成物质与待分析的另 一种测定物质捕获物结合。此外，纳米组装阵列形成物质可以以连接媒介(调节)物质的 状态被提供，同时诱饵分子和捕获物分子可以以连接媒介物质(调节物质)的状态被提供。在根据本发明的第一方面的测定分子相互作用的方法中，当纳米组装阵列形成 时，诱饵-捕获物相互作用或者诱饵_捕获物_媒介物质相互作用可被确定发生，并且当纳 米组装阵列没有形成时，可确定所述物质没有相互作用。第一种方法的示意图在图1中示出。在该方法中，检查了纳米组装阵列是否通过 诱饵_捕获物相互作用形成。例如，如果物质之间的相互作用未知的话，该方法可被用于测 定诱饵、捕获物和媒介(调节)物质之间的相互作用。这里，诱饵-捕获物相互作用可以是两种分子之间的直接作用，或者是由介导(调 节)诱饵与捕获物之间的相互作用的物质引起的间接相互作用。在后一种情况下，媒介(调 节)物质可以是两种或者两种以上的组合。在一个例子中，图4适宜性地示出了测定物质FKBP(对应于图1中的“X”)和 FRB(对应于图1中的“Y”)通过雷帕霉素(对应于图1中的“A”)彼此相互作用以形成通 过铁融合蛋白的纳米组装阵列。根据本发明的第一方面的实施例的示意图在图15中示出。也就是说，图15示意 性地示出了测定物质IkB α和RelA以各种方式彼此相互作用(A、B和C)通过铁融合蛋白 形成纳米组装阵列形成物质。
首先，图15中的“Α”示出了纳米组装阵列通过分别与铁蛋白融合的IkBa与 RelA(捕获物和诱饵)之间的直接相互作用形成的情形。同样，图15中的“B”示出了大纳 米组装阵列在细胞中通过将诱饵IkB α和媒介(调节)物质FRB蛋白与铁蛋白融合、将媒介 (调节)物质FKBP与捕获物RelA蛋白融合，然后引起媒介(调节)物质FRB和FKBP之间 的相互作用以及诱饵与捕获物分子IkB α和RelA之间的相互作用而形成的情形。图15中 的“C”示出了更大的纳米组装阵列仅仅通过将媒介(调节)物质FRB与铁蛋白融合，将媒 介物质(调节)物质FKBP与IkB α和RelA(捕获物和诱饵)的每种融合并引起媒介(调 节)物质FRB和FKBP之间的相互作用以便将FKBP与铁蛋白的FRB连接而形成的情形。图15中的“B”和“C”的情形采用了 IkBa和RelA之间的间接相互 作用，由于这 种原因，使用了媒介(调节)物质FRB和FKBP之间的相互作用。特别是，媒介(调节)物 质FRB和FKBP以及捕获物-诱饵IkBa和RelA彼此相互作用形成大纳米组装阵列。这里， 雷帕霉素作为另一种介导(调节)媒介(调节)物质FRB和FKBP之间的相互作用的物质 可另外使用。特别是，图15中的情形“C”示出了更大的纳米组装阵列可通过仅仅将媒介(调 节)物质FRB与铁蛋白连接的物质之间的多重相互作用形成。除了上述的通过测定由测定物质之间的直接或间接相互作用引起的纳米组装阵 列的形成来测定分子相互作用的方法之外，本发明提供了其他两种检测方法，如下所述。在 这两种方法中，纳米组装阵列通过媒介(调节)物质形成，然后测定能够与在形成的纳米组 装阵列上存在的诱饵相互作用的捕获物。特别是，在第二方面，本发明提供了测定分子相互作用的方法，包括下列步骤(i) 将媒介(调节)物质和结合有诱饵的纳米组装阵列提供到同一场合或系统；(ii)通过媒介 物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕获物提供给形成的纳米组装阵列；以 及(iv)通过与在形成的纳米组装阵列上存在的诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置以 便确定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定诱饵_捕获物分子相互作用(见图2的(a))。在第三方面，本发明提供了测定分子相互作用的方法，包括下列步骤(i)将结合 有第一媒介(调节)物质的纳米组装阵列形成物质和结合有第二(调节)物质的诱饵提 供到同一场合或系统；(ii)通过第一媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵 列，并通过第二媒介物质之间的相互作用将诱饵结合到形成的纳米组装阵列上；(iii)将 捕获物提供到形成的纳米组装阵列上；以及(iv)通过与结合到形成的纳米组装阵列上的 诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置以便确定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定诱 饵_捕获物相互作用(见图2的(b))。在根据第二和第三方面的每种方法的步骤(ii)中，与媒介(调节)物质相互作用 以诱导纳米组装阵列形成的另一种媒介(调节)物质可另外被提供。在步骤(iv)中，介导 或调节诱饵与捕获物之间的相互作用的物质可另外被提供。优选地，诱饵、捕获物和媒介 (调节)物质的每种可以以连接有标记物的状态被另外提供。第二和第三种方法共同地包括通过已知彼此将发生相互作用的媒介(调节)物质 之间的相互作用形成纳米组装阵列，然后测定作为能够与在形成的纳米组装阵列上存在的 诱饵相互作用的伴侣分子的捕获物。但是，本发明的第二和第三种方法的最大差别在于，在第二种方法中的通过媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列的步骤中，在纳米组装阵列通过媒介(调 节)物质的形成中，结合到纳米组装阵列形成物质上的诱饵参与了，相反，在第三种方法 中，纳米组装阵列仅仅由纳米组装阵列形成物质和媒介(调节)分子(第一种媒介(调节) 分子)形成，然后另一种媒介分子(第二种媒介(调节)分子)与得到的物质结合。这里， 介导或调节第一种媒介(调节)分子或者第二种媒介(调节)分子的物质可另外被使用。在测定分子相互作用的第二或第三种方法中，当确定捕获物与诱饵共同定位时， 可确定诱饵和捕获物彼此相互作用，而当确定捕获物没有与诱饵共同定位时，可确定捕获 物和诱饵没有彼此相互作用。本发明的第二种方法的示意图在图2中示出。将参照图2描述本发明的一个实施例。图30示意性地示出了通过下列方式得到 的实验结果将诱饵DHFR(与图2中的“X”对应)结合到纳米组装阵列形成物质，铁蛋白 (对应于图2中的“N”)上；在细胞中以单体分布的FKBP蛋白质(对应于图2中的“A”和 “B”)中制造特定突变(对应于图2中的“C”)，以便允许FKBP蛋白质彼此结合，从而诱导纳 米组装阵列的自发形成；然后允许MTX化合物(与图2中的“Y”对应)与DHFR相互作用， 使MTX化合物对接或者补充到纳米组装阵列。在第二种方法的另一种实施例中，图34示意性地示出了包括下列步骤的实验过 程将诱饵FKBP(对应于图2中的“A”、“B”和“X”)结合到纳米组装阵列形成物质，铁蛋白 (对应于图2中的“N”)上；通过媒介(调节)物质AP1510(对应于图2中的“C”)形成纳 米组装阵列；然后允许存在于纳米组装阵列上的FKBP(诱饵)与FRB(捕获物)(对应于图 2中的“Y”)相互作用，使FRB(捕获物)对接或者补充到纳米组装阵列，从而FKBP(诱饵) 和FRB (捕获物)彼此共同定位。这里，FKBP通过与AP1510化合物相互作用起到形成纳米 组装阵列的媒介(调节)物质的作用，同时起到与FRB(捕获物)相互作用的诱饵的作用。本发明的第三种方法的示意图在图2(b)中显示。参见图2(b)，本发明的第三种方法的实施例包括将第一种媒介(调节)物质 FKBP(A、B和D)结合到纳米组装阵列形成物质，铁蛋白(N)上；通过第一种媒介物质FKBP 与AP1510化合物(C)相互作用形成纳米组装阵列；允许得到的物质与结合有第二种媒介 (调节)物质FRB (E)的特定诱饵(X)相互作用；并通过调节第二种媒介(调节)物质的作 用的雷帕霉素(F)将诱饵结合到纳米组装阵列(FKBP-FRB相互作用)。