固体支持物上的靶分子的检测和/或定量的制作方法

专利名称：固体支持物上的靶分子的检测和/或定量的制作方法
固体支持物上的靶分子的检测和/或定量发明背景 1.发明领域本发明涉及用于检测和/或定量溶液中存在的一种或多种靶分子的方法、仪器和 试剂盒，通过在线定量其对固定在固体支持物表面上的特定捕获分子的结合，而无需对溶 液中存在的靶分子的实质性检测。更特别地，本发明包括实时检测微阵列上存在的捕获DNA 分子和溶液中存在的靶多核苷酸之间的杂交。最后，本发明还涉及多重靶的实时PCR。2.相关技术描述获得关于最小量样品的最大量信息是分析科学的主要目标。这特别适用于分子生 物学和其中需要高度平行分析的所有基于分子的生命科学中。微阵列技术是这种需求的一 个答案。它使得能够在相同溶液中同时执行结合事件的大量平行测定和多重测量。微阵列 通常由许多微型斑点组成，每个微型斑点包含等同分子，即作为捕获分子的核酸或蛋白质。 斑点的数目可以从小于一百到数千不同。通过附着优选经共价键将分子固定至固体支持 物。微阵列实验的主要任务是同时检测许多结合事件。因为荧光的灵敏度高，其在大多数应用中用作标记以检测结合事件。在实施实验 前，样品必须借助于合适的荧光物进行标记。在分开的温育步骤中实现结合，并且在微阵列 的适当洗涤和干燥后获得最终结果。微阵列阅读器通常在结合过程的给定时间获得关于荧 光强度的信息，所述结合过程理想地将是到达热力学平衡的时间。然而，在芯片实验中采用 的常规条件下，难以获得热力学平衡，并且由于例如动力学中的差异、扩散常数和捕获分子 浓度的几种限制，无法同时到达不同浓度的、生物样品中存在的不同靶，所述不同浓度可能 相差几个对数尺度。因此，在固定实验背景中，难以设定其中与其捕获分子结合的靶量将与 溶液浓度直接成比例的实验条件。在几个洗涤步骤后进行在微阵列上的结合步骤后的定量步骤，这暗示关于过程的 某些基本信息例如结合反应的动力学完全丧失。克服依赖于单个样品中存在的不同靶的结合效率或浓度中的易变性问题的一个 解决方案是获得关于溶液中存在的每个个别靶实时结合反应的数据。Bier 和 Schmidt (2004，Anal. Bioanal. Chem.，378，52-53)教导了使与整合检测方 案组合的流体处理方法集合的必要性，以在微阵列上进行可能的实时分析。该方法基于跟 踪对携带标记的双链DNA的斑点的实时酶反应。固定的DNA充当关于酶的结合受体，并充 当待通过限制性酶切割的底物。在添加辅因子Mg2+后，其中DNA通过酶切割的斑点通过在 给定位置处荧光强度的减少进行鉴定(负测定法)。Bier 和 Kleinjung(2001，Fresenius J. Anal. Chem.，371，151—156)提出通过获得 关于微阵列的每个斑点的熔解曲线来测量主要在解离相中的杂交动力学。根据相同想法， US-P-6, 589，740公开了检测在芯片上的荧光靶的杂交反应的方法。在预定时机获取反应的 图像，同时将洗涤溶液注入容器内并且同时根据预定时间模式改变生物芯片的温度。通过 在增加的温度下洗涤芯片获得熔解曲线。随着温度升高，具有较弱结合能力的样品DNA开始与探针DNA解离，并且用洗涤溶液从斑点中去除解离的样品DNA。因此，杂交的荧光标记 样品DNA的量随着时间流逝而减少，并且荧光强度也是如此。WO 06/053769提出用于实时检测处于溶液中的靶而作用于其相应固定捕的获分 子的方法。该方法依赖于光源的使用，所述光源用于激发结合靶，且测定发射的光。该方法 使用共聚焦扫描方法，这允许获得来自激发光聚焦处的结合靶的比来自溶液中存在的靶更 佳的信号。尽管结果是阳性且令人信服的，但该方法的局限性是测定法的高本底。US-P-6, 416，951教导了用于实时测量RNA与多核苷酸探针杂交的动力学的另一 种方法。动力学如下进行测量通过在嵌入染料的存在下杂交，并且记录随着杂交进行染料 的分光性质中的改变，或者在RNA或探针中掺入标记，使未标记分子与固体支持物附着，在 附着分子附近产生消散波，并且记录随着杂交进行通过消散波与标记的相互作用产生的信 号中的增加。WO 99/57310A2使用包括点形式的矩阵的支持物，其中矩阵的每个点代表分子的 个别种类。矩阵由凝胶样支持物制成。每个点对应于检测用的光学透镜。允许样品流过微 流体结构，并且用杂交的实时测量进行靶的结合。流体流动帮助检测，因为溶液通过流过矩 阵而不保持与捕获分子接触，并且在洗涤后执行所提出的检测。Stimpson等人(1995，PNAS，92，6379-83)描述了关于靶DNA上特定标记的使用，当 被波导管的消散波照射时，所述特定标记充当光散射源，并且仅与表面结合的标记产生信 号。WO 99/20789还公开了基于置于波导管表面上的、在多个DNA捕获区带处被吸收的特定 标记产生的散射光的测定法的方法。光散射通过由波导管引起的消散波产生。因为消散波 仅从波导管表面延长数百纳米，所以未结合/解离的标记不散射光且不需要洗涤步骤。实 时监控光散射标记的解吸。消散称为激发光的全内反射荧光(TIRF)。Lehr 等人(2003，Anal. Chem.，75，2414-2420)提出使用 TIRF 以便跟踪微芯片上 靶探针的杂交(实时检测)。靶在PCR循环仪中获得并且通过在特别处理中去除第二条链 而制成单链。靶用生物素进行标记，并且在杂交后，它们通过与链霉亲和素Cy5温育成为荧 光的。Lehr 等人(2003，Sensors and Actuators，92，303-314)开发了数学模型，并且他们 提出关于使用TI RF检测方法的光学设置，以跟踪荧光分子例如Cy5的杂交动力学。该文 件未提及或描述通过杂交至固定探针上检测在PCR循环过程中的扩增子。以相同概念，US-P-5，633，724提供了用于检测像素阵列中的靶物质的方法和仪 器，使用具有像素阵列定位于其上的TIR表面的全内反射(TIR)成员，且使用靶物质的消散 激发。与TIR相关的消散是可以区分结合和未结合靶的方法，但它对阵列测量的应用由 于下述事实而变得困难位于不同位置处的相同量的结合靶必须给出相同信号。这需要相 同激发，意指相同光强度。获得不同捕获定位于其上的整个表面上的均勻光是困难的任务， 因为原则上，消散激发需要照明光以通过支持物如TIR的内部，从而使得光通过探针定位 于其上的支持物侧面或在每个正切角处达到表面。在WO 2004/044171中，支持物用作波导管，以便检测通过与支持物表面上的捕获 分子结合的靶发射的光。结合分子通过移动光源激发，并且在作为全内反射在支持物中移 动后在支持物边缘处收集发射的荧光。光作为内反射经过支持物的事实促使在通过移动照 明装置照射支持物表面的部分后执行检测，并且其后在表面上重构发射模式。
WO 03/052421描述了用于监控核酸检测的电化学分析装置。该装置包括生物传感 器，其由具有与之附着的多个探针的金电极和整合热传感器形成。基于电检测在生物传感 器位点处实现分子相互作用的分析。美国申请2005/0191686描述了通过经由电化学检测来检测掺入扩增子内的纳米 颗粒的存在用于实时检测PCR产物的方法。Wie 等人(2003,Biosensors and Bioelectronics, 18,1157-1163)提出通过实时 电容测量来监控在烷基修饰的硅表面上的DNA杂交。WO 02/099386提出基于在捕获分子上的靶的结合过程中的热改变的微量热法检 测。在此通过引用整体合并入本文的WO 01/27327涉及执行多重PCR的方法，使用2 个固体表面的特别装置，2个表面之一包含用作引物的固定的特定寡核苷酸。另一个表面是 可以在其中发生PCR的孔的阵列(参考例如

图15)。使用例如嵌入试剂SYBR Green在荧光 中跟踪孔溶液中存在的所得扩增产物(图20和21)。该文献提及在固定的捕获分子上捕 获扩增子的可能性，但这种捕获不作为实时检测随PCR循环进行，而是使用荧光显微镜作 为PCR后检测。该文献未提及或描述扩增子在固定的捕获分子上的可能杂交，它们的检测 和PCR循环过程的重复以及在固定的探针上的进一步检测。如这个综述可见的，对当靶在相应的固定的捕获分子上结合时执行靶的实时检测 而提出了不同方法。然而，仍需要提出当靶存在于溶液中时用于定量靶分子与捕获分子的 结合的新的、简单方法，其避免与现有技术方法相关的缺点。特别地，该方法应易于执行、定 量、成本有效且与PCR相容。发明_既述该方法允许检测和/或定量具有折光指数nl的光学透明的固体支持物表面上存 在的生物靶分子，所述固体支持物与具有折光指数n2的介质接触，其中nl > n2，所述方法 包括步骤a)照射靶分子，从而引起靶分子发射光和，b)以相对于在支持物中所述固体支持 物表面的法线的观察角θ obin检测通过所述支持物从靶分子发射的光，从而使得90° > θ obin > SirT1 (n2/nl)。优选地执行上述方法用于检测与固体支持物表面上存在的捕获分子结合的靶。优 选地，具有折光指数n2的介质包括包含靶分子的溶液。优选地，结合靶通过所述支持物发 射的光是发射消散耦合的结果。附图简述图1给出本发明的特定装置⑴的示意图。靶分子(2)结合在封闭装置的光学透 明内表面(3)上存在的捕获分子上(结合靶分子)或存在于室(13)中包含的溶液中(可 溶靶分子)(4)。内表面(3)通过具有厚度(e)的光学透明的固体支持物(6)与外表面(5) 分离，所述光学透明的固体支持物适合于沿着在临界角θ c和90°之间包括的支持物内的 观察角θ obin检测扩增产物，并且其中所述固体支持物(6)具有高于水溶液(13)的折光 指数(η2)的折光指数(nl)。通过来自光源(9)的光束⑶照射固体支持物(未显示)。用 CCD照相机(10)测量来自结合靶分子的信号，所述CCD照相机(10)位于相对于在支持物 (14)中具有捕获分子的透明固体支持物(16)侧面的法线(15)测量的角0° < θ ob out < θ C out 处。
角θ c out通过下述关系与角θ c联系nl sin(a) = n3 sin( θ c out)，其中α是由法线(15)和透明支持物(16)侧面 形成的角，并且n3是其中放置CXD照相机的介质，一般是空气(n3= 1)的折光指数在这个例子中a = (90° - θ c)，θ c禾口 θ c out之间的关系是nl sin(90° - θ c) = nl cos( θ c) = n3 sin( θ c out)因此θ c out = Arcsin (nl/n3 cos( θ c))如果nl = 1. 5，n2 = 1. 33 和 n3 = 1，那么 θ c = 62. 4° 禾口 θ c out = 44. 7°在其中透明支持物是平行六面体的这个具体设置中，CCD照相机在固体支持物外 的观察角必须遵循下述关系0° < θ ob out < 44. V。图2表示根据本发明的另一个装置(1)。靶分子结合在封闭装置的光学透明内表 面(3)上存在的捕获分子上(结合靶分子)(2)，或存在于溶液中(可溶靶分子)(4)，溶液与 所述内表面接触并且包含在室(13)中。适合于在禁止角中检测的固体支持物的所需厚度 通过使经由材料(11)分开的相同组成(6)的2种固体支持物(玻璃载玻片和棱镜)连接 而获得，所述材料(11)具有与所述固体支持物的折光指数(对于玻璃nl = 1. 5)接近的折 光指数(对于甘油n4= 1.47)。2种固体支持物(6)具有比室(13)中包含的水溶液的折 光指数(n2 = 1.33)高的折光指数(对于玻璃nl = 1.5)。通过来自光源(9)的光束⑶ 照射固体支持物。用位于禁止角(7)内的照相机(10)测量来自结合靶分子的信号。固体 支持物的下表面包括加热装置(12)。图3表示在其为载玻片(slide)用于执行根据本发明检测的固体支持物(6)底部 掺入脊通道结构的根据本发明的简化装置。上表面(3)用于制作微阵列，并且具有包含结 合靶分子⑵的室(13)。照明和检测根据与图2中提供的相同原理来执行。β是脊的角。图4表示在为多孔平板的固体支持物(6)底部掺入脊通道结构的根据本发明的简 化装置。该装置在每个孔(14)的底部具有脊通道结构，以根据孔使检测个别化。孔(14)的 底面(3)用于优选以阵列形式进行靶和捕获分子之间的结合。孔包含结合(2)和可溶(4) 靶分子。图5显示根据图2的设计，已以不同浓度点样的固定Cy 3标记的胺化多核苷酸捕 获分子阵列的检测。读数在不存在溶液的情况下(图Α)或在室中2 μ MCy3多核苷酸溶液的 存在下(图B)进行。阵列(6x12)包含用Cy3探针溶液点样的12列1999，所述Cy 3探针溶 液具有 3000nM(列 1 和 12) UOOOnM(2)、750nM(3)、500nM(4)、250nM(5)、100nM(6)、50nM(7)、 IOnM⑶、OnM(9)的浓度。列10和11用未标记的探针点样。6行是斑点重复的值。该图给 出了在禁止角中检测后获得的每列的一个斑点的扫描。关于实验细节参见实施例1。图6呈现根据图2的设计，来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的Cy5标记扩增子在 其特定的捕获分子上的杂交的在线检测(曲线B)。检测在测定法过程中在溶液中存在的 扩增子的存在下进行。该图还显示关于其为阴性杂交对照的捕获探针上获得的信号(曲线 A)和点样的Cy5探针的信号(曲线c)。关于实验细节参见实施例2。图7呈现根据图2的设计，作为PCR循环数目的函数，来自金黄色葡萄球菌的扩增 子在其特定的捕获分子上的扩增和检测(曲线B)。数据给出在2分钟温育后扩增子的检测 值。该图还显示关于其为阴性杂交对照的捕获探针上获得的信号(曲线A)。关于实验细节 参见实施例3。