而且，作为诱饵(X) 的伴侣物质的捕获物(Y)与纳米组装阵列上存在的诱饵相互作用，使其对接或者补充到纳 米组装阵列，从而使FKBP (诱饵)与FRB (捕获物)彼此共同定位。这里，第二种媒介(调节)物质还可通过与结合到纳米组装阵列形成物质上的第 一种媒介(调节)物质直接相互作用而被转移到形成的纳米组装阵列上，而不使用独立的 另外的媒介(调节)分子(例如，不使用物质F)。在上述的本发明的方法中，在本发明中使用的物质包括纳米组装阵列形成物质、 诱导纳米组装阵列形成的媒介(调节)物质、诱饵、捕获物和标记物之间的结合可包括物 理、化学、静电或者生物直接或者间接结合。在这些结合方式中，当生物结合发生时，包括抗 体、蛋白质、蛋白质域、基因序列、缩氨酸以及类似物的探针都可被使用。下面，将描述在上述的方法中使用的特定构造元件。在本文中，“纳米组装阵列形成物质”是具有多种相同或不同结合半分子并可通过它们之间的相互作用或者自组装形成阵列的物质。优选地，使用可通过自组装形成阵列的 物质。这些阵列优选由纳米粒子构成。通过自组装形成纳米组装阵列的物质的优选例子包括铁蛋白、类铁蛋白、磁小体 蛋白(magnetosome protein)或者病毒蛋白。此外，各种化学合成的纳米粒子也可形成纳 米组装阵列。例如，各种纳米粒子，包括金纳米粒子、量子点(Q dot)或者磁纳米粒子可被 使用。在本发明的一种实施例中，在可通过自组装形成纳米单元阵列的分子或蛋白质中，使 用铁蛋白。铁蛋白通过24个铁蛋白的自组装形成球形纳米粒子阵列，具有大约12nm的外径 和大约9nm的内径，并含有超过2500个铁原子(Chasteen，N. D. Struc. Biol. 126 182-194， 1999)。如果纳米组装阵列通过由铁蛋白形成的纳米微粒阵列的表面上发生的诱饵与捕获 物之间的相互作用或者媒介(调节)物质之间的相互作用形成，该相互作用可通过分析标 记物例如结合到诱饵、 捕获物或者媒介(调节)物质上的荧光、发光、磁性或者放射性物质 使用分析装置例如显微镜动态测定。图3示出了由24个铁蛋白自组装形成的具有8nm内径的纳米粒子阵列。在图3 中，绿色小珠示出了本发明的实施例中的各种待分析物质与其结合的氨基末端部分。当结 合到铁蛋白纳米阵列的表面上的物质彼此相互作用时，它们以阵列形式彼此连接以形成纳 米组装阵列，如在本发明的实施例中观察到的那样。磁小体蛋白是在在细胞中积累磁性的磁细菌的细胞器磁小体中积累的大约 100-nm的磁粒子的膜中存在的蛋白质。这种磁小体蛋白也可在本发明中使用，因为它们可 通过由它们之间的磁性自组装形成纳米粒子阵列。作为与测定物质对应的诱饵和与诱饵的伴侣对应的捕获物，任何与其彼此相互作 用的候选分子都可被使用。优选地，使用生物活性分子。生物活性分子包括所有在体内显示生理活性的物质，并且作为生物活性分子，可 在体内与生物物质相互作用以调节生物物质的功能或活性的任何分子都可被使用。生物活 性物质的优选例子包括核酸、单核苷酸/寡核苷酸/多聚核苷酸、蛋白质、单肽/寡肽/多 肽、氨基酸、单糖/寡聚糖/多糖、脂类、维生素和化学物质以及此外的构成所述分子的小分 子。诱饵与捕获物之间的相互作用的特定例子可包括作为雷帕霉素化合物的药物学 相关的结合伴侣的FRB与FKBP之间的相互作用，Π(506化合物与作为其药物学相关伴侣的 FKBP蛋白质之间的相互作用，ΑΡ1510化合物与FKBP蛋白质之间的相互作用，IkBa蛋白 质与作为其结合伴侣的RelA之间的相互作用，根据TNFa的生理信号而被调节的IkBa蛋 白质与作为IkB α蛋白质的结合伴侣的bTrCP或者IKKb蛋白质之间的相互作用，miRNA与 mRNA的细胞内相互作用(与lin-28 mRNA结合的let_7b miRNA)，Ago2蛋白质与miRNA的 相互作用，MS2蛋白质与MS2-结合mRNA位点的相互作用，DHFR蛋白质与MTX化合物的细胞 内相互作用，等等。调节诱饵_捕获物相互作用的媒介(调节)物质是活化诱饵_捕获物相互作用以 介导(调节)诱饵与捕获物之间的结合的物质，并且作为媒介(调节)物质，任何生物活性 分子或者化合物都可被使用而没有限制，只要它们显示了上面的功能。但是，与诱饵_捕获 物对专一性相互作用的分子优选被使用。由于纳米组装阵列通过诱饵与捕获物之间的相互作用形成，介导诱饵-捕获物相互作用的物质被认为属于诱导如在本发明中定义的纳米组装阵列形成的物质的媒介(调节)物质的范围。为了介导(调节)捕获物_诱饵相互作用，受到外部信号调节的蛋白质可被使用。 作为替代，专一性结合目标mRNA的miRNA的性质也可被使用。在一个实施例中，图22示意 性地示出了大纳米组装阵列通过RNA与调节蛋白之间的相互作用由铁融合蛋白形成。具体 地说，根据外部信号被调节的蛋白质的使用使其能够分析在细胞中由生理信号发生的非常 灵敏的测定物质之间的相互作用。在本发明的一个实施例中，当使用FKBP-FRB对时，雷帕霉素被用作媒介(调节) 物质，当使用IkB α -bTrCP对和IkB α -IKKb对时，根据外来信号受到调节的TNFa被用作媒 介(调节)物质。另外，当使用 PAZ-MS2CP 对时，let-7b (miRNA)与 lin28_MS2bs (mRNA)之 间的结合被用作媒介(调节)物质。在本发明中诱导纳米组装阵列形成的媒介(调节)物质意味着包括可直接或间接 在纳米组装阵列形成物质的表面上彼此相互作用以形成纳米组装阵列的所有物质。介导或 者调节媒介(调节)物质活性的这些物质也可被认为是广义上的媒介(调节)物质。如上 所述(第一种方法)，当纳米组装阵列受到诱饵_捕获物相互作用诱导时，调节或者介导诱 饵-捕获物相互作用的物质也可包括在广义上的媒介(调节)物质范围内。作为这种媒介(调节)物质，任何物质都可被使用而没有限制，只要它们显示了诱 导纳米组装阵列形成的功能。因此，可通过特定现象例如彼此专一性相互作用的物质之间 的结合或者突变诱导纳米组装阵列形成的所有物质和现象都可被理解为媒介(调节)物 质。也就是说，这里使用的术语“媒介(调节)物质”意味着包括所有特定物质、特定现象 或者特定相互作用。所述媒介(调节)物质可以两种或多种组合使用。如果使用诱饵-捕获物对对捕获物进行检测，同时使用诱饵的性质形成纳米组装 阵列，则认为所使用的诱饵是诱导纳米组装整列形成的媒介(调节)物质，同时其显示了用 于测定与伴侣捕获物的相互作用的诱饵功能。在一个实施例中，FKBP蛋白质通过特定突变彼此结合诱导了纳米组装阵列的形 成，然后FRB蛋白质通过FKBP蛋白质与伴侣蛋白FRB之间的相互作用，通过雷帕霉素被对 接或者补充到纳米组装阵列中(图27)。在这种情况下，FKBP蛋白质显示了通过突变形成 纳米组装阵列的功能(起到媒介(调节)物质的作用)，并且同时显示了与FRB蛋白相互作 用的功能(起到诱饵的作用)。另外，介导(调节)FRB-FKBP相互作用的雷帕霉素还与另一 种媒介(调节)物质对应[实施例6-⑴]。在另一实施例中，通过将FKBP蛋白质与铁蛋白连接并使用AP1510 (介导(调节) FKBP相互作用的化合物)处理该蛋白质诱导纳米组装阵列的形成，然后将作为FKBP的伴侣 物质的FRB蛋白质结合并对接或者补充到通过经雷帕霉素的FKBP与FRB相互作用的纳米 组装阵列的表面上。在这种情况下，FKBP蛋白质同时显示了由AP1510(起到媒介(调节) 物质的作用)形成纳米组装阵列的功能和与FRB蛋白质(起到诱饵的作用)相互作用的功 能。同样地，介导(调节)FRB-FKBP相互作用的雷帕霉素也与另一种媒介(调节)物质对 应[实施例7]。同时，在本发明的方法中，优选地是使用标记物来检查捕获物_诱饵相互作用。特 别是，诱饵、捕获物和/或媒介(调节)物质更优选结合有标记物的状态被使用。
可通过使用标记物测定待测捕获物与诱饵是否彼此共同定位在通过专一性物质 之间的相互作用形成的纳米组装阵列上来动态测定诱饵与捕获物之间的相互作用。作为本发明的标记物，放射性标记、荧光物质或者发光物质可被使用。作为放射 性标记，所有通常可使用的标记物，例如32P，35S, 3H和4C都可被使用。自身显示荧光或者通 过分子相互作用显示荧光的荧光物质的例子可包括荧光染料，例如FITC和罗丹明；荧光 蛋白，例如 ECFP、TagCFP, mTFPl、GFP、YFP、CFP 和 RFP ；四-半胱氨酸基序(tetracystein motifs)；和荧光纳米粒子。作为发光物质，自身发出光或者通过分子间相互作用发出光的 发光物质可被使用。例如，荧光素酶可被用作发光物质。在本发明中，标记物的位置和运动的变化通常可使用广泛已知的方法测定，例如 光学仪器，包括显微镜、扫描仪、放射性标记物检测装置，荧光偏振阅读仪(FP阅读仪)，分 光光度计，MRI (核磁共振成像)、SQUID,荧光探测仪，发光探测仪等等。在根据本发明的第一方面的方法中，分子相互作用通过诱饵-捕获物相互作用的 纳米组装阵列的形成来测定。这里，纳米组装阵列还可通过结合到纳米组装阵列形成物质 上的诱饵与捕获物之间的直接结合形成，但是诱饵和捕获物也可通过分别与诱饵和捕获物 的相互作用的另一种媒介(调节)物质彼此间接结合(图1)。也就是说，在第一种方法中， 纳米组装阵列是否形成通过诱饵-捕获物相互作用来测定。在根据本发明的第二和第三方面的方法中，通过纳米组装阵列形成物质的纳米组 装阵列的形成使用媒介(调节)物质(诱导纳米组装阵列形成的物质)来进行。这里，纳 米组装阵列形成物质可以以结合到媒介(调节)物质和诱饵的状态提供(第二种方法)，也 可以以只结合到媒介(调节)物质的状态提供(第三种方法)。在后一种情况下，诱饵被单 独提供而不与纳米组装阵列形成物质结合，但优选以能够使其被转移到形成纳米组装阵列 表面上的媒介(调节)物质融合的状态提供。在本发明中，为了便于描述，在纳米组装阵列 形成中涉及的媒介(调节)物质被称为第一媒介(调节)物质，而使诱饵能够被转移的媒 介(调节)物质被称为第二媒介(调节)物质。根据本发明的第二和第三种方法，纳米组装阵列由媒介(调节)物质形成，并且诱 饵直接与纳米组装阵列结合或者存在于由媒介(调节)物质形成的纳米组装阵列的一部分 上。因此，当存在于形成的纳米组装阵列上的诱饵与伴侣捕获物相互作用时，捕获物 和诱饵都彼此共同定位，并且当诱饵不与捕获物相互作用时，它们不共同定位。换言之，在 本发明的第二和第三方面，捕获物不直接在纳米组装阵列的形成中涉及，并且通过对接或 补充到形成的纳米组装阵列的捕获物位置的测定被认为是测定分子相互作用的标准。捕获 物的对接或者补充通过与形成的纳米组装阵列上存在的诱饵相互作用来实现。“捕获物和诱饵在纳米组装阵列上的共同定位”不意味着诱饵和捕获物彼此结合以便形成纳米组装阵列的状态，但是意味着定位在与形成纳米组装阵列的结合半分子不同 的独立位置处的诱饵以及作为第二种构造被引入的捕获物通过相互作用彼此结合的状态， 因此共同定位在相同纳米组装阵列上。因此，在第二和第三种方法中，纳米组装阵列的形成通过媒介(调节)物质诱导，并且诱饵与捕获物之间的相互作用决定了捕获物与纳米组装阵列的诱饵共同定位。因此， 在纳米组装阵列形成过程中，如果捕获物不能与诱饵相互作用，捕获物被保持在其他位置，例如同源状态。在本发明的第一、第二和第三种方法中，统计结果可在诱饵-捕获物相互作用或 者其他媒介(调节)物质相互作用完成之后得到，并且通过媒介(调节)物质形成纳米组 装阵列的过程甚至在相互作用完成之前就可动态观察。特别是，在第二和第三种方法中，共 同定位的动态分析是可能的。这种动态分析方法的优点在于信噪比可被增加。本发明的方法可在体外或体内进行。如果本发明的方法在体内进行，其可在如下 场所进行在原核细胞和真核细胞中；在哺乳动物的器官、组织或细胞中；以及在植物的器 官、组织或细胞中。特别是，本发明的方法可在斑马鱼、线虫、酵母、苍蝇或者青蛙的器官、组 织或细胞中进行。在本发明中使用的纳米组装阵列形成物质、诱饵、捕获物、媒介(调节)物质(诱 导纳米组装阵列形成的物质)和标记物可通过通常广泛已知的方法被引入到细胞中。例 如，它们可通过使用跨膜肽(transducible ρ印tide)(或者融合肽)、脂类(或者脂质体) 基因转运体或者其复合物、或者通过将它们与细胞在OPTI-MEM中一起培养；或者通过电转 化或磁转染被引入到细胞中。特别是，当本发明的方法在体内进行时，其可在活细胞内在培 养板/盘上或者在微阵列化的活细胞内进行。为了使用所述方法测定专一性捕获物与专一性诱饵的相互作用，捕获物作为文库 被提供。特别是，根据本发明的第一种方法，提供了用于测定与诱饵相互作用的捕获物的 方法，所述方法包括下列步骤(i)将纳米组装阵列形成物质、诱饵和捕获物文库提供到 同一场合或者系统；(ii)通过诱饵文库与捕获物文库之间的相互作用形成纳米组装阵列； (iii)检查纳米组装阵列是否形成，由此测定诱饵-捕获物相互作用；以及(iv)选择、分离 和识别与诱饵相互作用形成纳米组装阵列的目标捕获物。根据本发明的第二种方法，提供了测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，该 方法包括下列步骤(i)将媒介(调节)物质和结合有诱饵的纳米组装阵列提供到同一场 合或系统；(ii)通过媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕获物 文库提供给形成的纳米组装阵列；(iv)通过与在形成的纳米组装阵列上存在的诱饵的相 互作用测定捕获物的结合位置以便测定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定诱饵-捕获 物相互作用；以及(ν)选择、分离和识别与诱饵相互作用以便与纳米组装阵列上的诱饵共 同定位的目标捕获物。根据本发明的在第三方面，提供了测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，该 方法包括下列步骤(i)将结合有第一媒介(调节)物质的纳米组装阵列形成物质和结合 有第二(调节)物质的诱饵提供到同一场合或系统；(ii)通过第一媒介(调节)物质之间 的相互作用形成纳米组装阵列，并通过第二媒介物质之间的相互作用将诱饵结合到形成的 纳米组装阵列上；(iii)将捕获物文库提供到形成的纳米组装阵列上；(iv)通过与结合到 形成的纳米组装阵列上的诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置以便确定捕获物是否与 诱饵共同定位，由此测定诱饵-捕获物相互作用；以及(ν)选择、分离和识别与诱饵相互作 用以便与纳米组装阵列上的诱饵共同定位的目标捕获物。每种方法的详细描述与上面描述的相同。使用上述方法，与诱饵相互作用以便共 同定位在纳米组装阵列上的捕获物可作为目标分子被选择、分离和识别。