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图8呈现根据图2的设计，关于以1至400nM的不同浓度点样的DNA探针上的 银沉淀动力学。生物素化的探针在与银增强反应物Silverquant (Eppendorf, Hamburg, Germany)温育前用金颗粒进行标记。随后在这个增强反应过程中随着时间过去监控关于 所有斑点的信号，并且对于相同阵列上存在的所有斑点同时获得图像。数据每10秒给出 点样DNA的检测值，直至120秒温育时。点样溶液的浓度曲线1 (InM)、曲线2 (2nM)、曲线 3 (4nM)、曲线 4 (IOnM)、曲线 5 (20nM)、曲线 6 (40nM)、曲线 7 (IOOnM)、曲线 8 (200nM)、曲线 9 (400nM)。关于实验细节参见实施例4。图9举例说明在本发明的一个具体实施方案中成脊状载玻片的使用。在玻璃载玻片1的一个侧面上是阵列2。介质3在阵列2的侧面与载玻片1接触。图 9A 显示在用 Silverquant (可从 Eppendorf, Hamburg, Germany 获得的有专 利权的标记技术)标记探针后，用检测器6获得的模式，所述检测器6以相对于载玻片1的 法线40°的角放置。图9B显示当室3充满苯胺蓝溶液时用相同设置获得的模式。斑点模式显示非常 弱的反差图9C显示成脊状载玻片5在玻璃载玻片1的观察侧面加入的图9A和9B的设置。 甘油层4存在于玻璃载玻片1和成脊状载玻片5之间，以确保2个载玻片之间的最佳光学 接触。甘油的折光指数(η = 1. 47)事实上等同于2个载玻片的折光指数(η = 1. 52)。用40°的观察角获得的图9C也显示具有弱反差的模式。图9D显示图9C的设置，但检测器6移动至65°的观察角，这在禁止角内。即使在 溶液中存在高浓度的有色分子，阵列也清晰可见。在这个实验中，不存在关于图像焦点的校 正。关于实验细节参见实施例5。图10表示在其为单管的固体支持物(6)底部掺入脊通道结构的根据本发明的简 化装置。该装置在每个管底部具有脊通道结构，以根据管使检测个别化。可以平行使用一 系列管。定义除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术 人员通常理解相同的含义。术语“核苷酸序列、微阵列、靶(和捕获)核苷酸序列、基本上结合、与……特异性 杂交、本底、定量”如经由参考合并入本文的W097/27317中描述的。术语“核苷酸三磷酸盐、核苷酸、引物序列”是通过引用合并入本文的欧洲专利申 请EP 1096024中描述的那些。术语“基因”意指携带从一代到下一代信息的遗传基础物理和功能单位；位于编码 特定功能产物的染色体上的特定位点处的DNA区段。DNA区段由转录区和调节序列组成，所 述调节序列使得转录成为可能(在编码DNA前和后的区域以及在外显子之间的内含子)。术语“基因座”意指在基因序列上的单核苷酸多态性(SNP)位置。“同源序列”意指具有在相应位置处等同的核苷酸百分比高于纯随机比对的核苷 酸序列。当序列显示在它们之间最低限度的同源性(或序列同一性)时，2个序列视为同 源，所述同源性定义为在已考虑待比较的2个序列之一中的添加或缺失(如缺口)时对序 列进行最佳比对后，与总核苷酸比较，在每个位置处发现的等同核苷酸的百分比。同源性(或序列同一性)程度可以改变很多，因为同源序列可以仅在沿着其序列的一个部分、少数 部分或局部或全部中是同源的。仅相差一个碱基的核苷酸序列是高度同源的序列，并且有 资格作为单核苷酸多态性(SNP)。在2个序列中等同的序列的部分或局部被说成是保守的。 呈现保守三维结构的蛋白质结构域通常由同源序列且甚至通常由独特的外显子编码。在其 序列中显示高度不变性的序列被说成高度保守的，并且它们呈现高度同源性。序列比对方法基于局部同源性算法，这已计算机化并且作为例如(但不限于) Clustal 、(Intelligenetics，Mountain Views, California)、或 GAP ' 、BESTFIT 、 FASTA 禾口 TFASTA (WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group Madison, Wisconsin, USA)或 Boxshade 可获得。术语“共有序列”是在待考虑的几个同源序列比对后测定的序列(计算为在比较、 比对的同源序列中的每个位置处最常发现的碱基)。共有序列代表一种《平均》序列，其尽可能接近于所有比较的序列。对于高度同 源序列，或如果共有序列足够长，并且反应条件并不太严格，那么它可以与所有同源序列结 合。这对于用称为通用引物的相同引物扩增同源序列特别有用。在实验上，可以改变由上 述程序计算的共有序列以便获得此种性质。“微阵列”和“阵列”意指单个捕获探针或捕获探针种类固定在其上的固体支持 物，以便能够结合给定的特定靶，优选蛋白质或核酸。微阵列优选获自但不限于捕获分子 在底物上的沉积，这通过物理方法例如针或针与环触摸表面、或通过溶液微滴的释放、通 过方法例如压力或纳米分配器来完成。备选地，捕获分子在底物上的原位合成是本发明 的实施方案之一，具有寡核苷酸或多核苷酸在预定位置中合成的光空间分辨率，例如由 US-P-5, 744，305和US-P-6，346，413提供的。微阵列优选由在表面上或在固体支持物内或 在覆盖固体支持物的底物上的给定位置处沉积的捕获探针斑点组成。然而，捕获探针可以 以各种形式存在于固体支持物上，所述各种形式包括但不限于斑点。微阵列应用的一种特 定形式是捕获探针在孔中的存在，所述孔具有一种或数种不同捕获探针/孔并且是相同支 持物的部分。有利地，也在不同的支持物上提供捕获探针的微阵列，只要不同的支持物包含 特定捕获探针并且可以彼此区分，以便能够允许对特定靶序列定量。这可以通过使用珠的 混合物来完成，所述珠具有特定特征并且能够彼此识别，以便定量结合分子。术语“捕获分子”涉及能够与给定多核苷酸或多肽或蛋白质或其家族特异性结合 的分子。优选地，多核苷酸结合通过2个多核苷酸之间的碱基配对来获得，一个是固定的捕 获探针或捕获序列，并且另一个是待检测的靶分子(序列)。术语“入射角”表示在表面上的入射方向和在入射点处与表面垂直的线(称为法 线)之间的角度。在本发明中，入射角视为在支持物中(内)，因为发射光通过支持物而被 检测。在本发明中术语“临界角”是支持物中相对于对固体支持物表面的法线的角，定义 为Θ。= SirT1Ol2All),其中ηι是固体支持物的折光指数，并且n2是外部的折光指数。在本 发明中，n2优选是水溶液(n2 1. 33)或空气(n2 1)。临界角是在其下全内反射在支持 物中发生的入射角的值。临界角以相同方式以弧度计算并表示。术语“观察角”(θ obin)是用于观察发射光的角，并且相对于支持物中的法线对具 有靶分子的固体支持物表面来表示。
θ obout是关于位于支持物外的检测装置的观察角。本发明的“禁止角”对于对应于支持物中发射光的波长的光束包括在临界角和 90°之间。术语“消散波耦合”或“消散耦合”是借助于消散(或衰变)电磁场通过其消散波 从一种介质传导到另一种介质的过程。以其通常含义，术语“消散场，，或“消散波，，指入射光源所照射的全内反射表面的 远或遥远侧上产生的指数式衰变电磁场。消散波给出与被全内反射的入射光波长的能量相 同的激发能。这种能量允许激发在其中发生全内反射(诱导消散)的表面上固定的分子。 消散场以有效能量传播仅距离界面远极面相对短的距离(例如，以其波长的数量级)。术语“发射消散”或“逆消散”是诱导消散的相反，即通过其从非常接近(在一个 或数个波长内)于全反射表面远侧(在支持物外)的物体发射的光可以传递给近侧(在支 持物内)的过程。荧光标记包括掺入扩增产物内的荧光标记的核苷酸。这可以例如通过使用荧光 标记的核酸引物或标记的脱氧核糖核苷酸来实现。荧光标记还包括嵌入荧光物如SYBR Green0术语“实时PCR”意指允许在PCR循环过程中检测和/或定量扩增子的存在的方 法。在实时PCR中，在至少一个扩增循环中检测和/或定量扩增子的存在。PCR循环过程中 形成的扩增子或与扩增子量相关的信号的增加用于检测和/或定量在PCR溶液中的给定核 苷酸序列。生物靶分子意指涉及生物过程的分子。它们限制于核酸和蛋白质。观察角θ obin在本文中在支持物和外部溶液的折射角的函数中分别如下文更详 细说明的定义。在大多数应用中，检测器将置于支持物外部，由具有折光指数1的空气包 围。这个设置的结果是观察角θ obout，其以图1中描述的方式与θ obin相关。如本文所 使用的，术语“在观察角θ obin处”例如就检测工具而言包括在角θ obout处的设置，其中 观察角θ obout以图1中描述的方式与θ obin相关。在一般设置中，如图1所示，探针位于其中的透明支持物表面和外部支持物表面 之间形成的角不是90°，并且可以指定为λ。在这种情况下，在固体支持物的外表面上发 射光的入射角等于(θο η-λ)。在支持物外表面处的折射定律变成ml sin (θ obin-λ) =n3sin(6 obout)。n3是外部介质的折光指数。随后θ obout 和 θ obin 之间的最一般关系是| θ obout | = Arcsin (nl/ n3.sin| θobin-λ |)。在图1的特定设置中，λ = 90 °并且关系变成θ obout = Arcsin(nl/ n3. sin θobin_90° |) = Arcsin(nl/n3. cos(θobin)—种其他的特定设置是当外部支持物表面上的透明支持物内发射的入射角等于 零时，那么此种光在此种表面上的折射是无效的。发明详述本发明特别可用于监控在溶液中存在的靶对在支持物表面上固定的其捕获分子 结合的动力学。应用是众多的。优选应用是通过检测cDNA关于其捕获分子的存在获得基因表达模式。
也优选执行上述方法用于在溶液中标记扩增子的存在下检测固体支持物上的扩 增子。在另一个实施方案中，该方法用在基本上干燥和/或不与溶液接触的固体支持物上 检测出的靶而执行。本发明用于通过PCR(实时PCR)检测、鉴定和/或定量在其扩增过程中的一种或 多种基因组序列。本发明允许在PCR过程期间以及在溶液中标记扩增子的存在下，在与特 定固定的捕获分子杂交时实现扩增子的同时检测和/或鉴定和/或定量。特别地，本发明提供了实时PCR过程用于鉴定和/或定量样品中的生物体或生物 体部分，所述过程包括步骤a)在至少一个引物对和至少一种捕获分子的存在下，在封闭装置中扩增来自所述 生物或其部分的核苷酸序列，所述引物对对于待鉴定和/或定量的核苷酸序列特异，所述 捕获分子固定在封闭装置的内表面上的给定位置处，所述内表面通过光学透明的固体支持 物与外表面分开，其中所述固体支持物具有比PCR扩增在其中发生的介质的折光指数n2高 的折光指数nl，并且其中所述捕获分子包括能够与扩增产物特异性杂交的10至600个碱基 的捕获部分；和b)通过检测由于靶分子激发从靶分子发射的光，在扩增过程中检测扩增产物与捕 获分子的特异性杂交，所述发射光通过所述光学透明的固体支持物以相对于支持物中的固 体支持物的所述内表面的法线的观察角θ obin检测，从而使得90° > θ obin SsirT1O^/ nl)。本发明在使用阵列区分属于几个组的同源核苷酸序列，连同像这样通过实时PCR 鉴定这些组方面特别有用。本发明进一步提供了通过经由实时PCR测定基因含量用于鉴定和/或定量生物体 部分的方法，例如以mRNA形式的表达基因。在另一个实施方案中，本发明提供了用于执行本发明过程的仪器，需要具有折 光指数nl光学透明的固体支持物，经设计当使用时包括在所述固体支持物表面上存在的 捕获分子上结合的至少一种靶分子(结合靶分子)，并且其中固体支持物的折光指数高于 靶与捕获分子的结合在其中发生的介质的折光指数n2 ；产生导向靶分子上的光束的光源； 用于测量从靶分子发射的光的检测器，所述发射光通过所述光学透明的固体支持物以相 对于支持物中的固体支持物的所述内表面的法线的观察角θ obin检测，从而使得90° > θobin > sin-l(n2/nl)。在另外一个实施方案中，本发明提供了用于检测和/或定量靶分子的反应物装 置，其包含固定在所述装置的内表面(观察区)上的至少一种捕获分子，所述内表面通过光 学透明的固体支持物与外部观察表面分开，用于沿着其为禁止角的观察角(θ obin)检测 靶分子，并且其中所述固体支持物具有高于1. 33的折光指数，并且其中脊通道存在于与具 有固定的捕获分子的观察区相对的支持物侧面上。在另外一个实施方案中，本发明提供了用于检测和/或定量固体支持物上存在的 靶核酸的反应物试剂盒，其包括用于检测和/或定量靶分子的装置，其包含固定在所述装 置的内表面(观察区)上的至少一种捕获分子，所述内表面通过光学透明的固体支持物与 外部观察表面分开，用于沿着其为禁止角的观察角(θ obin)检测靶分子，并且其中所述固 体支持物具有高于1. 33的折光指数，并且其中脊通道存在于与观察区比较的支持物对侧