而且，本发明提供了测定诱饵与捕获物之间的相互作用并分析和测定影响该相互 作用的第三种分子目标分子的方法。特别是，根据本发明的第一种方法，提供了用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相互作用的目标分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)将媒介(调 节)物质和结合有诱饵的纳米组装阵列形成物质提供到同一场合或者系统；(ii)在目标候 选物的存在下通过媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕获物 提供到形成的纳米组装阵列；以及(iv)选择与在目标候选物不存在下诱饵与捕获物共同 定位的程度相比，目标候选物存在下诱饵与捕获物共同定位的程度被阻断(抑制)或者活 化(诱导)的情况对应的目标候选物作为目标阻断剂分子或者目标活化剂分子。根据本发明的第二种方法，提供了用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕 获物之间的相互作用的目标分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)将媒介(调节)物质 和诱饵结合到纳米组装阵列形成物质并将这些物质提供到同一场合或者系统；(ii)在目 标候选物的存在下通过媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕 获物提供到形成的纳米组装阵列；以及(iv)选择与在目标候选物不存在下诱饵与捕获物 共同定位的程度相比，在目标候选物存在下诱饵与捕获物共同定位的程度被阻断(抑制) 或者活化(诱导)的情况对应的目标候选物作为目标阻断剂分子或者目标活化剂分子。根据本发明的第三种方法，提供了用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与 捕获物之间的相互作用的目标分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)将结合有第一媒 介(调节)物质的纳米组装阵列形成物质和结合有第二媒介(调节)物质的诱饵提供到同 一场合或者系统；(ii)在目标候选物的存在下通过第一媒介(调节)物质之间的相互作用 形成纳米组装阵列，并通过第二媒介(调节)物质之间的相互作用将诱饵结合到形成的纳 米组装阵列；(iii)将捕获物提供到形成的纳米组装阵列；以及(iv)选择与在目标候选物 不存在下诱饵与捕获物共同定位的程度相比，在目标候选物存在下诱饵与捕获物共同定位 的程度被阻断(抑制)或者活化(诱导)的情况对应的目标候选物作为目标阻断剂分子或 者目标活化剂分子。每种方法的详细描述与上面描述的相同。使用上述方法，影响诱饵与捕获物之间 的相互作用，即阻断(抑制)或者活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相互作用的目标候选 物可被测定。
实施例此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解，这些实施例仅仅用 于说明的目的，而不解释为限制本发明的范围。实施例1 通过化合物(雷帕霉素)与蛋白质(FKBP和FRB)之间的相互作用形成 纳米组装阵列铁蛋白基因FTH1(基因库BC013724)和FTL (基因库BC016346)购自美国Open BioSystems 公司。在本发明中，将各种蛋白与铁蛋白的末端连接并在分析中使用。WpcDNA 3.1为 基础的重组基因被制备，其可在哺乳动物细胞中通过CMV启动子通过将各种检测蛋白(例 如Π(ΒΡ和FRB)和荧光蛋白(例如mRFP、EGFP, ECFP和YFP)与铁蛋白(FT)的氨基末端连接表达各种融合蛋白。使用电转化(1000V，35ms, 2 脉冲)将重组基因 H(BP-mRFP-FT 和 FRB-mRFP-FT 单独或者共同引入到事先培养的Hela细胞(ATCC No. CCL-2)中。然后，将细胞在16孔室载 玻片(Nunc)中涂平板并在5% CO2培养箱中37°C下培养24小时以表达融合蛋白。为了便 于成像，将含有10% FBS的DMEM(Gibco)替换成OPTI-MEM(Gibco)，然后使用250nM(原液 浓度lmM原液；溶解在DMSO中)的雷帕霉素(Calbiochem)处理细胞，并使用荧光显微镜 (Olympus, 1X51)观察细胞中铁融合蛋白的分布(图5)。图4示意性地示出了通过媒介物质雷帕霉素测定通过分子FKBP与FRB之间间接 相互作用而形成纳米组装阵列的这种实施例，并且该实施例的结果在图5中示出。作为阴性对照组，使用仅仅表达重组基因FKBP-mRFP-FT和FRB-mRFP_FT中的一种 的细胞。在这些细胞中，使用和不使用雷帕霉素处理细胞的所有情况下都不形成纳米组装 阵列。但是，在在细胞中表达蛋白质FKBP-mRFP-FT和FRB_mRFP-FT的情况下，仅仅当使用 雷帕霉素处理细胞的情况下，在细胞中形成纳米组装阵列。也就是说，与铁蛋白结合的检测分子FKBP和FRB通过与它们相互作用的媒介(调 节)物质雷帕霉素交联，由此在细胞中形成纳米组装阵列。(1)纳米组装阵列随着经过时间的形成FKBP、雷帕霉素和FRB之间的相互作用被实时观察以便观察铁蛋白纳米组装阵列 的形成模式。将重组基因FKBP-EGFP-FT和FRB_mRFP-FT —起引入到培养的Hela细胞中，然后 在细胞中表达铁融合蛋白。然后，将细胞使用250nM雷帕霉素处理，并且使用荧光显微镜在 10分钟内以2分钟为间隔分析铁融合蛋白在细胞中的分布。结果，如同从图6中看到的那样，在FKBP-EGFP-FT和FRB_mRFP-FT蛋白质在细胞 中一起表达的情况下，这些蛋白质通过使用雷帕霉素的处理迅速彼此相互作用，并且纳米 组装阵列在细胞中在10分钟内形成。(2)无荧光蛋白的纳米组装阵列的形成为了支持铁蛋白的纳米组装阵列依赖于雷帕霉素处理而产生的事实，通过从图6 的对中交换荧光蛋白制备的重组基因FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT被引入到培养的Hela 细胞中，然后在细胞中表达铁融合蛋白。然后，使用荧光显微镜观察使用250nM雷帕霉素处 理的细胞和没有使用雷帕霉素处理的细胞10分钟。结果，如图7中所示，在FKBP-EGFP-FT和FRB_mRFP-FT蛋白质在细胞中一起表达 的情况下，仅仅当使用雷帕霉素处理的情况下，这些蛋白质迅速彼此相互作用以形成纳米 组装阵列。(3)通过专一性相互作用形成纳米组装阵列为了显示铁蛋白的纳米组装阵列由FKBP、雷帕霉素和FRB之间的专一性相互作用 形成的事实，将铁融合蛋白作为通过除去FRB制备的FKBP-EGFP-FT与mRFP-FT的组合在 Hela细胞中表达。然后，使用250nM雷帕霉素对细胞进行处理。结果，如图8所示，与图6和7的结果不同，仅仅FKBP作为铁融合蛋白被表达，因 此FKBP与FRB之间通过雷帕霉素的专一性结合没有出现，表明在细胞中没有形成纳米组装 阵列。
而且，根据上面的方法，作为通过除去HiBP制备的由FRB-mRFP-FT与EGFP-FT组合的铁融合蛋白在Hela细胞中被表达，并且细胞使用雷帕霉素进行处理。结果，如图9所 示，仅仅FRB被表达为铁融合蛋白，因此在细胞中没有形成纳米组装阵列。这种结果表明，铁蛋白的高组装阵列由于雷帕霉素通过FKBP和FRB之间的专一性 相互作用而形成。(4)在干细胞中纳米组装阵列的形成将重组基因FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT —起引入到来自人骨髓的人间叶细胞 干细胞中，然后在细胞中表达铁融合蛋白。然后，使用250nM雷帕霉素(Calbiochem)对细 胞进行处理，并使用荧光显微镜分析铁融合蛋白在细胞中的分布。结果，如图10所示，在FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT蛋白质在细胞中一起表达的 情况下，FKBP和FRB在干细胞中彼此相互作用以形成纳米组装阵列。测试实施例1-1 纳米组装阵列的形成是否依赖于媒介(调节)物质如图11所示，为了验证雷帕霉素介导的纳米组装阵列的专一性，将仅仅与FKBP蛋 白质专一性结合并且不与FRB蛋白质结合的Π(506用作雷帕霉素的竞争性化合物，并且使 用该竞争性化合物处理细胞。