14上，所述观察区具有固定的捕获分子，至少一种核酸引物，任选地脱氧核糖核苷酸，任选地 适合于延伸核酸引物的酶，任选地荧光标记，用于在禁止角中检测给定位置处存在的扩增 产物的工具。本发明人已意外地发现2种无关物理现象2种不同折光指数的介质之间的折射 和发射消散(在发射水平上)的组合，解决了测量在固体支持物表面处靶和捕获分子之间 的生物结合过程的问题，可能是实时的，无需在实质上测量与固体支持物表面接触的溶液 中存在的标记靶分子。本方法还允许容易地执行完整阵列表面的均勻照射，因为在照射光 的方向上不存在限制，只要它产生靶相关标记的激发。在它的优选实施方案中，本发明涉及用于检测与在底物表面上附着的探针结合的 标记靶物质的方法、试剂盒和仪器，所述仪器包括光学透明的固体支持物，其包括在所述固 体支持物表面上存在的捕获分子上结合的至少一种靶分子(结合靶分子)，并且其与包括 靶分子(可溶靶分子)的溶液接触或不接触，其中固体支持物的折光指数高于溶液的折光 指数；产生适合于激发靶分子的波长的光束的光源；用于检测由于靶分子激发从靶分子发 射的光的检测系统，所述发射光通过所述光学透明的固体支持物以其为禁止角的观察角检 测。在一个优选实施方案中，固体支持物的折光指数是至少1. 33。观察到的发射光仅经历在支持物外表面上的折射，并且不作为全内反射通过支持 物，因此当支持物用作波导管时不受与全内反射相关的限制。当结合靶的检测必须在溶液中存在的非结合靶的存在下获得，或由于溶液中存在 的其他无关荧光分子的存在，必须降低非特异性信号检测时，本发明是特别有用的。在本发明的方法和仪器的一个优选实施方案中，结合靶的检测在包括靶分子(可 溶靶分子)的溶液的存在下进行。优选地，溶液包含在封闭室中。在另一个实施方案中，在靶和捕获分子之间的结合事件过程中执行检测。在另外一个实施方案中，跟踪靶在其捕获分子上的反应动力学。靶分子进行标记，以便当与表面结合并且根据本发明进行检测时，能够发射光或 散射光。靶分子优选用选自下述的染料进行标记荧光的、发磷光的、量子点。备选地，靶分子用使照射光散射的颗粒或分子或颜色进行标记，优选选自金颗粒、 金属沉淀物、非金属沉淀物和有色分子。显示所述过程物理原理的本发明的某些基本实施方案的图示呈现于图1和2中， 并且某些结果呈现于图5中。在此种配置中，观察角是这样的，以便检测从结合靶发射的光 而无太多来自可溶靶的光。在本发明的方法和仪器的一个优选实施方案中，观察角高于由临界角给出的值， 所述临界角通过捕获分子位于其中的介质的折光指数和透明固体支持物的折光指数之间 的比的反正弦定义。在另一个优选实施方案中，以对于从可溶靶分子发射的光的禁止角检测从结合靶 分子发射的光。优选地，观察角(θ ob)在禁止角范围中但接近于临界角(θ。)，以能够重构支持物 的图像。当不同捕获分子存在于支持物表面上并且必须彼此区分时，如在微阵列的情况下， 这是特别有用的。优选地，观察角低于85°、更优选低于80°且更优选低于70°。在一个优选实施方案中，观察角在禁止角内，并且在临界角加10°、优选加5°且更优选加3°的 范围中。在一个具体应用中，当固体支持物具有约1.5的折光指数如对于玻璃时，观察角是 62.4°至65°。对于具有相似折光指数的玻璃或材料，临界角θ。是SirT1 (1.33/1. 5)= SirT1 (0.887) = 62.4°。所需观察角θ。bin由式90° > θ obin > θ。给出。换言之，观察 角应是至少62. 4°。然而，如图1中所示，关于检测装置的0。13_可能低于θ。Μη。观察角低于90°，并且不象使用支持物作为波导管的全内反射(TIR)方法中一样 是90°。本方法不基于使用全内反射以便使来自表面的发射光与来自溶液的发射光区分。在另一个实施方案中，观察角在禁止角内，并且是这样的，使得与结合靶的发射光 比较，未显著检测出来自溶液的信号。在一个优选实施方案中，从可溶分子发射的光未达到由观察角限定的方向，从而 允许与从结合靶分子发射的光的良好空间区分，除了在非常接近于支持物的区域中从溶液 发射的光。通过可溶分子产生且在禁止角内检测出的发射光极小。这种光污染是由局限性 靶的信号推导的非局限性信号。在一个优选实施方案中，来自局限性靶的信号比来自可溶 靶的信号的污染小于信号的10%，并且甚至优选小于5%且甚至小于1%。在一个优选实施方案中，通过支持物由结合靶分子发射的光由发射的消散波产 生。支持物优选具有允许检测靶在其中结合的目的区域的厚度。支持物的厚度(e。)优 选大于由下式给出的值力。=(1/(2切119。)，其中(1是待检测的固体支持物表面的长度，并且 θ c是临界角。关于给定观察角θ的最小厚度(em)通过式计算em = d/(2tan θ )。本发明人已发现为了使支持物的厚度维持在合理范围中并且仍能够覆盖待检测 的大区域，使用具有脊通道样结构作为观察表面的固体支持物是有利的。适合于接受捕获 分子的观察区位于具有显微结构(例如脊通道)的支持物表面上，存在于与具有固定的捕 获分子的表面不同且优选相对的支持物侧面上。在特定装置中，显微结构存在于第二种支 持物上，与具有捕获分子的第一种支持物适当接触。显微结构用于检测在禁止角中发射的 光。脊通道是根据本发明的显微结构的一个例子。当与如通过本发明提供的对发射光 的检测相容时，其他显微结构是可能的。在一个实施方案中，显微结构存在于支持物的一个 侧面上并且用作观察表面。在一个特定实施方案中，一系列脊通道存在于与具有固定的捕获分子的侧面相对 的支持物侧面上。在另一个实施方案中，对于每个阵列存在一个脊通道。在另一个实施方案 中，阵列分离成占据支持物表面上不同区域的亚阵列，并且存在关于每个亚阵列的脊通道。 亚阵列意指阵列在空间上在表面上分开，每个亚阵列通过使用一个脊通道进行检测。在另 外一个实施方案中，一系列脊通道存在于与具有固定的捕获分子的观察区比较的支持物的 对侧上。优选地，包含捕获分子的表面和脊的顶部之间的最小厚度由式em = dr/(2tan θ ) 给出，其中dr是脊的基底，并且θ是观察角。优选地，脊的角(β)等于90°。在一个特定 实施方案中，表面和脊的侧面之间的角(Y)等于25° +/-5° (参见图3)。在另外一个优选实施方案中，观察角和与观察表面相对的脊表面相同。与脊比较 的这种观察配置使无法使用的图像的发生率降到最低。脊的第二个表面的存在产生作为暗线存在的图像上的无信号观察部分，所述暗线不包含关于检测靶的信息。如本文在上文说 明的优选实施方案允许观察区的良好检测。此外，在一个可能实施方案中，在2个不同观察角处获取观察区的2个图像，以重 构观察区。装置的优选实施方案及其用于检测的用途在图3中示意性呈现。脊的观察表面必 须是最高光质量的并且优选是完全平坦的。观察表面的角必须在禁止角内，并且从一个通 道到另一个不变，在2个通道之间优选具有小于1°并且甚至小于0.1°差异。通道与观察 垂直运行。每个通道基底的宽度由应用、待使用的制造过程和待获得的检测分辨率控制。优 选地，脊的基底是1至10mm，但可以短至0. 1且甚至0. 01mm。优选地，2个通道之间的距离 是约4mm，并且通道高度是约2mm。固体支持物的尺度优选与标准显微镜载玻片(25x75mm) 对应。在另一个实施方案中，脊通道的尺寸极小，在2个通道之间具有小于4mm的距离， 并且甚至小于Imm且甚至小于0. Imm或甚至小于0. 01mm。在另一个实施方案中，脊通道很大，在2个通道之间具有大于4mm的距离，并且甚 至大于10且甚至20mm。增加脊通道尺寸的后果是脊高度的相应增加以及支持物厚度的增 加。在一个优选实施方案中，脊的角(β)等于90°。在另一个实施方案中，表面和脊 的侧面之间的角(Y)等于25° +/-5°，并且脊的角(β)等于90° (图3)。在测定法的优选配置中，从支持物中的靶发射的光以90°加或减5°的角达到支 持物的外表面。这种配置减少在来自支持物的光的出口处发射光的折射。在另一个实施方案中，当从支持物中的靶发射的光在来自支持物的光的出口处折 射时，检测装置的角(Qobout)可以不同于在支持物内的观察角(eobin)，如图1中例示 的。θ obout因此等于或小于θ obin，并且必须就来自支持物的光的折射进行校正(参见 实施例1)。在另外一个优选实施方案中，观察角和与观察表面相对的脊表面相同。照相机在 与观察表面相对的脊表面成一直线。在另一种配置中，脊的基底具有与在其上固定有捕获分子的斑点相同的间距。图 4呈现在多孔形式装置中在多重测定法中用于观察靶的相同脊通道结构。在本发明的方法和仪器的一个优选实施方案中，固体支持物表面在高于85°C的温 度下维持平坦，并且固体支持物在用于检测靶的激发和发射波长下显示低的自身荧光。在该方法和装置的一个优选实施方案中，固定有捕获分子的光学透明的固体支 持物优选是有机或无机的，光学透明的材料例如玻璃、石英、硅、塑料例如聚碳酸酯、丙 烯酸聚合物、聚苯乙烯或环烯烃聚合物，优选Zeonex 或Zeonor (Zeon Chemicals, Louisville, USA), Topas, Udel、Radel或THV。再优选地，支持物具有高于水的折光指 数。非限制性例子是具有高于玻璃的折光指数范围的下述支持物精制(1.50-154)或非 精制(1.48-1. 75)Crown 玻璃、精制(1.60-162)或非精制(1.52-1.92)的 Flint Glass、 PMMA (1· 49)、PET (1· 57)、Polycarbonate (1· 58)、丙烯酸玻璃(1. 49)、硅(4.01)。在一个优选实施方案中，靶在小于500nm且更佳小于IOOnm且甚至小于50nm的距 离处结合至固体支持物上固定的捕获分子，从而使得发射光的部分是在固体支持物内发射
17的消散光。捕获分子优选结合至固体支持物表面或以阵列形式的固体支持物上存在的底物。 捕获分子的结合优选是共价键。用于结合捕获分子的方法在本文中作为非限制性例子给出 的 Zammatteo 等人(2000, Analytical Biochemistry 280，143)中描述。捕获分子优选是蛋白质或核酸或核酸衍生物例如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)， 其能够与特定核酸例如DNA或RNA多核苷酸序列结合。靶也优选是蛋白质或核酸或其衍生 物。在一个优选实施方案中，生物靶分子选自核酸或蛋白质。优选地，蛋白质选自抗 体、抗原、配体、受体。 在另一个实施方案中，温度控制系统适合于在这样的盐和温度条件下执行靶结合 至其捕获分子，例如多核苷酸序列的杂交，所述盐和温度条件必须进行优化，以便获得靶在 其特定的捕获分子上的特异性结合，而无其他无关多核苷酸的显著结合。在本发明的方法和仪器的一个优选实施方案中，包括靶分子的溶液温度保持恒 定，其中温度变化小于5°C、优选小于1°C。在另一个实施方案中，包括靶分子的溶液的温度根据预定时间模式逐渐升高或降 低。例如，温度可以每10分钟逐步升高5°C，以允许观察杂交靶分子的解离。光照射在本发明的方法和仪器的一个优选实施方案中，光源产生光束用于将光导向固体 支持物表面上。在一个优选实施方案中，激发光激发扩增核苷酸序列上存在的标记，并且通过优 选包括CCD照相机的检测器检测发射的信号。当捕获分子固定在以阵列形式的固体支持物上时，所述阵列占据固体支持物上的 特定表面，结合靶的同源检测是特别关键的。结合靶的激发应高度一致和/或恒定，无论它 在固体支持物上的位置在什么地方。同源激发通过同质照射最佳获得。同源激发可以例如 使用本文公开的仪器获得。在一个优选实施方案中，通过在限定位置处具有固定的捕获分子的支持物表面接 受的光在2个位置内改变不超过10 %，并且优选不超过5 %。在一个优选实施方案中，将光束导向背侧，在与具有固定的捕获分子的表面相对 的表面处到达支持物。在另一个实施方案中，将光束导向前侧，在具有固定的捕获分子的表面处到达支 持物。在另外一个优选实施方案中，光束以90°加或减10°且更佳加或减5°的角到达 具有固定的捕获分子的支持物表面。在另一个实施方案中，光束到达与具有90°加或减10°且更佳加或减5°的角的 外部介质接触的支持物表面。在另一个实施方案中，在激发光和透明支持物之间的入射角等于布鲁斯特 (Brewster)角。在这个实施方案中，激发光与入射平面偏振平行。在另一个实施方案中，照明是立刻照射捕获分子结合在其上的支持物的整个表面 的单色光。
在一种优选方法中，通过聚焦在阵列表面上的激光束获得结合靶的激发。在另外一个优选实施方案中，扫描方法是包括针孔的共聚焦方法。在一个优选实施方案中，照明光束小于捕获分子固定在其上的支持物表面，并且 束扫描表面。用于检测信号的装置包括照射捕获分子固定在其上的不溶性固体支持物的光源。优选地，扫描仪使用激光束，包括共聚焦扫描方法并且还优选包括针孔。光源产生 光束以激发支持物上的标记靶。在一个优选实施方案中，激发光具有与标记的最大激发波长相对应的波长，加上 或减去20nm。在另一个实施方案中，检测光具有与通过标记靶发射的光的最大波长相对应 的最大波长加上或减去20nm。在一个特定实施方案中，该方法和仪器使用2个波长用于读取信号，一个与从靶 发射的光的波长相对应，并且另一个相差至少IOnm且更佳30nm且甚至更佳50nm。随后处 理来自2个读数的信号，以便测定本底值且能够校正来自非特异性信号的特异性信号。这 个设置允许关于非特异性本底的良好校正，当与聚合材料一起工作时特别有用。在一个特定实施方案中，该方法和仪器使用2个或更多波长用于激发和/或发射 检测光，以便能够检测用不同荧光物标记的2种或更多靶。在本发明的方法和仪器的另一个实施方案中，光源产生固体支持物表面的消散激 发。在一个优选实施方案中，支持物表面相对于光束固定。在另一个实施方案中，支持 物相对于光束或光源移动。光源优选是产生以约15mW的功率递送的、具有约532nm波长的、具有可能低于 1. 2mrad的发散的束的激光器。在另一个实施方案中，光源优选是产生具有包括在639和 659nm之间的波长的束的激光器。在另一个实施方案中，光源优选是产生具有包括在733和 753nm之间的波长的束的激光器。通过激光器产生的激光束优选是几乎平行且几乎高斯的(Gaussian)。优选使用 可交换激发滤波器以仅收集目的波长。另外的滤光轮用作弱化滤波器以精确调节激光器功 率。这个滤光轮可能在各种已知吸收水平上不同遮光。抗反射包被的透镜优选用于使激光 束聚焦到微阵列上。光源、透镜和支持物之间的距离是可变的，以允许聚焦。其后，光经过 二色镜。这个镜子优选通过具有激发光波长的光，但反射具有大于发射光波长的光。因此， 来自激光器的光经过二色镜到支持物。光随后经过第三个室且到达支持物表面，在其中结 合的标记靶被激发且发出荧光。发射的荧光通过选择用于放过大于发射光波长的波长的发射滤波器传送。优选 地，发射的光经过物镜用于放大图像样品。发荧光的光随后聚焦至光倍增管用于检测其中 存在的光子数目。在一个具体实施方案中，加入传送具有大于发射光的波长的光的另外发 射滤波器。因此，光倍增管基本上仅检测发荧光的光。光倍增管对于检测的每个光子产生 脉冲。这些脉冲各自扩增且通过光电效应转变成电子信号。数据采集板随后收集所得到的 信号。光源优选是平行的准时光(collimated punctual light)或线性单色光。在一个 优选实施方案中，光源得自气体激光器，例如氩激光器。