特别是，将细胞使用25 μ M FK506处理10分钟，然后将250ηΜ雷帕霉素加入到细 胞中。在这种情况下，由于Π(506干扰了雷帕霉素与FKBP之间的结合，与图6和7的结果 不同，不能观察到由于雷帕霉素通过FKBP与FRB之间相互作用形成的纳米组装阵列。测试实施例1-2 纳米组装阵列的形成是否依赖于荧光物质除 H(BP-mRFP-FT 与 FRB-mRFT-F 组合(图 5)或者 H(BP-mRFP-FT 与 FRB-EGFP-FT 组合(图6和7)以外，在FKBP-EGFP-FT与FRB-ECFP-FT的组合以及FKBP-YFP-FT与 FRB-mRFP-FT的组合中，当使用250nM雷帕霉素处理细胞时，FKBP和FRB蛋白质在10分钟 内有效地彼此专一性相互作用形成纳米组装阵列。也就是说，发现由于雷帕霉素通过FKBP与FRB蛋白之间相互作用形成的纳米组装 阵列不受影响，甚至当其他各种荧光蛋白与铁蛋白连接时也是如此(图12和图13)。测试实施例1-3 纳米组装阵列的形成是否依赖于位置由于铁蛋白是定位在细胞质中的蛋白质，FKBP与FRB蛋白质之间通过雷帕霉素的 相互作用主要在细胞质中被观察。为了检查是否可通过铁蛋白的纳米组装阵列形成看到在细胞中的各种细胞器中 分子的相互作用，将NLS(核定位信号)与铁蛋白连接，使铁融合蛋白可被移位到核中。在 这种状态下，使用250nM雷帕霉素对细胞进行处理。结果，观察到纳米组装阵列可在核中通 过FKBP与FRB蛋白之间的相互作用形成，但形成的效率低于在细胞质中形成的情况下(图 14)。实施例2 通过蛋白质之间的相互作用形成纳米组装阵列以如图15所示的各种方式(A、B和C)检查了纳米组装阵列是否通过测定分子 IkBa与RelA之间的相互作用形成。(1)图15中的“A”方法当将IkB α和RelA与铁蛋白直接融合时，进行检测以便检查纳米组装阵列在细胞 中通过IkB α和RelA在细胞中的表达自发形成。
将重组基因IkBa -YFP-FT (pcDNA 3. 1)和 RelA-mRFP-FT (pcDNA 3. 1)引入到在实 施例1中培养的Hela细胞中，然后在细胞中表达铁融合蛋白。结果，如图16所示，纳米组 装阵列在细胞中通过IkB α与RelA蛋白质之间的相互作用形成。(2)图15中的“B”方法将IkBa和FRB蛋白质分别与铁蛋白融合，并将RelA蛋白质与FKBP融合。使用 250nM雷帕霉素对融合蛋白进行处理。也就是说，对于媒介(调节)物质(FRB-FKBP)，将雷 帕霉素用作调节媒介(调节)物质之间的相互作用的另一种媒介(调节)物质。将重组基因FRB-ECFP-FT、FKBP-mRFP-RelA 和 IkB a -YFP-FT 一起引入到 Hela 细 胞中，然后在细胞中表达铁融合蛋白。结果，如图17所示，观察到当使用雷帕霉素对细胞进 行处理时，FRB和FKBP蛋白质作为媒介(调节)物质彼此相互作用，同时IkB α和ReIA蛋 白质作为捕获物和诱饵彼此相互作用，由此在细胞中形成大的纳米组装阵列。(3)图15中的“C”方法将FKBP蛋白与IkB α和RelA融合，并仅仅FRB与铁蛋白融合。进行检测以观察 IkB α和RelA中的FKBP蛋白是否可通过雷帕霉素与铁蛋白的FRB连接形成纳米组装阵列。将重组基因FRB-ECFP-FT、FKBP-mRFP-RelA 和 IkB α -YFP-FKBP 一同弓丨入到 Hela 细胞中，然后在细胞中表达每种融合蛋白。结果，如图18所示，观察到当使用雷帕霉素对细 胞进行处理时，FRB和FKBP蛋白质作为媒介(调节)物质彼此相互作用，同时IkB α和ReIA 蛋白质彼此相互作用，由此在细胞中形成大纳米组装阵列。也就是说，发现当仅仅将媒介(调节)物质FRB与铁蛋白连接时，更大的纳米组装 阵列可通过检测分子之间的多重相互作用形成，这与实验(2)中的结果不同。通过这些结果可以看出，纳米组装阵列在细胞通过检测分子例如lego之间的相 互作用以各种适应性(flexibilities)形成，因此可以各种适应性分析检测分子之间的相
互作用。(4)荧光蛋白的不同组合以与实验(3)中相同的方式进行检测，但如图19所示，将与实验(3)中不同的荧 光蛋白组合与IkBa、RelA和铁蛋白融合。将重组基因FRB-mRFP-FT、FKBP-YFP-RelA 和 IkB α -ECFP-FKBP —同弓丨入到 Hela 细胞中，然后在细胞中表达铁融合蛋白。当使用雷帕霉素对细胞进行处理时，FRB和FKBP蛋 白质彼此相互作用，同时IkB α和RelA蛋白质彼此相互作用，由此在细胞中形成大纳米组 装阵列。结果，如图19所示，即便当各种荧光蛋白的组合与每种蛋白质连接时，通过IkBa 与RelA蛋白质之间的相互作用形成的纳米组装阵列也没有受到影响。实施例3 通过生理信号由蛋白质之间的相互作用形成纳米组装阵列进行测试检查根据外部信号受到调节的蛋白质之间的相互作用是否可被分析。外 部信号作为介导(调节)捕获物与诱饵之间的相互作用的物质而被使用。将重组基因FRB-ECFP-FT、H(BP-mRFP-bTrCP 和 IkB α -YFP-FKBP 一同引入到 Hela 细胞中，然后在细胞中表达每种融合蛋白。虽然在实施例2中使用的IkBa总是与RelA蛋 白相互作用，而不管是否有细胞外的刺激，仅仅当将外来生理信号TNFa传递到细胞时其与 bTrCP蛋白质相互作用。由于这种原因，使用TNFa对细胞进行处理。
结果，如图20所示，通过IkBa与bTrCP蛋白质之间的彼此相互作用，以及FRB和 FKBP蛋白质作为媒介(调节)物质通过使用另一种媒介(调节)物质雷帕霉素处理彼此相 互作用，由此在细胞中形成铁蛋白的纳米组装阵列。在另一个实施例中，IKKb-IkB α蛋白质被用作捕获物-诱饵，并且TNFa被用作用 于介导(调节)它们之间的相互作用的物质。仅仅当将外来生理信号TNFa传递到细胞时， IkB α和IKKb蛋白质彼此相互作用。已知磷酸化酶(例如IKKb)与作为其底物的IkB α之间 的相互作用是细胞中最微弱的相互作用的一种。将重组基因FRB-ECFP-FT、IKKb-HiRFP-FKBP 和IkBa-YFP-FKBP—同引入到Hela细胞中，然后在细胞中表达每种融合蛋白。结果，如图 21所示，在细胞中使用TNFa处理通过IkB α与IKKb之间的相互作用形成大的纳米组装阵 列。通过上述结果发现，在细胞中由生理信号出现的非常灵敏的检测分子之间的相互 作用可通过纳米组装阵列分析。实施例4 通过RNA与蛋白质之间的相互作用的纳米组装阵列的形成如图22所示，设计了实验使纳米组装阵列通过RNA与调节蛋白之间的相互作用形 成。在实验中使用的蛋白质Ago2是与miRNA相互作用的调节蛋白，并由多个功能域构 成。在这些功能域中，PAZ功能域在与miRNA相互作用中是重要的。具有该功能域的铁融 合蛋白可与miRNA相互作用，并且miRNA专一性地结合目标mRNA。该实验被设计成当MS2 结合序列与目标mRNA的末端连接时，其与铁融合蛋白包括MS2蛋白相互作用，也就是说， miRNA与目标mRNA结合，由此形成大纳米组装阵列。首先，基于与miRNA相互作用的Ago2的PAZ功能域和PiWi功能域，全长突变、 PAZ-Piffi功能域缺失突变、PiWi功能域缺失突变和PAZ功能域缺失突变被构造。然后，MS2 蛋白通过其能够结合的MS2结合序列(5' -AAA CAT GAG GAT CAC CCA TGT-3' :SEQ ID NO 1)可被连接到作为目标mRNA的lin28_MS2bs的末端，由此构造了 MS2CP-mRFP_FT。通过电转化将PAZ-CFP-FT、lin28-MS2bs (mRNA)和 MS2CP-mRFP_FT 引入 Hela 细胞 中，然后在细胞中表达16小时。然后，将let7b miRNA表达载体另外引入到细胞中，20小时 后，观察细胞。结果，如图23所示，大的纳米组装阵列通过PAZ-CFP-FT融合蛋白与miRNA之间 的结合、let-7b (miRNA)与 lin28_MS2bs (mRNA)之间的结合以及 lin28_MS2bs (mRNA)与 MS2CP-mRFP-FT(铁融合蛋白)之间的结合而形成。实施例5 纳米组装阵列形成的高通筛选为了检测和筛选各种生物活性分子之间的相互作用，使用HTS (高通量筛选)系统 (图 24)。为了建立该系统，将Hela细胞在96-孔板(Greiner bio-one)中培养，然后将 FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT基因同时引入到细胞中并在其中表达。24小时之后，在96 个孔中仅仅选择12个孔并使用250nM雷帕霉素处理30分钟，并且通过由于雷帕霉素的FRB 与FKBP之间的相互作用的纳米组装阵列的形成使用In-Cell Analyzer 1000 (GE)高速成像。在96孔板中通过由于雷帕霉素的FRB与FKBP之间的相互作用的纳米组装阵列形成使用In-Cell Analyzer 1000 (GE)检查(图25)。在孔中使用250nM雷帕霉素处理30分 钟，在细胞质中与铁蛋白融合的FKBP和FRB蛋白彼此相互作用形成纳米组装阵列，相反，在 不使用雷帕霉素处理的孔中，铁蛋白纳米组装阵列甚至在30分钟后都没有形成，并且蛋白 质均勻分布在细胞质中。 使用3. 5%多聚甲醛固定细胞，将细胞核使用Hoechst染色，然后对在96孔板中得 到的纳米组装阵列的形成进行系统分析。使用In-Cell Developer(GE)算法，通过由于雷 帕霉素的FRB与FKBP之间相互作用的纳米组装阵列的形成作为颗粒被识别，并且成像结果 被有效并定量地分析和筛选。在96孔板的每个孔中筛选和定量可使用其中具有形成的纳 米组装阵列的细胞的百分比(％ )或者每个细胞中纳米组装阵列的数目而有效地进行(图 26)。实施例6 使用专一性突变作为媒介(调节)物质形成的纳米组装阵列上的检测 分子的相互作用的检查(1)通过突变的FKBP和FKB之间的相互作用的纳米组装阵列的形成将FKBP蛋白质突变，使纳米组装阵列的形成通过蛋白质之间的结合自发诱导。将FKBP的第36位氨基酸苯丙氨酸替换成甲硫氨酸，使单体FKBP转变成二聚体形 式。将所述突变FKBP与铁蛋白融合，并将FKBP (F36M) -mRFP-FT和FRB-EGFP融合蛋白在 Hela细胞中表达以便检查细胞中纳米组装阵列的自发形成(图28)。而且，使用250nM雷 帕霉素处理形成的纳米组装阵列。从结果可以看到，纳米组装阵列表面上的FKBP (F36M)与FRB被诱导，并且 FRB-EGFP在10分钟内迅速被结合并对接或者补充到纳米组装阵列的表面上(图28)。也 就是说，FKBP通过突变起到媒介(调节)物质的作用，同时起到与FRB(捕获物)相互作用 的诱饵的作用。另外，为了检查检测分子(FKBP(F36M)_FRB)之间的相互作用是否对作为调节相 互作用的雷帕霉素专一，将25 μ M Π(506用作用于FKBP(F36M)与雷帕霉素之间的相互作用 的竞争性化合物。结果，如图29所示，FRB-EGFP从纳米组装阵列的表面上被拆下。这表明 FKBP (F36M)和FRB的对接过程可被可逆地调节。另外，证实检测分子FKBP-FRB之间的相互 作用通过媒介(调节)物质雷帕霉素专一性地出现。(2) DFX-DHFR相互作用的检测以与实验(1)相同的方式,将重组基因FKBP(F36M)-mRFP-FT和DHFR-mRFT_FT — 起引入到Hela细胞中，然后在细胞中表达铁融合蛋白。然后，使用ΙΟμΜ MTX-BODIPYiFL 处理细胞。特别是，纳米组装阵列的形成通过FKBP (F36M)突变蛋白被诱导，并且将DHFR蛋 白(诱饵)与铁融合蛋白连接，使其被暴露到纳米组装阵列的表面，然后在细胞中表达DHFR 蛋白。铁融合蛋白在细胞中的分布使用荧光显微镜进行分析(图30)。在上述状态下，使用附着有BODIPY染色的MTX化合物(诱饵)对细胞进行处理， 然后在各个变化的时间点对MTX是否与DHFR结合进行分析。结果，如图30所示，观察到在不具有DHFR的纳米组装阵列的情况下，MTX不对接 或者补充到纳米组装阵列上，相反，在其表面上具有DHFR的纳米组装阵列的情况下，MTX化 合物在使用MTX化合物进行处理之后大约1小时结合并对接到纳米组装阵列上。
图31是显示在使用MTX化合物处理之后150分钟时的照片，MTX化合物在细胞中结合并对接到具有DHFR的纳米组装阵列的表面上。测试实施例6-1 依赖于所连接的FKBP (F36M)突变蛋白质数目被诱导而形成的纳 米组装阵列为了优化通过FKBP (F36M)突变-铁融合蛋白的纳米组装阵列形成的诱导，将连接 的FKBP (F36M)突变蛋白质的数目连续增加到6，同时观察其表达结果。结果，如图32所示，当连接的突变蛋白质数目超过2时，在细胞中蛋白质表达后从 12小时开始纳米组装阵列有效形成。但是，当连接的突变蛋白质数目超过4时，突变蛋白的 细胞内表达明显减少。测试实施例6-2 依赖于连接的FKBP(F36M)突变蛋白质数目和时间被诱导形成的 纳米组装阵列以与测试实施例6-1中相同的方式，将FKBP (F36M)突变蛋白质的数目从1增加到 3，同时将突变蛋白质与铁蛋白融合以诱导纳米组装阵列自发形成。在各个变化的时间点观 察形成的模式。结果，如图33所示，当FKBP(F36M)突变蛋白质的数目为1时，在蛋白质引入Hela 细胞之后36小时纳米组装阵列开始形成，相反，当突变蛋白质的数目为2或3时，纳米组装 阵列在将蛋白质引入到细胞中之后12小时内有效形成。 通过上述测试结果，通过FKBP (F36M)突变-铁融合蛋白的纳米组装阵列形成的诱 导优化条件可被预见。实施例7 其形成使用专一性化合物与作为媒介(调节)物质的蛋白质之间的相 互作用被诱导的纳米组装阵列上的检测分子的检查在该实验中，将FKBP (野生型)蛋白质用作用于诱导纳米组装阵列形成的物质，同 时将AP1510化合物用作用于介导FKBP蛋白质之间结合的物质。AP1510化合物为Π(506_状 化合物并且是媒介(调节)物质，其具有能够与FKBP蛋白质结合并通过连接物彼此连接的 两种基序，使其可同时与FKBP蛋白质的两个分子相互作用。将两种FKBP(野生型)蛋白质连续与铁蛋白融合并在Hela细胞中表达。将细胞 使用作为FKBP相互作用媒介(调节)物质的1 μ M ΑΡ1510化合物处理，并且通过In-Cell Analyzer 1000 (GE)在1小时内观察纳米组装阵列的形成(图35)。在纳米组装阵列形成 被诱导3小时之后，将细胞使用250nM雷帕霉素处理1小时。结果看到，FRB蛋白质(捕获物)与FKBP相互作用，使其被结合并对接或者补充 到纳米组装阵列的表面上(图35和37)。这里，FKBP起到通过与AP1510化合物相互作用起到形成纳米组装阵列的媒介(调 节)物质的作用，同时起到与FRB(捕获物)相互作用的诱饵作用。测试实施例7-1 不受连接的荧光蛋白质种类影响的纳米组装阵列对于在实施例7中mRFP与FKBP蛋白质连接的情况来说，各种荧光蛋白质，例如 ECFP、TagCFP和mTFPl与FKBP蛋白质连接以检查AP1510对纳米组装阵列形成诱导的效果。将FKBP与铁蛋白融合，并将三种不同荧光蛋白质连接在FKBP与铁蛋白之间，然后 在Hela细胞中表达。表达24小时之后，将每个细胞使用1 μ ΜΑΡ1510化合物进行处理。结果，如图36所示，在TagCFP-mTFPl和mTFPl的情况下纳米组装阵列的形成比通过AP1510化合物的ECFP情况下更有效地被诱导。此外，如图37所示，观察到在TagCFP的情况下，当其形成已经被AP1510化合物诱导的纳米组装阵列使用雷帕霉素处理时，FRB蛋 白质(捕获物)(用于FKBP的伴侣检测物质)与FKBP相互作用，使其被对接或补充到纳米 组装阵列的表面上。工业实用性如上所述，根据本发明，各种生物活性分子之间的相互作用可通过分析纳米组装 阵列是否通过体内同一场所或系统中生物活性分子之间的相互作用来分析，或者通过分析 生物活性分子是否共同定位在纳米组装阵列上来分析。因此，本发明可被应用到用于体外 和体内检测“诱饵”与“捕获物”之间的相互作用的试剂盒或者芯片。虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员来说容易想 到的是该描述仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围 将由随附的权利要求书及其等同物来限定。