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优选地，线性源通过使用光学纤维丛获得，如由Aurora PhotonicsInc. (26791 West Lakeview,Lake Barrington,USA ；infoiauroraphotonics. com)提出且如美国专利号 6，620，623 (其在此通过引用合并入本文)中公开的。平行激光源优选是低功率平行激光二 极管或光发射二极管(LED)。优选地，功率范围为约ImW至约25mW。平行激光二极管在特 定波长下，优选在约470nm至约650nm之间发射。备选地，与滤光器偶联的LED也可以用作 照明源。纤维光学丛将光导向具有固定的捕获分子的支持物表面或玻璃底物的背面上。通 过纤维光学丛将光导向玻璃底物的背面，所述纤维光学丛优选通过但不限于下述形成硅 酸硼纤维光导管、石英纤维光导管或塑料纤维光导管或通过另一种合适材料形成的纤维光 导管。纤维光学丛由定位器携带并且展开以形成分别的纤维光学扇。纤维光学扇厚为1个 纤维，各自限定明线或多根光学纤维的线性阵列。纤维光学丛包括提供玻璃底物的一般对 称照射的多根光学纤维。在另一个实施方案中，通过所述光学纤维产生的光在透明支持物内引导通过多重 全内反射。如上所述，透明支持物和探针位于其中的介质就折光指数而言遵循全内反射条 件。在这些条件下，消散场在透明介质表面处存在。消散场的穿透深度具有与波长相同的 数量级，对于可见荧光约为数百纳米。因为与透明支持物上附着的探针结合的标记靶包括 在相同数量级内，这导致结合的标记靶的选择激发(诱导消散)，同时位于比消散场的穿透 深度更大的距离处的可溶标记靶不激发，因此通过可溶标记靶造成的本底量是可忽略不计 的。在另一个实施方案中，通过使用发散透镜照射聚焦于支持物表面上的细缝使平行 光散焦获得线性光。检测在一个优选实施方案中，在信号检测过程中固定装置，并且光学系统相对于装置 移动，以扫描微阵列。在另一个实施方案中，入射光源、装置和检测器相对于彼此不移动。在这个实施 方案中，检测方法优选是具有矩阵CCD传感器且在单次采集中收集从靶发射的光的CCD照 才目丰几。Jft禾中的 歹iJii Retiga 4000R Fast 1394Mono Cooled(Qlmaging, Surrey, Canada)。CXD的冷却消除暗电流噪声，并且增强系统灵敏度。固定在这个照相机上的透镜 允许实时监控靶的结合。在一个优选实施方案中，允许发射波长的通带滤波器仅减少来自 激发光的噪声。在一个优选实施方案中，荧光发射通过优选具有帕尔贴(peltier)冷却(_18°C ) 的CXD照相机收集，所述CXD照相机包含具有765x512像素的CXD芯片。像素尺度是 9 μ mx9 μ m,并且CXD传感器的总体尺寸是6. 8x4. 6mm。为了获得最大图像分辨率，阵列定位 尽可能接近于透镜。为了使在CXD芯片上的14mmX14mm阵列传感区成像，放大率必须设为 g = 1/3. 2 ( 4. 6/14mm)。这可以通过使用5mm延长管来实现，所述延长管使得能够使照 相机透镜定位在距离阵列75mm的距离处。在其中CCD以所述角度放置的优选实施方案中，其中仅可以观察到从结合的标记 靶发射的光，通过透镜可见的图像失真可以以几种方式进行校正。一个实施方案是在图 像上应用一维数字伸展，可以使用任何图像处理软件，即Photoshop CS2 (Adobe Systems Inc. , San Jose，USA)。另一个优选实施方案是以等于观察角的角度，但在其他方向上旋转CCD传感器。这个光学处理不与上文描述的数字处理相反改变图像。在另一个实施方案中，装置相对于光学系统移动，以扫描微阵列。从微阵列区域收集数据后，装置如此移动，使得光可以导向至微阵列的不同分散 区域。重复该过程直至微阵列的所有分散区域已扫描。在另外一个实施方案中，光学系统的分辨率是0. 1微米至500微米，并且更优选10 至100微米。在一个特定实施方案中，装置包括选自下述的材料或由选自下述的材料制成 玻璃、聚合物及其混合物。聚合物优选选自聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、环烯烃共聚物 (COC)、环烯烃聚合物(COP)及其混合物。在另外一个具体实施方案中，环烯烃聚合物优选 是 ZEONEX 330R 或 ZEONOR (Zeon Chemicals，Louisville，USA)、Topas、Udel、Radel 或 THV。在一个特定实施方案中，透明支持物与棱镜接触，并且放置检测系统接近于棱镜 另外一侧，如图2中所示。使用液体或凝胶来产生棱镜和透明支持物之间的光学接触，所述 液体或凝胶具有与所述棱镜和透明支持物的折光指数接近的折光指数。在上文描述的实施 方案中，关于Zeonex的折光指数等于1. 51，由玻璃制成的棱镜具有1. 50的折光指数，所述 液体可以例如是甘油(折光指数等于1. 47)。还可以使用光学凝胶例如硅酮橡胶。在一个特定实施方案中，装置包括下述部分具有在其上结合有探针的表面的透 明Zeonex载玻片(500μπι厚)。这个部分优选进行官能化，以促进所述探针的结合。这个 部分用第二个部分密封；所述第二个部分由黑色Zeonex塑料制成并且很薄，以允许与这个 第二个部分直接接触的加热元件之间的良好热传递。这个第二个部分进一步包括2个注 入孔，允许将包含可溶标记靶的样品注入室内，所述室通过所述2个部分之间的空间形成。 所述注入孔在注入样品后进行紧密密封，通过例如铝箔或温度抗性粘合剂，或通过使用可 以夹在所述注入孔内的的整合塞，通过在所述塞上安装的由弹性体制成的0型圈确保紧密 性。通过所述2个部分形成的室优选具有100 μ 1的容积。由所述2个部分之间的空 间形成的杂交室尺度优选是2x2cm且厚330 μ m。用于检测的光学系统包括下述部分_可以是如上所述的激光器或二极管的光源-可以是如上所述的透镜、激发滤波器、发射滤波器、偏振器、缝隙以产生所需光照 系统的光学元件_记录通过传感器测量的光强度且作为激发定位的函数贮存其的计算机贮存系 统。-移动所有光学系统且激发在透明支持物表面上的另一个位置的变换器系统，导 致通过传感器测量的与不同位置对应的不同强度-驱动整个系统且在透明支持物的另一个位置处重复所有测量步骤的软件。结果 是与支持物表面上的位置对应的强度的函数，并且允许产生与表面上的探针结合的标记靶 的二维图像。在一个优选实施方案中，结合靶的检测在包括靶分子(可溶靶分子)的溶液存在 下进行，所述溶液包含在封闭的室中。
在一个优选实施方案中，该仪器进一步包括能够改变所述溶液温度的加热元件， 从而使得靶和捕获分子之间的结合反应成为可能。优选地，加热元件适应溶液温度，以使与 所述靶物质和所述探针之间的结合达到最大。在另一个实施方案中，加热元件能够使所述溶液的温度循环，从而使得扩增反应 成为可能。温度控制系统可以是受控的帕尔贴元件，以在光学级别聚酯片如来自Minco的 Thermal-Clear 的透明加热器之间的模式导入的微细线加热元件，或在温度调节流体外部 循环的流体系统。温度控制系统由主动温度控制系统和温度控制单元组成，允许精确调节 温度且执行温度循环。软件在一个优选实施方案中，使用微阵列图像分析包例如Image 7. 0 (Biodiscovery, El Segundo，CA，USA)或 Gen印ix 6. O (MolecularDevice, Sunnyvale, CA, USA)分析所述二 维重构图像。与结合靶对应的像素具有比与载玻片本底对应的像素更高的强度。这些像素 通过图像分析软件自动鉴定且与位置各自的靶信息关联。计算所有像素强度的平均值且作 为输出结果给出。在一个优选实施方案中，与根据时间的不同采集对应的每个图像进行定量，并且 使用时间参数分析关于每个靶的信号。在另一个优选实施方案中，关于每个靶的时间结果用于产生动力学数据。在一个优选实施方案中，在采集后立即分析每个图像。探针和检测方法标记相关的检测方法是众多的。适合于在本发明中使用的可检测标记包括可 通过电磁光发射检测的任何组成。不同标记分子的综述在WO 97/27317中给出，所述WO 97/27317在此通过引用整体合并入本文。它们使用已标记的引物获得，或通过在拷贝或扩 增步骤过程中酶促掺入标记的核苷酸或通过在荧光物上的化学反应或通过嵌入试剂随后 为荧光检测(在此通过引用整体合并入本文的WO 97/27329)。荧光物可以通过化学反应掺 入靶内，例如具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的荧光染料与靶的胺基团的反应。在本发 明中有用的荧光染料包括花青(cyanine)染料(Cy3、Cy5, Cy7)、荧光素、德克萨斯红、罗丹 明、绿色荧光蛋白或 Alexa 染料(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。优选标记是荧光物，其通过荧光检测器以高灵敏度进行检测。荧光物包括但不 限于适合于通过使用商购可得的阵列扫描仪(如可从例如General Scanning, Genetic Microsystem获得的)分析阵列的花青染料(Cy3、Cy5和Cy7)。优选地，关于花青苷 (cyanin) 3的激发波长包括在540和558nm之间，在550nm处具有最大值，并且发射波长包 括在562和580nm之间，在570nm处具有最大值。优选地，关于花青苷5的激发波长包括在639和659nm之间，在649nm处具有最大 值，并且发射波长包括在665和685nm之间，在670nm处具有最大值。优选地，关于花青苷 7的激发波长包括在733和753nm之间，在743nm处具有最大值，并且发射波长包括在757 和777nm之间，在767nm处具有最大值。在一个优选实施方案中，选择荧光物以便与激发波长反应，所述激发波长高于 600nm且甚至高于650且甚至高于700nm。高波长的激发和发射减少大多数聚合物材料的
22固有荧光本底，所述聚合物材料优选用作固体支持物。在一个优选实施方案中，优选在与捕获分子结合的靶上存在的荧光团而不是溶液 中存在的荧光团上的那种上存在获得荧光团分子的激发，优选通过聚焦在阵列表面上的激 光束。在一个优选实施方案中，靶分子用选自下述的染料进行标记荧光的、发磷光的、
量子点。在另一个实施方案中，靶分子用使照射光散射的颗粒或分子进行标记，所述颗粒 或分子优选选自金颗粒、金属沉淀物、非金属沉淀物。发射光是散射的光发射的结果。在一个优选实施方案中，靶分子用金颗粒进行标记。金纳米颗粒目前是可用的，并 且它们可以容易地固定至分子如蛋白质。例如，在市场上可获得抗生物素抗体包被的金颗 粒或链霉亲和素包被的金颗粒。根据本发明的一个优选实施方案，使用随后由缀合物识别 的标记靶分子。这种标记分子(生物素、半抗原等)可以视为结合对的第一个成员。对于 DNA,通过在其扩增过程中掺入生物素化核苷酸容易地完成标记。对于RNA，生物素化核苷酸 用于其在cDNA中的拷贝或其后在扩增步骤中。核苷酸序列的扩增是常见实践，因为靶分子 通常以极低浓度存在。使用NHS-生物素或其他反应容易地标记蛋白质。一旦捕获生物素 化分子，就加入抗生物素抗体(或链霉亲和素)金络合物，其是结合对的第二个成员，并且 抗体(或链霉亲和素)识别生物素，从而使得络合物固定在其中结合靶的位置处。有利地，金颗粒催化银离子(Ag+)化学还原成金属银(Ag)，其在与微阵列结合的 靶分子位置处沉淀，如WO 00/72018中提出的。有利地，在胶体金的存在下银的还原允许在 距离与其捕获分子结合的靶分子不超过数微米的距离处形成沉淀物。沉淀物具有随着时间 达到约Iym直径的小晶体形式。这些小晶体的形成代表信号的实际扩增，因为它们源于直 径数nm的金颗粒的存在。常规操作是，在导致金属沉淀物在阵列元件上的金属沉淀的反应开始后特定时 间，在所述阵列元件上已发生靶和捕获分子之间的相互作用，获取图片或图像并且对测量 的灰度值指定浓度，这依赖于沉淀程度。然而，这个操作仅导致关于在非常狭窄的浓度范围 中的每个阵列元件的满意值。关于这点的原因是沉淀物形成是高度非线性的。特别地，沉 淀的时间过程包括随着时间的指数升高，随后为饱和平台期。仅来自指数增加期的灰度值 允许与结合靶的量关联。关于阵列元件的饱和平台期依赖于靶浓度，并且因此对于阵列的 每个元件在不同时间达到。为了增加沉淀反应的动态范围，可以执行沉淀物形成的时间过程。本发明的方法、 仪器、装置和试剂盒特别良好地适合于检测沉淀物形成，如实施例4中提供的。