权利要求
一种测定分子相互作用的方法，包括下列步骤(i)将纳米组装阵列形成物质、诱饵和捕获物提供到同一场合或者系统；(ii)通过诱饵与捕获物之间的相互作用形成纳米组装阵列；以及(iii)检查纳米组装阵列是否形成，由此测定诱饵-捕获物相互作用。
2.根据权利要求1的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述诱饵与捕获物之间 的相互作用在步骤(i)中直接或间接发生。
3.根据权利要求1的测定分子相互作用的方法，其特征在于，能够介导或调节诱饵与 捕获物之间相互作用的物质在步骤(i)中另外被添加。
4.根据权利要求1的测定分子相互作用的方法，其特征在于，诱饵与捕获物分别以结 合有标记物的方式被提供。
5.根据权利要求3的测定分子相互作用的方法，其特征在于，能够介导或调节诱饵与 捕获物之间的相互作用的物质以结合有标记物的状态被提供。
6.一种测定分子相互作用的方法，包括下列步骤(i)将媒介(调节)物质和结合有诱饵的纳米组装阵列提供到同一场合或系统；( )通过媒介物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕获物提供给形成的纳米组装阵列；以及(iv)通过与在形成的纳米组装阵列上存在的诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置 以便确定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定诱饵_捕获物分子相互作用。
7.一种测定分子相互作用的方法，包括下列步骤(i)将结合有第一媒介(调节)物质的纳米装配阵列形成物质和结合有第二媒介(调 节)物质的诱饵提供到同一场合或系统；( )通过第一媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列，并通过第二媒介 物质之间的相互作用将诱饵结合到形成的纳米组装阵列上；(iii)将捕获物提供到形成的纳米组装阵列上；以及(iv)通过与结合到形成的纳米组装阵列上的诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置 以便确定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定诱饵_捕获物相互作用。
8.根据权利要求6或7的测定分子相互作用的方法，其特征在于，介导或调节媒介(调 节)物质之间的相互作用的物质在步骤(ii)中另外被添加。
9.根据权利要求6或7的测定分子相互作用的方法，其特征在于，介导或调节诱饵与捕 获物之间的相互作用的物质在步骤(iv)中另外被加入。
10.根据权利要求6或7的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述诱饵、捕获物和 媒介(调节)物质的每种以其中结合有标记物的状态被提供。
11.根据权利要求1、6或7任意之一的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述诱 饵、捕获物和/或媒介(调节)物质为生物活性分子。
12.根据权利要求11的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述生物活性物质选 自下组，包括核酸、核苷酸、蛋白质、缩氨酸、氨基酸、多糖、脂类、维生素和化学化合物。
13.根据权利要求1、6或7任意之一的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述纳 米组装阵列形成物质是具有多种相同或不同结合基序并可通过它们之间的相互作用或者 自组装形成阵列的物质。
14.根据权利要求13的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述通过自组装形成 纳米组装阵列的物质选自下组，包括铁蛋白、铁蛋白状蛋白质、磁小体蛋白、病毒蛋白、金纳 米粒子、量子点和磁纳米粒子。
15.根据权利要求4或5的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述标记物为放射 性标记物、荧光物质或者发光物质。
16.根据权利要求15的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述荧光物质为荧光 染料，四_半胱氨酸基序、荧光蛋白或者荧光纳米粒子。
17.根据权利要求10的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述标记物为放射性 标记物、荧光物质和发光物质。
18.根据权利要求17的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述荧光材料为荧光 染料，四_半胱氨酸基序、荧光蛋白或者荧光纳米粒子。
19.根据权利要求1、6或7任意之一的测定分子相互作用的方法，其特征在于，其在细 胞、组织或器官中进行。
20.根据权利要求19的测定分子相互作用的方法，其特征在于，所述细胞、组织或器官 选自下组，包括斑马鱼、线虫、酵母菌，苍蝇或青蛙、哺乳动物(除人以外)和植物。
21.根据权利要求19的测定分子相互作用的方法，其特征在于，引入细胞、组织或器官 中通过使用选自下组的任何一种进行，包括跨膜肽(或者融合肽)、脂类(或者脂质体)基 因转运体或其结合复合物；电转化或者磁转染。
22.根据权利要求1、6或7任意之一的测定分子相互作用的方法，其特征在于，纳米 组装阵列形成使用下组的任何一种进行检查，包括光学仪器、扫描仪、放射性标记物检测装 置、荧光偏振阅读仪(FP阅读仪)、分光光度计、MRI (核磁共振成像)、SQUID、磁共振测量仪、 荧光探测仪，发光探测仪。
23.根据权利要求1、6或7任意之一的测定分子相互作用的方法，其特征在于，通过与 诱饵相互作用的捕获物的结合位置使用选自下组的任何一种进行测定，包括光学仪器、扫 描仪、放射性标记物检测装置、荧光偏振阅读仪(FP阅读仪)、分光光度计、MRI (核磁共振成 像)、SQUID、磁共振测量仪、荧光探测仪、发光探测仪。
24.一种测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，所述方法包括下列步骤(i)将纳米组装阵列形成物质、诱饵和捕获物文库提供到同一场合或者系统；(ii)通过诱饵文库与捕获物文库之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)检查纳米组装阵列是否形成，由此测定诱饵-捕获物相互作用；以及(iv)选择、分离和识别与诱饵相互作用形成纳米组装阵列的目标捕获物。
25.一种测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，该方法包括下列步骤(i)将媒介(调节)物质和结合有诱饵的纳米组装阵列提供到同一场合或系统；(ii)通过媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕获物文库提供给形成的纳米组装阵列；(iv)通过与在形成的纳米组装阵列上存在的诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置 以便测定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定诱饵-捕获物相互作用；以及(v)选择、分离和识别与诱饵相互作用以便与纳米组装阵列上的诱饵共同定位的目标 捕获物。
26.一种测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，该方法包括下列步骤(i)将结合有第一媒介(调节)物质的纳米装配阵列形成物质和结合有第二媒介(调 节)物质的诱饵提供到同一场合或系统；(ii)通过第一媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列，并通过第二媒介 (调节)物质之间的相互作用将诱饵结合到形成的纳米组装阵列上；(iii)将捕获物文库提供到形成的纳米组装阵列上；(iv)通过与结合到形成的纳米组装阵列上的诱饵的相互作用测定捕获物的结合位置 以便确定捕获物是否与诱饵共同定位，由此测定相互作用；以及(v)选择、分离和识别与诱饵相互作用以便与纳米组装阵列上的诱饵共同定位的目标 捕获物。
27.根据权利要求24的测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，其特征在于，所述 诱饵与捕获物之间的相互作用在步骤(i)中直接或间接发生。
28.根据权利要求24测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，其特征在于，介导或 调节诱饵与捕获物之间的物质在步骤(ii)中另外被添加。
29.根据权利要求25或26的测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，其特征在于， 能够介导或调节诱饵与捕获物之间的物质在步骤(ii)中另外被添加。
30.根据权利要求25或26的测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法，其特征在于， 介导或调节诱饵与捕获物之间的相互作用的物质在步骤(iv)中另外被添加。
31.根据权利要求24、25或26任意之一的测定与诱饵相互作用的目标捕获物的方法， 其特征在于，所述诱饵、捕获物以及媒介(调节)物质的每一种都以其中结合有标记物的方 式提供。
32.一种用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相互作用的目标 分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)将纳米组装阵列形成物质、诱饵以及捕获物提供到同一场合或者系统；(ii)在目标候选物的存在下通过诱饵与捕获物之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕获物提供到形成的纳米组装阵列；以及(iv)选择与在目标候选物不存在下诱饵与捕获物共同定位的程度相比，在目标候选物 存在下诱饵与捕获物共同定位的程度被阻断(抑制)或者活化(诱导)的情况对应的目标 候选物作为目标阻断剂分子或者目标活化剂分子。
33.一种用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相互作用的目标 分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)将媒介(调节)物质和诱饵结合到纳米组装阵列形成物质并将这些物质提供到同 一场合或者系统；(ii)在目标候选物的存在下通过媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装阵列；(iii)将捕获物提供到形成的纳米组装阵列；以及(iv)选择与在目标候选物不存在下诱饵与捕获物共同定位的程度相比，在目标候选物 存在下诱饵与捕获物共同定位的程度被阻断(抑制)或者活化(诱导)的情况对应的目标 候选物作为目标阻断剂分子或者目标活化剂分子。
34.一种用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相互作用的目标 分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)将结合有第一媒介(调节)物质的纳米组装阵列形成物质和结合有第二媒介(调 节)物质的诱饵提供到同一场合或者系统；(ii)在目标候选物的存在下通过第一媒介(调节)物质之间的相互作用形成纳米组装 阵列，并通过第二媒介(调节)物质之间的相互作用将诱饵结合到形成的纳米组装阵列；(iii)将捕获物提供到形成的纳米组装阵列；以及(iv)选择与在目标候选物不存在下诱饵与捕获物共同定位的程度相比，在目标候选物 存在下诱饵与捕获物共同定位的程度被阻断(抑制)或者活化(诱导)的情况对应的目标 候选物作为目标阻断剂分子或者目标活化剂分子。
35.根据权利要求32的用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相 互作用的目标分子的方法，其特征在于，所述诱饵与捕获物之间的相互作用在步骤(i)中 直接或间接发生。
36.根据权利要求32的用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之间的相 互作用的目标分子的方法，其特征在于，介导或调节诱饵与捕获物之间的物质在步骤(ii) 中另外被添加。
37.根据权利要求33或34的用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之 间的相互作用的目标分子的方法，其特征在于，介导或调节媒介(调节)物质之间的相互作 用的物质在步骤(ii)中另外被添加。
38.根据权利要求33或34的用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵与捕获物之 间的相互作用的目标分子的方法，其特征在于，介导或调节诱饵与捕获物之间的相互作用 的物质在步骤(iv)中另外被添加。
39.根据权利要求32、33或34任意之一的用于测定阻断(抑制)或活化(诱导)诱饵 与捕获物之间的相互作用的目标分子的方法，其特征在于，所述诱饵、捕获物以及媒介(调 节)物质分别以其中结合有标记物的方式提供。
全文摘要
本发明涉及动态测定细胞中各种物质包括生物活性分子之间的相互作用的方法以及测定目标分子的方法。更具体地说，本发明涉及动态测定诱饵-捕获物相互作用的方法和容易测定阻断或活化相互作用的目标分子的方法，所述方法包括允许能够形成纳米组装阵列的物质、诱饵和捕获物彼此相互作用，并分析在体外或体内纳米组装阵列是否通过诱饵与捕获物之间的相互作用形成；或者允许能够形成纳米组装阵列的物质、诱饵和捕获物彼此相互作用，包括通过媒介(调节)物质在体外或体内形成纳米组装阵列，然后分析捕获物与诱饵是否共同定位在纳米组装阵列上。
文档编号G01N33/53GK101821622SQ200880102782
公开日2010年9月1日 申请日期2008年8月14日 优先权日2007年8月17日
发明者何宰石, 李京侯, 李承久, 李相奎, 金太国 申请人:韩国科学技术院;韩国生命工学研究院