在一个优选实施方案中，跟踪在金颗粒的存在下金属的催化还原动力学。在另一个实施方案中，跟踪在底物的存在下酶的催化反应动力学。可以根据使用 的底物以比色法或化学发射光来进行检测。某些荧光标记可能是特别感兴趣的，例如具有荧光性质的纳米晶体颗粒。最常见 的是量子点(Han等人，2001 ,Nature Biotechnology，19，631)。它们是荧光的，并且不随着 时间或照明而漂白。它们的稳定性使得它们特别适合于在连续读取中使用，如本发明中提 出的。此外，它们包含对这些颗粒赋予特定性质的金属，从而使得除荧光外的其他方法可以 用于监控其与捕获分子的附着。这些颗粒的热加热(thermal heating)是可以随着时间监控的参数之一。金属吸收光束优选激光束的能量且诱导颗粒加热的事实，已用作检测支持 物上的低密度金颗粒的基础，并且甚至检测出单个颗粒(Boyer等人，2002，Science, 297, 1160)。该方法称为光热干涉差。在一个特定实施方案中，与溶液中自由移动的分子比较，在作为DNA双螺旋的捕 获分子上杂交的结合分子显示在各向异性中的差异。各向异性依赖于待检测的荧光物的流 动性和寿命。在一个特定实施方案中，荧光团分子的检测还包括时间分辨过程。荧光分子具有 与发射过程相关的荧光寿命。关于小荧光团例如荧光素和罗丹明的一般寿命在2-10纳秒 范围中。时间分辨荧光(TRF)测定法使用长寿命(> 1000纳秒)荧光团，以使测定信号与 短命干扰区分，所述短命干扰例如具有小于IOns的较短寿命的矩阵或荧光样品的自体荧 光。寿命优选通过附近存在有另一种荧光团或猝灭剂而进行调节，由于所述荧光团或猝灭 剂发生共振能量转移。用于TRF的器械简单地延迟发射的测量，直至短寿命荧光已逐渐消 失后且长寿命报道荧光仍持续时。可以以2种基础方式测定荧光寿命。时域技术使用极短 脉冲(皮秒)的激发，并且随后经过纳秒寿命实时监控发射。使衰变曲线与指数拟合产生 寿命。频域技术以兆赫频率调节激发，并且随后观察应答中的发射强度波动。相延迟和振 幅调节随后可以用于测定寿命。在一个特定实施方案中，在溶液中的扩增子荧光信号被猝灭，并且与杂交靶 相较更低。引物用这样的荧光物进行标记，当在溶液中游离时所述荧光物是荧光的， 并且当掺入扩增子内时是猝灭的。荧光猝灭优选通过使用在第二条非荧光扩增子链 内掺入的猝灭剂来获得，所述猝灭剂例如但不限于Dabcyl。一个具体实施方案使用 Plexor Technology (Promega)。这种技术利用2种经修饰的核苷酸之间的高度特异性相互 作用异鸟嘌呤(iso-dG)和5'-甲基异胞嘧啶(iso-dC)。在实时PCR反应中，合成在5' 末端处具有iso-dC残基和荧光物的一种引物。第二种引物是未标记的。修饰以包括Dabcyl 作为猝灭剂的iso-dGTP核苷酸包括在反应混合物中。在扩增过程中，仅在与iso-dC残基 互补的位置处掺入Dabcyl-iso-dGTP，并且由于2个残基之间的紧密接近，荧光猝灭。携带 荧光物的一条扩增子链在捕获分子上的杂交将恢复荧光发射。在一个备选实施方案中，通过在溶液中存在和在捕获分子上固定的扩增子之间的 荧光激发最佳波长中的差异获得溶液中的扩增子较低信号。在另外一个实施方案中，通过 在溶液中存在和在捕获分子上固定的扩增子之间的荧光发射最佳波长中的差异获得溶液 中的扩增子较低信号。优选地，通过荧光共振能量转移(FRET)获得荧光发射波长中的差异。在一个具体 实施方案中，引物用具有给定最佳荧光发射波长的荧光物(Fl)进行标记，并且充当在溶液 中在其激发波长下激发时是荧光的供体。引物在荧光物受体(F2)附近掺入扩增子内导致 与荧光物Fl不同的最佳荧光发射波长。通过检测在与Fl的最佳发射对应的波长处的荧光 发射，信号将对于杂交的扩增子是最佳的，并且对于溶液中存在的扩增子将是较低的。特别 地，合成在5'末端处具有iso-dC残基和荧光物供体(即，TAMRA)的引物，并且溶液包含修 饰以包括荧光物受体(即，Cy5)的Iso-dGTP核苷酸。在PCR反应过程中，用紧密接近的2 种荧光物形成扩增子，如先前对于Plexor Technology(Promega)说明的。随后使用对于 供体最佳的激发/发射波长执行检测。由于供体和受体之间的紧密接近，检测出的荧光在溶液中减少。携带供体的扩增子链在捕获分子上的杂交将恢复最佳荧光发射。阵列靶分子的检测在固定的捕获分子上进行。捕获分子优选以微阵列形式固定。在一个优选实施方案中，在相同测定法中检测和/或定量在溶液中存在的1至 1000种靶分子、优选1至100种靶分子、更优选1至20种靶分子。在本发明的方法和仪器的一个优选实施方案中，固体支持物包括根据微阵列在其 表面的限定位置中固定的多重捕获分子。在另一个实施方案中，微阵列包括超过5种不同的捕获分子、优选超过20种且甚 至超过50种。在另一个优选实施方案中，其中限定位置的发射表面包括在Iym2和Imm2之间。在微阵列上，将捕获探针排列在限定和/或预定的位置处，以至少4、10、16、20、 50、100、1000、4000、10 000种或更多种不同捕获探针/cm2不溶性固体支持物表面的密度。 捕获探针有利地通过其末端之一，优选通过其5'末端与固体支持物的表面共价附着(优 选无孔固体支持物表面)。通过经由机器人根据微阵列以高密度将捕获探针点样在固体支 持物表面上，可以进一步增加灵敏度。在微阵列上点样的捕获探针量优选包括在约0. 01至 约5皮摩尔序列当量/cm2固体支持物表面之间。捕获分子优选是多核苷酸或蛋白质。在一个实施方案中，分子是多核苷酸序列，其捕获部分优选包括在约10至约1000 个碱基之间、优选在约15至约100个碱基之间并且更优选在18至30个碱基之间。这些碱 基优选指定为位于捕获探针处或附近的邻接序列(核苷酸序列)。这个序列被视为用于检 测靶核苷酸序列的特定序列。在另一个实施方案中，捕获分子包括具有10至100个核苷酸的特定捕获部分的多 核苷酸序列和间隔物部分(接头)，所述特定捕获部分与待检测的特定靶序列互补。在一个优选实施方案中，捕获多核苷酸序列包括10至100个核苷酸的捕获部分，其与靶扩增子的特定序列互补，从而使得所述捕 获分子限定扩增子的2条非互补末端，和-具有至少20个核苷酸的间隔物部分，并且其中扩增子的2个非互补末端分别包 括间隔物末端和非间隔物末端，从而使得间隔物末端与捕获核苷酸序列的间隔物部分不互 补，并且所述间隔物末端超过所述非间隔物末端至少50个碱基。在一个优选实施方案中，间隔物部分是这样的多核苷酸，其长为至少约20个核苷 酸、至少约40或约70个核苷酸、且优选长为至少约90个核苷酸。间隔物部分是与基因组序 列任一个不同源(当使用至少10个且更佳5个连续碱基的同一性时)的给定核苷酸序列。 为了避免非特异性杂交，在靶多核苷酸(或核苷酸)序列和间隔物部分之间将存在不超过 约15个连续互补碱基对结合，优选地将存在小于10个此种配对可能，更优选小于5个。像 这样，间隔物部分的核苷酸序列将优选包含与待检测的靶核苷酸序列互补的小于15个碱 基、并且更优选小于10个且更加优选小于5个邻接碱基。可能的连续序列的测定如下容易 地完成通过序列与如由Genbank提供的分子数据库的比较，并且使用软件例如核苷酸-核 苷酸 BLAST (blastn) (http //www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)。间隔物部分优选位于捕获核苷酸序列的5'末端处，所述捕获核苷酸序列通过在5'末端处或附近存在的共价键固定至固体支持物表面。捕获部分优选位于捕获核苷酸序 列的3'末端处(不与支持物结合的游离末端)在距离末端1至23个核苷酸处。用于多核苷酸检测的捕获分子长度必须根据应用、测定法的所需特异性和灵敏度 进行最佳化和设计。包括间隔物部分的可能存在的捕获探针(核苷酸序列)总长度包括在 约30至约800个碱基之间、优选在约35至约200个碱基之间、更优选在约39至约120个 碱基之间。在本发明的另一个优选实施方案中，捕获探针(核苷酸序列)是约100个碱基的 化学合成的寡核苷酸序列，这可以例如在程序化的自动合成仪上容易地执行。此种序列可 以具有用于以高浓度在支持物上共价附着的官能化基团。更长的捕获核苷酸序列优选通过 掺入质粒内的序列的PCR扩增进行合成，所述质粒包含捕获核苷酸序列的捕获部分和间隔 物部分。应用在一个优选实施方案中，本发明通过检测其基因组的部分用于鉴定和定量生物 体。此外，本发明用于检测生物体或细胞或组织的表达基因。表达基因以mRNA的形式存在， 所述mRNA随后拷贝成cDNA，并且用作靶用于在捕获分子例如在微阵列上的扩增或直接检 测。此外，生物体的基因组可以就突变(单核苷酸多态性或SNP)或缺失的存在进行检查。在本发明的装置中使用的基因扩增步骤通过本领域众所周知的扩增方案来进行， 优选通过选自 PCR、RT-PCR、LCR、CPT、NASBA, ICR 或 Avalanche DNA 技术的方法。在本发明的方法和仪器的一个优选实施方案中，包括靶分子的溶液接受具有至少 2个且优选3个不同温度的温度循环。优选地，温度循环是产生PCR的那些。在一个优选实施方案中，在存在包含扩增的核苷酸序列的溶液下执行信号读取。 在另一个实施方案中，在不存在包含扩增的核苷酸序列的溶液下执行信号读取。在另一个特定实施方案中，该方法用于执行特定靶结合至捕获分子上的动力学。 在这个实施方案中，由在2次不同温育时间时获得的至少2个数据计算速率常数。在一个 特定实施方案中，速率常数用于定量溶液中存在的靶。在一个特定实施方案中，本发明的本方法进一步包括计算靶与其捕获分子的结合 常数步骤。该方法特别用于评估特定抗体或配体针对其受体的结合常数。本发明的方法特别适合于平行执行多重测定法，并且优选与多孔形式相容。在本发明的方法和装置中，同时处理几个分开的观察区。优选地，观察区由彼此相 距与多孔形式中的24、96、384或甚至1536个孔的距离一致的间距的表面组成。优选地，观 察区彼此相距18、9、4. 5或甚至2. 25mm。在一个优选实施方案中，与具有固定的捕获分子的 观察区比较，一系列脊通道存在于支持物的对侧上。在另一个实施方案中，适合于接受捕获分子的观察区定位于与固定的捕获分子比 较的支持物的对侧上存在的脊通道上。此种实施方案的例子在图3和4中示意性呈现。生物体鉴定—种优选应用是在潜在包含来自其他生物体的至少4种核苷酸序列的样品中检 测生物体或其部分，所述过程包括步骤a)通过至少2个PCR循环，使来自所述生物体或其 部分的DNA扩增成双链靶多核苷酸序列，使用能够扩增来自所述5种生物的至少DNA序列 的一个或多个引物对；b)使所述靶核苷酸序列与单链捕获分子接触，所述单链捕获分子在
26阵列的位置中与不溶性固体支持物共价结合，并且其中所述捕获分子包括10至600个碱基 的捕获部分，其能够与所述靶核苷酸序列特异性结合而不与来自其他4种生物体的所述核 苷酸序列结合；和c)检测所述靶核苷酸序列与所述捕获分子的特异性杂交。SNP本发明的装置特别适合于鉴定在不同基因基因座处存在的多重单核苷酸多态性 或多重突变(多重SNP)。优选地，在相同微阵列上获得所述检测或表征。在一个优选实施方案中，在装置中待检测的核苷酸序列是核苷酸碱基或SNP。在第一个步骤中，使用至少一个引物对(即，2种不同引物的对)扩增基因的核苷 酸序列。然而，使用几个引物对用于扩增基因的不同特定核苷酸序列，这些序列优选是不同 外显子，或用于扩增细胞基因组的不同基因或不同部分。优选地，每个扩增的靶序列包括几个基因座。随后用相同引物对扩增靶的所有这 些基因座，所述引物对是用于扩增所有这些基因座的通用引物，但每个基因座在特定捕获 探针上检测出。因此，微阵列包含对于一个或多个基因座特异的捕获探针，用于与包括在每个基 因座中的待检测SNP的一个或多个靶核苷酸序列杂交，不同突变碱基位于源于相同基因或 不同基因的相同外显子或不同外显子中，优选存在于相同核苷酸序列中。这几个外显子的 扩增步骤优选用不同引物对获得，每个引物对对于一个外显子特异。几个外显子的扩增优 选以对于PCR室中的所有外显子相同的条件执行。具有待检测的可能突变的基因或基因组序列(基因座)的部分(或局部)可以 首先通过PCR进行扩增，并且所得到的扩增子通过DNA酶处理而片段化(Grimm等人2004， Journal of Clinical Microbiology，42，3766-3774)。在一个优选实施方案中，所得到的 扩增子片段长为30至70个碱基。有利地通过经由毛细管电泳(Bi0analySer，Agilent)的 分析检查在扩增子片段化后获得的片段大小的分布，并且小片的平均大小分布优选包括长 为30至70个碱基之间。捕获探针优选相差位于从结合捕获探针的靶特异性部分(局部)的(游离)3'末 端的4至10且4至6个碱基处的一个碱基(SNP)。阵列可以包含关于待检测的特定基因座的每个碱基的特定捕获核苷酸序列。待检 测的碱基存在于相同基因核苷酸序列的一个或多个外显子内或来自不同基因核苷酸序列。在一个优选例子中，阵列包含特定捕获探针用于检测人细胞色素P450 2C9、2C19 和2D6中的SNP。阵列可以包含特定捕获探针用于检测一个基因核苷酸序列中的数个SNP，或阵列 可以包含特定捕获探针用于检测不同基因核苷酸序列中的数个SNP。靶核苷酸序列在扩增步骤过程中进行标记。标记的相关检测是众多的。不同标记 分子的综述在WO 97/27317中给出。它们使用已标记的引物或通过在扩增步骤过程中掺入 标记核苷酸获得。Ag/Ab该方法在同质测定法的解决中也是特别有用的。特别感兴趣的是抗体/抗原反应，其中可以在相同溶液中跟踪且测量抗体(或相 反抗原)在其抗原上的结合。本发明避免了如目前在常规ELISA方法中执行的洗涤和处理步骤。在一个优选实施方案中，测定法是用以阵列形式固定在孔表面上的抗体(或抗原)的 多重检测，如美国申请10/723,091中描述的。抗体或抗原可以容易地点样在活化玻璃上， 并且以斑点的形式存在，所述斑点随后用于与其为抗原、抗体或配体或受体的特定靶反应。在一个特定实施方案中，测定法与待检测的蛋白质是抗原或抗体的ELISA测定法 相当。反应如对于ELISA测定法一样发生，并且通过适合于测定法检测的方法之一进行检 测，所述方法包括但不限于荧光、生物发射光或比色法。实时PCR本发明的一个实施方案是在一个过程中使实时PCR连同在捕获探针上的杂交相 组合，用于鉴定靶分子或生物体。本发明还包括用于执行实时PCR扩增和检测的方法、装置 和仪器。优选地，用于鉴定和定量样品中的生物体或生物体部分的实时PCR过程包括在封 闭装置中扩增来自所述生物体或其部分的核苷酸序列的步骤，在至少一个引物对和至少一 种捕获分子的存在下，所述引物对对于待鉴定和定量的核苷酸序列特异，所述捕获分子固 定在封闭装置的内表面上的给定位置处，所述内表面通过光学透明的固体支持物与外表面 分开，其中所述固体支持物具有比捕获分子位于其中的介质的折光指数更高的折光指数， 并且其中所述捕获分子包括能够与扩增产物特异性杂交的10至2000个碱基，并且优选10 至600个碱基且更优选15至100个碱基的捕获部分。溶液中扩增子的存在通过在扩增操 作过程中杂交至其各自的捕获分子上的扩增子的测定进行检测，通过检测由于如由本发明 提供的通过照射光束激发靶分子从靶分子发射的光。检测优选在每个PCR循环后执行，如 例如在复性步骤过程中或在整合入PCR的3个温度步骤内的微粒杂交步骤中。优选地，通 过所述光学透明的固体支持物以观察角检测发射光，其中所述观察角相对于所述固体支持 物表面的法线进行测量，并且对于与发射光对应波长的光束包括在临界角和90°之间，其 中结合靶通过所述支持物的所述发射光是消散耦合的结果，并且其中检测出的发射光在透 明支持物内并不全内反射。在一个优选实施方案中，该过程在相同溶液和相同封闭装置中和/或用系统机器 装置进行。优选地，光学透明的固体支持物包括封闭室用于在包括靶分子(可溶靶分子) 的溶液的存在下检测结合靶。例如，在一个过程中使实时PCR连同在捕获分子上的杂交相 组合，用于在相同室中并且用相同封闭装置鉴定靶分子或生物体。封闭装置意指溶液不与 装置外部流动接触。装置可以包括连接在一起的几个元件如室，但总体装置在用于在阵列 上的实时PCR的PCR和检测过程中是封闭的，如由本发明提供的。优选地，使PCR和实时检 测相组合用于定量靶的方法如EP 1788097中所述执行。优选地，装置如EP 1788095中提 出的进行制备，伴随用于本发明的合适修改。在一个优选实施方案中，该过程允许在相同样品中存在的可能4种其他生物体或 生物体部分存在下扩增和特定检测生物体或生物体部分。在另一个实施方案中，至少一个引物对能够扩增来自其他生物体的至少4种核苷 酸序列，以便产生扩增产物。在另外一个实施方案中，使用至少4个引物对，以便产生多重扩增产物，所述每个 特定引物对与对于至少4种核苷酸序列特异的其他引物对显示小于约80%的序列同源性。在一个特定实施方案中，该装置包括检测具有固定的捕获分子连同PCR反应室的 检测固体支持物；设置该装置以便提供用于在检测室内或在相同装置内执行PCR扩增循环的条件，使得在具有形成的扩增子的溶液和捕获分子之间具有接触，并且能够沿着PCR循 环跟踪扩增子的出现。这是实时PCR的异质检测。在另一个实施方案中，本发明提供了包括反应室和热稳定DNA聚合酶的试剂盒， 所述热稳定DNA聚合酶在约25mM至约300mM之间的盐浓度下活跃。优选地，试剂盒还包 括反应室和/或DNA聚合酶和用于执行多重PCR的混合物，优选QIAGEN Multiplex PCR Master Mix。在一个实施方案中，将用于在阵列上进行PCR扩增和检测所需的诊断和/或定量 功能性的不同部分整合到相同仪器内，以便检测在扩增的PCR循环过程中在阵列的捕获分 子上结合的靶核苷酸分子。读取在捕获分子上结合的核苷酸靶的存在意指检测必须在PCR 其自身步骤之一过程中，或在循环之间的步骤中执行。在一个优选实施方案中的读取要求 对循环添加1个且优选2个步骤，一个是双链扩增子的变性所需的并且另一个用于杂交其 自身。在一个优选实施方案中，用于检测扩增子的捕获探针包含对于待检测扩增子特异 的特定部分和间隔物。优选地，间隔物和捕获探针的特定部分相对于杂交的靶定位，如EP 1788098A1中提出的。本发明还包括用于执行过程的各个步骤所需的机器和仪器，主要用于诊断和/或 定量在样品中可能存在的(微)生物体或生物体部分，其包括a)光学透明的固体支持物，其包括结合在所述固体支持物表面上存在的捕获分子 上结合的至少一种靶分子(结合靶分子)，并且其中固体支持物的折光指数比捕获分子位 于其中的介质的折光指数高；b)产生适合于激发靶分子的波长光束的光源；c)用于测量由 于靶分子的激发从靶分子发射的光的检测器，所述发射光通过所述光学透明的固体支持物 以观察角检测，其中所述观察角相对于对所述固体支持物表面的法线进行测量，并且对于 与发射光对应波长的光束包括在临界角和90°之间，其中结合靶通过所述支持物的所述发 射光是消散耦合的结果，并且其中检测出的发射光在透明支持物内并不全内反射。在一个优选实施方案中，该仪器进一步包括用于热调节的装置。在一个特定实施方案中，该仪器进一步包括能够交替加热和冷却的自动热循环 仪，并且适合于接受包含所述固定的捕获分子的至少一个反应室，和用于核酸扩增的反应 物。在另一个实施方案中，该仪器进一步包括用于将测量信号转化成数字数据的计算 机程序。优选地，计算机程序识别在其中形成信号的阵列位置。在一个优选实施方案中，仪器的检测器包括CXD照相机。在一个特定实施方案中，该仪器进一步包括用于PCR扩增的反应室，从而使得将 在阵列上的扩增和检测整合到一个仪器内，以便在扩增的PCR循环过程中检测杂交的扩增子。在一个优选实施方案中，该仪器进一步包括用于校正图像失真的工具，所述工具 包括圆柱透镜。在另一个实施方案中，该仪器进一步包括用于增加焦点深度的工具，所述工 具包括检测器的捕捉器表面相对于发射光方向的机械倾斜。该仪器可以进一步包括热循环仪，用于执行得自生物体或生物体部分的核苷酸序 列的自动PCR扩增成双链靶核苷酸序列，所述热循环仪能够交替加热和冷却所述支持物用于产生标记靶核苷酸。优选仪器是其中在扩增的循环过程中执行检测的仪器。在一个优选实施方案中， 该仪器用于实时PCR扩增和检测。用于检测信号的装置优选在PCR过程中测量在其捕获分子上的结合的靶核苷酸 序列至少2次、优选5次、更优选超过10次。在一个备选实施方案中，用于检测信号的装置在完成扩增循环后测量在其捕获分 子上的结合的靶核苷酸序列。此种方法导致在阵列上的实时PCR检测。实时PCR提供用于计算初始样品中存在 的靶的特定方法，通过测量检测信号超过阈值或截止值(CT)所需的最小循环数目。在一个备选实施方案中，通过测量达到定义为阈值(循环阈值或CT)的固定值所 需的热循环数目来定量核苷酸分子的量。阈值循环是当系统开始检测与对数线性期过程中 PCR产物的指数增长相关的荧光信号中的增加时。存在用于定量靶序列的量的不同方法。参见例如，ABI UserBulletin, (http:// docs.appliedbiosystems.com/search.taf ？) gJc Τ. Dorak 2006 ( Dorak :Real-Time PCR 中；Advances Method Series, Oxford :Taylor and Francis,禾口 http://www. dorak. info/genetics/realtime, html)。结果可以与绝对标准曲线进行比较。在这个实施方案中，通过使达到固定值(CT) 所需的热循环数目与标准曲线比较来定量核苷酸分子的量，在所述标准曲线中CT针对标 准浓度进行描绘。优选地，标准曲线在相同微阵列上执行。结果还可以与具有用作校准器的实验样品之一的相对标准曲线进行比较。还通过使靶与参考核苷酸分子的CT比较来执行定量。参考核苷酸分子优选在与 靶核苷酸分子相同的溶液中扩增且在相同的微阵列上检测，以便能够具有相似或等同的扩 增效率。装置本发明还包括特定装置，以便能够如本专利中提出的执行本发明。在一个优选实施方案中，本发明包括用于检测和/或定量靶分子的反应物装置， 其包含固定在所述装置的内表面(观察区)上的至少一种捕获分子，所述内表面通过光学 透明的固体支持物与外部观察表面分开，用于沿着其为禁止角的观察角(θ obin)检测靶 分子，并且其中所述固体支持物具有高于1. 33的折光指数，并且其中显微结构例如脊通道 存在于与具有固定的捕获分子的观察区比较的支持物的对侧上。在一个优选实施方案中，适合于接受捕获分子的观察区位于具有一系列脊通道的 支持物表面上，所述一系列脊通道存在于与固定的捕获分子比较支持物的另一侧上。在一 个特定实施方案中，每个脊通道与一个亚阵列对应。在一个优选实施方案中，脊的角(β) 等于90°。在另外一个特定实施方案中，该装置包含彼此相距18、9、4. 5或甚至2. 25mm的 几个分开的观察区。优选地，观察区由彼此相距与多孔形式中的24、96、384或甚至1536个 孔的距离一致的间距的表面组成。还优选地，多孔平板的每个观察区具有用于所述区域的 个别观察的脊通道。在一个特定实施方案中，该装置具有在管的外表部分上存在的脊通道的管形式。 在一个特定实施方案中，该装置具有其中脊通道的表面之一是曲线以便校正图像失真的脊通道。该装置优选用于实时PCR扩增和检测。反应物试剂盒本发明的一个实施方案是在一个过程中使PCR连同在捕获探针上的杂交相组 合，用于鉴定和/或定量在固体支持物上存在的靶核酸。本发明还包括用于执行PCR扩 增和检测的反应物试剂盒。优选地，用于鉴定和/或定量在固体支持物上存在的靶核酸 的反应物试剂盒包括用于扩增和检测和/或定量靶核酸的封闭装置，其包含固定在封 闭装置的内表面上的给定位置处的至少一种捕获分子，所述内表面通过具有至少等于 d/(2tan(9obin))的厚度的光学透明的固体支持物与外表面分开，d是观察区长度，和 (θ obin)观察角，并且其中所述固体支持物具有高于1. 33的折光指数，至少一种核酸引 物；任选地脱氧核糖核苷酸，任选地适合于延伸核酸引物的酶，荧光标记，用于在禁止角中 检测给定位置处存在的扩增产物的工具。在一个优选实施方案中，反应物试剂盒进一步包括用于在所述扩增和检测过程中 密封所述装置的工具。优选地，所述密封工具是装置的整合部分，当将溶液注入装置内时， 其用于封闭装置。整合密封工具易于包装和使用，因为它在由用户接受时已整合到装置内。 它还将提供优选具有多个入口的紧密锁，用于允许样品溶液进入或不进入装置的不同部分 或室内。多个入口优选是注射入口、PCR入口和微阵列室入口。优选地，通过锁相对于装置 的位置安排多个入口。优选地，一个锁位置允许完全封闭和紧密的微阵列室。在另一个实施方案中，与所述观察角(θ obin)对应的支持物厚度至少等于d/ (2tan(6 obin)), d是固体支持物的长度。在一个特定实施方案中，通过使具有相同组成的2种固体支持物连接来获得适合 于在禁止角中检测扩增产物的固体支持物厚度，所述2种固体支持物通过具有与固体支持 物的折光指数接近的折光指数的材料(凝胶、液体、油)分开。
实施例实施例1 用禁止角技术在溶液中存在或不存在Cy3下检测Cy3标记的阵列。根据专利申请WO 02/18288中描述的方法，使Diaglass载玻片(Eppendorf， Hamburg, Germany)就醛的存在进行官能化。遵循这个专利申请中描述的方案用于胺化 DNA至醛衍生玻璃的移植。胺化捕获分子以3 μ M浓度从溶液中点样，除了以300ηΜ点样的 ΒΑΤ-973外。用自制机器人装置将捕获分子印刷到显微玻璃载玻片上，使用250 μ m直径针。 斑点直径是400 μ m，并且分配的体积是约0. 5nl。使载玻片在室温下干燥并且贮存于4°C直 至使用。用包含9 个不同浓度(3 μ M、1 μ Μ、750ηΜ、500ηΜ、250ηΜ、ΙΟΟηΜ、50ηΜ、IOnM 和 OnM) 的Cy3标记的检测对照多核苷酸(SEQID NO 1)的溶液以6次重复对阵列点样(6x12个斑
点)οSEQ ID NO 1 5 ‘ NH2-TACCTACTACGCTACACGAACCTACAAGACAAGATAAAGACAGACTCATG-Cy3 3‘多核苷酸在3'末端处进行Cy3标记且在5'末端处进行胺化。
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还以3 μ M浓度以6次重复点样包括捕获部分和间隔物部分(有下划线的)的Ρ35 特异的5' -ΝΗ2多核苷酸SEQ ID NO 2 5' NH2-ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCG ATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTAGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATAT-3 ‘以及包括捕获部 分和间隔物部分(有下划线的)的对于EPSPS7特异的5' -ΝΗ2多核苷酸SEQ ID NO 3 5 ‘ NH2-ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCG ATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTACTCCTACTCGCCGCCCTGTCCGA-3 ‘。这些多核苷酸是未 标记的。在阵列上的斑点大小是直径约400m。多核苷酸以6次重复点样。在点样后，载玻片在SDS 0.05%中洗涤1x5分钟，在H2O中洗涤Ixl分钟，在 PBS75%和乙醇25%的2. 5mg/ml NaBH4溶液中1x5分钟，随后在H2O中再次洗涤1分钟，和 最后在沸水中1x5分钟。洗涤步骤后，使载玻片在室温下干燥且贮存于黑暗中在4°C下。使Eppendorf杂交室(Hamburg ；Germany)固定在阵列周围，并且充满包含0或 2 μ M的Cy3标记多核苷酸(SEQ ID NO 1)的2001水溶液。如就图2而言说明的，将载玻片放置在等边玻璃棱镜上，在棱镜和载玻片之间具 有一滴87%甘油，以便在棱镜和载玻片之间具有与玻璃相同折光指数的层。将棱镜和载玻片放置在绿色氩激光器(Spectra-Physics 168B具有515nm激发 光，150mff)前。激光束通过使用由2个透镜制成的3. 5x望远镜进行放大(_50mm发散和 175mm会聚相距125mm)，随后经过数毫米宽的宽度可调的缝隙，允许选择载玻片上的目的 区域。在其整个表面上同时激发阵列。使激光器通电3秒，随后关闭，并且用CXD照相机冷却单12比特 (#01-RET-OEM-FM-12-C, Qimaging, Canada)完成在这3秒过程中来自阵列的发射光采集 (以1增益)，所述CCD照相机放置在距离阵列载玻片表面的法线65°的观察角处，在这个 实验设置中这在禁止角内。使CCD 照相机与成像软件(Quantitative Imaging Corporation 的 QCapture 版 本2. 90. 1)偶联。整个系统的图解显示于图2中，除了光学块以棱镜的形式外。阵列的定量使用Maxime DL软件的谱线轮廓来完成。对用充满0 μ M和2 μ M Cy3 多核苷酸的阵列室获得的图像定量分别显示于图5A和5B中。在禁止角中，当定位在禁止 角范围内时，基本上没有在溶液中发射的入射光反射到照相机内。然而，当观察不在禁止角 中时，在阵列的所有区域中获得的信号都是饱和的(65536)，并且它无法检测且定量斑点。这个实施例显示当根据本发明与其捕获分子结合时，靶的检测和定量。还证实即 使在杂交室中在溶液中存在高浓度的Cy3荧光物下(图5B)，阵列也以与在溶液中不存在荧 光探针的情况下获得的那种(图5A)等价的灵敏度进行检测。本发明的一个具体特征是跟踪荧光溶液的存在的可能性，因为它在与阵列物理上 分开的位置中存在于图像上。实施例2:
用禁止角检测技术在线检测固定在玻璃阵列上的特定捕获分子上的杂交过程中 的Cy5扩增子如实施例1中制备阵列(5x11)。SEQ ID NO :1在3'末端处用Cy5进行标记且在 5'末端处进行胺化。点样的多核苷酸是相同的，添加包括捕获部分和间隔物部分(有下划线的)、对金 黄色葡萄球菌特异的在3'末端处胺化的多核苷酸SEQ ID NO 4 5' -AACTGCTGGACTTTTTTTAGGTAAGAGGAATTCAAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGT TGGAA-NH2 3'。在点样后，载玻片在SDS 0. 05%中洗涤1x5分钟，在H2O中Ixl分钟，在 PBS 75%和乙醇25%的2. 5mg/ml NaBH4溶液中洗涤1x5分钟，随后在H2O中再次洗涤1分 钟，和最后在沸水中1x5分钟。洗涤步骤后，使载玻片在室温下干燥且贮存于黑暗中在4°C 下。进行PCR，以用具有这些各自的序列的2个引物(PSauF)和(PSAuRCy5)特异性扩 增金黄色葡萄球菌的扩增子PSauF(SEQ ID NO 5) 5' -GCAGCAGCAATGCGTTA-3‘和PSauRCy5(SEQ ID NO 6) 5' Cy5-GAACCACGACCTGTTTC-3‘。制备1000 μ 1 PCR 混合物，并且包含 PCR 缓冲液 lx(Qiagen, Hilden，Germany)、 200 μ M 的 dATP、200 μ M 的 dCTP、200 μ M 的 dGTP、100 μ M 的 dTTP 和 300 μ M 的 dUTP、0. 1 μ M 的PSauF和0. 2 μ M的PSauR Cy5、20U的Qiagen Taq聚合酶、20U的UNG酶和包含对金黄色 葡萄球菌特异的下述序列的IO6拷贝Mu50质粒VRSAp SEQ ID NO 7 5 ‘ -attttcgccacttaattaggtgctaaaatagcgaattatacgtttggtagttttaggtgtactt ttaattacatttaaaactctttatatacgccattaaaagtgttaatattacttataaatattaaaagagtcgatgct attggcgtagcatcgactctcggtaataaaacgattcgcactcgtttgtttatatatttttttgatacttgtattat atatatctaatcatctaagtgcaagcacaaaacatataacttacgtaaaaattgttttattacctcaatcccaaaat ggaaatgaggtttttattatgcccaattttgaaaaatataatttatcacaagtaaaaactgaaagattttatcaact gcctaaatatttatttgaagatgcatattttaagaaaatgtctgcagaagccaaaattatgtatgcgttattaaaag atcgttttgaattatccctccaaaatgaatgggtagataaaaataataatatttactttattttcagtaataaacat ttgtgtgaatacttaggttatgcagaacaaaaaattataaaattaaaaaaagagttaataaaatttaatttactaac tcaagaacgtgttggccttaataaaccaaatagattatacctattaaaacctaattatgacattgaagccagtcata tcaaggaacttccaaattcacagttccagaacaatgaatttggaagttctagaactgtgaatttaagtggtcaagaa cttccaaattcacagtctaatgatactgattataatgacactgattatattaagactaattataatgatatgtatga tttga-3'.将混合物等分到100 μ 1 PCR管中，并且在Master循环仪PCR机器(Eppendorf)中 用下述程序进行处理22°C 10分钟、95°C 2分钟，随后由3个温度组成的40个循环94°C 30 秒、54°C 30秒和70°C 90秒，随后是在降至4°C前于70°C 10分钟的最后一个步骤。在PCR 后冷冻PCR产物。制备包含 50 μ 1 基因组 Hybribuffer (Eppendorf，Hamburg, Germany) >45 μ 1 蒸馏 水和5 μ 1金黄色葡萄球菌Cy5标记的PCR产物的100 μ 1杂交混合物。
将65 μ 1 (Eppendorf，Hamburg, Germany)的原位框固定在一个玻璃阵列周围，并 且充满65 μ 1杂交混合物，并且随后用塑料盖玻片密封。在杂交室背侧上，固定温度控制的 专门热电偶。完全加热过程测试台由下述相关组分组成-热电偶RS_组分N。219-4321自粘热电偶，型号K-镍铬/镍铝(RS组分， Northamptonshire, UK),-传送器RS-C0MP0NENT N ° 363-0222 传送器温度热电偶 4_20mA (RS 组分， Northamptonshire, UK),-变换器=National器械 779026-01 USB 6009 48 Ksamples/ 秒 DAQ 多功能 14 比 特用于 USB (National Instruments, Austin, Texas, USA)-加热器MINC0加热箔弹性加热器Kapton 0.75〃 χ 0.75〃 ΗΚ5578 R18，3 L12F(Minco, Minneapolis, MN, USA)。使具有室的载玻片与加热块在95°C下接触3分钟用于变性，其中加热盖在95°C下 加热，并且随后与74°角(λ)的玻璃棱镜垂直接触，其中加热盖降至60°C并且固定直至实 验结束时。用在23°C下具有折光指数1. 51的一滴共聚焦显微镜非荧光油(#DIN 58884)完 成载玻片和棱镜之间的接触(Zeiss，Gottingen, Germany)。关于安装装置参见图2。将在其上具有载玻片的棱镜放置在633nm激发激光器(MellesGriot 05-LHP-991，35毫瓦的氦-氖激光器)前。激光束通过使用由2个透镜制成的5x望远镜进 行放大(_50mm发散随后为250mm会聚，相距200mm)，并且随后通过200mm会聚圆柱透镜集 中至垂直线。可以通过改变载玻片和圆柱透镜之间的距离调整宽度和强度，在这个情况下 所述距离等于140mm。使这个激光器每3分钟通电10秒(0、3、6、9、12、15、18、21、24、27和30分钟)，随后 关闭，并且用 CCD 照相机冷却单 12 比特(#01-RET-OEM-FM-12-C，Qimaging, Surrey, Canada) 完成在这10秒过程中来自阵列的发射光的采集(以10增益)，所述CCD照相机放置在距 离阵列载玻片表面的法线69°的角处。使CCD照相机与成像软件(Quantitative Imaging Corporation, Surrey, Canada 的 QCapture 片反* 2. 90. 1) f禹]I^0系统的图解显示于图2中。收集图像，并且在图6中报告3个斑点的定量1个斑点与EPSPS7捕获探针(SEQ ID NO :3，阴性杂交对照，图6A)相对应，1个斑点与金黄色葡萄球菌捕获探针(SEQ ID NO 4，阳性特异性杂交，图6B))相对应，和1个阳性检测对照斑点(SEQ ID NO 1，以3 μ M的Cy5 探针，图 6C))。使用 Imagene 软件程序(Biodiscovery，El Segundo, CA, USA)处理图像定 量。对于每个杂交时间计算在每个斑点中8个像素的循环内的像素信号平均值。显示与杂 交时间相关的这些信号的曲线图显示于图6中。实施例3:沿着不同PCR循环在相同溶液中扩增和检测扩增子制备包含与实施例2中相同的点样多核苷酸的新阵列。如实施例2中所述进行PCR，以用2个引物特异性扩增金黄色葡萄球菌的扩增子。 制备2000 μ 1的PCR混合物，并且包含PCR多重混合物Ix (来自Qiagen，Hilden，Germany)、 150 μ M的dUTP、0. 5 μ M的PSauF和0. 5 μ M的PSauRCy5、和包含对金黄色葡萄球菌特异的 序列的107拷贝Mu50质粒VRSAp。将混合物等分到100 μ 1 PCR管中，并且在Master循环仪PCR机器(Eppendorf)中用下述程序进行处理95°C 15分钟，94°C 2分钟，随后由3个温度组成的40个循环94°C 30 秒、54°C 90秒和72°C 60秒，随后是在降至4°C前于72°C 10分钟的最后一个步骤。在20个 循环、25、30、35和40个循环后从PCR master循环仪中一个一个地取出PCR管。如实施例2中所述使来自每个PCR管的65 μ 1金黄色葡萄球菌Cy5标记的PCR产 物杂交到阵列上。信号在阵列斑点样的杂交、检测和定量与实施例2中相同。在杂交2分 钟后获取信号。收集图像，并且在图7中报告关于3个斑点的1个重复的定量1个斑点与EPSPS7 捕获探针(SEQ ID N0:3，阴性杂交对照，图7A)相对应，1个斑点与金黄色葡萄球菌捕获探 针(SEQ ID NO :4，阳性特异性杂交，图7B))相对应，和1个本底斑点使用Imagene软件程 序(Biodiscovery，El Segundo，CA，USA)进行处理。对于不同PCR循环计算在每个斑点中 8个像素的循环内的像素信号平均值。从信号中扣除本底斑点信号。显示在包含来自不同 PCR循环的扩增子的不同杂交反应中对于阴性杂交的1个重复(图7A)和对于特异性金黄 色葡萄球菌阳性杂交的1个重复(图7B)获得的信号的曲线图显示于图7中。实施例4 用禁Ih角检测技术在线检测结合在玻璃阵列上的金标记靶分子上的银 沉淀反应如实施例1中所述，用生物素化和5'胺化DNA多核苷酸探针的10次重复在玻璃 载玻片上对阵列(10x14)点样，所述DNA多核苷酸探针通过PCR通过扩增415个碱基对的沙 眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)序列产生，使用引物EPCHL015‘ NH2-GAATTCTTAAGTTCG GTCGG-3' (SEQ ID NO :8)和引物EPCHL02 (SEQ ID NO 9)5' -GAATTCAAAGTTGTCGAGAA-3‘。 PCR混合物包含终浓度1 μ M的这2种引物、终浓度2. 5ηΜ的生物素化dUTP、dATP 200 μ Μ、 dCTP 200 μ Μ、dGTP 200 μ M 禾口 dTTP 150 μ Μ、以 2U/100 μ 1 的 Taq 聚合酶(Eppendorf， Hamburg Germany)、IX 浓缩的 PCR 缓冲液(Eppendorf, Hamburg, Germany)禾口包含 4t 5 个 碱基插入片段的Ing来自沙眼衣原体的质粒PCHLl。PCR的温度方案是于94°C 5分钟，随 后包含于94°C 30秒的步骤、于52°C 30秒的步骤和于72°C 30秒的步骤的40个循环，随后 于72°C 10分钟并且于4°C过夜。点样溶液包含不同浓度的探针400nM、200nM、100nM、40nM、20nM、10nM、4nM、2nM、 1ηΜ、0. 4ηΜ、0. 2ηΜ、0. 1ηΜ、0ηΜ、ΙΟΟηΜ。点样后，如实施例1中说明的洗涤载玻片。根据Silverquant 检测试剂盒(Eppendorf，Hamburg, Germany)的方案，洗涤载玻 片，在抗生物素金缀合物溶液中温育，漂洗并且最后干燥。使PVC室(Eppendorf，Hamburg Germany)固定在玻璃载玻片上的阵列周围，并且 用在载玻片和棱镜之间的一滴87%甘油使载玻片固定在棱镜上，如图2和实施例2中示意 性呈现的。室充满包含150 μ 1 的 Silverquan t 溶液 A 和 150 μ 1 的 Silverquant 溶液 B 的 Silverquant 溶液(Eppendorf, Hamburg, Germany)混合物。使载玻片放置在红光激光器下5分钟，并且通过使用CXD照相机(如实施例2中 说明的)以距离阵列支持物的法线63°的观察角)，从0分钟到2分钟每10秒随后从2分 钟到5分钟每20秒检测信号。用54毫秒的采集时间以1增益获取图像。收集图像，并且使用Imagene 软件程序(Biodiscovery，ElSegundo, CA, USA)对于
359个不同浓度斑点(400、200、100、40、20、10、4、2、lnM)的1个重复进行定量。对于不同斑点
计算在每个斑点中8个像素的循环内的像素信号平均值。显示在不同浓度的检测对照的斑 点上的银沉淀动力学的曲线图显示于图8中。实施例5 使用脊通道显微结构区分在捕获探针和有色溶液上结合的信号之间的 读数。如实施例4中说明的，用5'胺化的生物素化沙眼衣原体序列以IOOnM浓度在 Diaglass (Eppendorf，Hamburg, Germany)上对阵列点样,其中用直径 400 μ m 的 250 μ m 给 定斑点的针和斑点之间700 μ m的间距。在点样和洗涤后，使用Silverquant检测试剂盒方 案(Eppendorf，Hamburg，Germany)标记生物素化捕获探针。在标记后，使载玻片颠倒放置在透射仪上，并且使用具有28-80f 1 3. 5-5. 6透镜 的Canon照相机E0S350 (Canon, Tokyo, Japan)，以距离阵列表面的法线40°的观察角捕获 在载玻片上的阵列。随后通过充满苯胺蓝0.001% (Sigma, Bornem, Belgium)的有色溶液的室包围阵 列，并且用照相机以距离阵列表面的法线40°的观察角获取阵列的新照片。将87%甘油层(Sigma，Bornem, Belgium)加在与阵列载玻片相对的载玻片表面 上，并且将具有脊通道显微结构的载玻片放置在甘油层上，如图9上显示的。用光激活树脂 (CRIF,Gosselies,Belgium)制备脊通道显微结构，并且包含在每个通道之间具有4mm大小 的一系列显微结构，对于每个显微结构具有以25°的角(y)、以90°的角(β)和以65°的 第三个角。使用照相机在距离阵列表面的法线40°的观察角中再次捕获阵列，并且使用照 相机以距离阵列表面的法线65°的角获取在禁止角内的第二张照片。这后一张照片显示察 看在捕获探针上的银沉淀物信号而无需察看有色液体溶液的可能性，当在脊通道显微结构 的存在下在禁止角中获取照片时。
权利要求
用于检测具有折光指数n1的光学透明的固体支持物表面上存在的生物靶分子的方法，所述固体支持物与具有折光指数n2的介质接触，由此n1＞n2，所述方法包括步骤a)照射所述靶分子，从而引起所述靶分子发射光；b)以相对于在支持物中的所述固体支持物表面的法线的观察角θobin检测通过所述支持物从所述靶分子发射的光，从而使得90°＞θobin＞sin 1(n2/n1)。
2.权利要求1的方法，其中所述靶分子与所述固体支持物表面上存在的捕获分子结1=1 o
3.权利要求1或2的方法，其中具有折光指数n2的介质包括含有所述靶分子的溶液。
4.权利要求1的方法，其中所述检测的发射光在所述透明支持物内不全内反射。
5.权利要求1的方法，其中所述观察角在禁止角内，并且在临界角加10°、优选加5° 且更优选加3°的范围中。
6.权利要求1的方法，其中所述固体支持物的折光指数高于1.33。
7.权利要求3的方法，其中所述溶液包含在封闭室中。
8.权利要求3的方法，其中对于从所述可溶靶分子发射的光以禁止角检测从所述结合 靶分子发射的光。
9.权利要求3的方法，其中所述观察角允许检测从所述结合靶分子发射的光信号，这 比从所述可溶靶分子发射的光信号高至少10倍、更佳50倍且甚至更佳100倍。
10.权利要求1的方法，其中通过所述支持物从所述结合靶分子发射的光通过发射的 消散波产生。
11.权利要求1的方法，其中所述靶分子用选自下述的染料进行标记荧光的、发磷光 的、量子点或有色分子。
12.权利要求1的方法，其中所述生物靶分子选自核酸或蛋白质。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白质选自抗体、抗原、配体、受体。
14.权利要求12的方法，其中所述捕获分子是10至1000个碱基的多核苷酸。
15.权利要求14的方法，其中所述捕获分子包括具有10至100个核苷酸的特定捕获部 分和间隔物的多核苷酸序列，所述特定捕获部分与待检测的所述特定靶序列互补。
16.权利要求14的方法，其中所述间隔物是长为至少约20个核苷酸、至少40或约70 个核苷酸且优选长为至少约90个核苷酸的多核苷酸。
17.权利要求1的方法，其中所述固体支持物包括根据微阵列在其表面的限定位置中 固定的多重捕获分子。
18.权利要求17的方法，其中所述微阵列包括超过5种不同捕获分子、优选超过20种 且甚至超过50种。
19.权利要求17的方法，其中限定位置的发射表面包括在lm2和1mm2之间。
20.权利要求1的方法，其中所述光源产生光束用于将光导向固体支持物的表面上。
21.权利要求1的方法，其中通过在限定位置处具有固定的捕获分子的支持物表面接 受的光在2个位置内改变不超过10%，并且优选不超过5%。
22.权利要求1的方法，其中所述光源产生固体支持物表面的消散激发。
23.权利要求3的方法，其中含有靶分子的溶液的温度保持恒定，其中温度变化小于 5°c、优选小于rc。
24.权利要求3的方法，其中含有靶分子的溶液接受具有至少2个且优选3个不同温度 的温度循环。
25.权利要求23的方法，其中所述温度循环是产生PCR的那些。
26.权利要求1的方法，其中所述固体支持物的表面在高于85°C的温度下维持平坦，并 且其中所述固体支持物在用于检测所述靶的激发和发射波长下显示低自身荧光。
27.权利要求1的方法，其中在靶和捕获分子之间的结合事件过程中执行所述检测。
28.权利要求1的方法，其中在相同测定法中检测和/或定量在溶液中存在的1至1000 种靶分子、优选1至100种靶分子、更优选1至20种靶分子。
29.权利要求1的方法，其中跟踪靶在其捕获分子上的反应动力学。
30.权利要求1的方法，其进一步包括计算所述靶与其捕获分子的结合常数的步骤。
31.权利要求1的方法，其中同时处理几个分开的观察区。
32.权利要求1的方法，其中所述观察区由彼此相距与多孔形式中的24、96、384或甚至 1536个孔的距离一致的间距的表面组成。
33.权利要求32的方法，其中所述观察区彼此相距18、9、4.5或甚至2. 25mm。
34.权利要求1的方法，其中所述支持物包含用于观察表面的脊通道样结构。
35.权利要求1的方法，其中适合于接受捕获分子的所述观察区位于具有脊通道的支 持物表面上，所述脊通道存在于与所述固定的捕获分子比较的支持物的对侧上。
36.权利要求34的方法，其中对于一个阵列的检测存在一个脊通道。
37.权利要求34的方法，其中对于亚阵列各自的检测存在一个脊通道。
38.权利要求34的方法，其中一系列脊通道存在于与具有固定的捕获分子的观察区比 较的支持物的对侧上。
39.权利要求34的方法，其中所述脊的角(0)等于90°。
40.权利要求34的方法，其中所述表面和脊的侧面之间的角(Y)等于25°+/-5°。
41.权利要求34的方法，其中所述观察角和与所述观察表面相对的脊表面相同。
42.权利要求1的方法，其中所述支持物包含在与所述结合捕获分子不同的支持物的 侧面上的显微结构并且用作观察表面。
43.权利要求1的方法，其中所述靶分子发射从所述照射光散射的光。
44.权利要求43的方法，其中所述靶分子用使所述照射光散射的颗粒或分子进行标记。
45.用于鉴定和/或定量样品中的生物体或生物体部分的实时PCR过程，所述过程包括 步骤在至少一个引物对和至少一种捕获分子的存在下，在封闭装置中扩增来自所述生物或 其部分的核苷酸序列，所述引物对对于待鉴定和/或定量的核苷酸序列特异，所述捕获分 子固定在所述封闭装置的内表面上的给定位置处，所述内表面通过光学透明的固体支持物 与外表面分开，其中所述固体支持物具有比PCR扩增在其中发生的介质的折光指数n2高的 折光指数nl，并且其中所述捕获分子包括能够与所述扩增产物特异性杂交的10至600个碱 基的捕获部分；和通过检测由于所述靶分子激发从所述靶分子发射的光，在所述扩增操作过程中检测所 述扩增产物与捕所述获分子的特异性杂交，所述发射光通过所述光学透明的固体支持物以相对于支持物中固体支持物的所述内表面的法线的观察角e0bin检测，从而使得90° > 0 obin > sirT1 (n2/nl)。
46.权利要求45的过程，其允许在相同样品中存在的可能4种其他生物体或生物体部 分的存在下扩增和特定检测生物体或生物体部分。
47.权利要求45的过程，其中所述至少一个引物对能够扩增来自其他生物体的至少4 种核苷酸序列，以便产生所述扩增产物。
48.权利要求45的过程，其中使用至少4个引物对，以便产生多重扩增产物，所述每个 特定引物对与对于至少4种核苷酸序列特异的其他引物对显示小于约80%的序列同源性。
49.用于鉴定和/或定量固体支持物上存在的生物靶分子的仪器，其包括具有折光指数nl的光学透明的固体支持物，其包括在所述固体支持物表面上存在的 捕获分子上结合的至少一种靶分子(结合靶分子)，并且其中所述固体支持物的折光指数 高于在其中发生所述靶与所述捕获分子的结合的介质的折光指数n2产生导向所述靶分子上的光束的光源，用于测量从所述靶分子发射的光的检测器，所述发射光通过所述光学透明的固体支持 物以相对于所述支持物中的固体支持物表面的法线的观察角e obin进行检测，从而使得 90° > 0 obin > sirrYr^/nl)。
50.权利要求49的仪器，其中从所述靶分子发射的光是通过照射光束激发所述靶分子 的结果。
51.权利要求49的仪器，其中所述光学透明的固体支持物包括封闭室用于在包含所述 靶分子(可溶靶分子)的溶液的存在下检测所述结合靶。
52.权利要求49的仪器，其中对于从所述可溶靶分子发射的光以禁止角检测从所述结 合靶分子发射的光。
53.权利要求49的仪器，其中所述观察角高于由临界角给出的值，所述临界角通过所 述捕获分子位于其中的介质的折光指数和所述透明固体支持物的折光指数之间的比的反 正弦定义。
54.权利要求49的仪器，其中所述固体支持物包括根据微阵列在其表面的限定位置中 固定的多重捕获分子。
55.权利要求49的仪器，其中所述光源产生光束用于将光导向所述固体支持物的表面上。
56.权利要求49的仪器，其中所述光源产生固体支持物的表面的消散激发。
57.权利要求49的仪器，其进一步包括用于热调节的装置。
58.权利要求49的仪器，其进一步包括能够交替加热和冷却的自动热循环仪，并且适 合于接受包含所述固定的捕获分子的至少一个反应室，和用于核酸扩增的反应物。
59.权利要求49的仪器，其中含有靶分子的溶液温度保持恒定，其中温度变化小于 5°c、优选小于rc。
60.权利要求58的仪器，其中含有靶分子的溶液接受具有至少2个且优选3个不同温 度的温度循环。
61.权利要求58的仪器，其中所述温度循环是产生PCR的那些。
62.权利要求58的仪器，其中所述加热元件能够使所述溶液的温度循环，从而使得能够进行扩增反应。
63.权利要求49的仪器，其中所述固体支持物的表面在高于85°C的温度下维持平坦， 并且其中所述支持物在用于检测所述靶的激发和发射波长下显示低自身荧光。
64.权利要求49的仪器，其进一步包括能够改变所述溶液温度的加热元件，从而使得 能够进行靶和捕获分子之间的结合反应。
65.权利要求49的仪器，其中所述检测器包括C⑶照相机。
66.权利要求49的仪器，其进一步包括用于校正图像失真的工具，所述工具包括圆柱 透镜。
67.权利要求49的仪器，其进一步包括用于增加聚焦深度的工具，所述工具包括所述 检测器的捕捉器表面相对于发射光方向的机械倾斜。
68.权利要求49的仪器，其用于实时PCR扩增和检测。
69.用于检测和/或定量靶分子的反应物装置，其包含固定在所述装置的内表面(观 察区)上的至少一种捕获分子，所述内表面通过光学透明的固体支持物与外部观察表面分 开，用于沿着其为禁止角的观察角(eobin)检测靶分子，并且其中所述固体支持物具有高 于1.33的折光指数，并且其中脊通道存在于与具有固定的捕获分子的观察区比较的支持 物的对侧上。
70.权利要求69的装置，其中适合于接受捕获分子的所述观察区位于具有一系列脊通 道的支持物的表面上，所述一系列脊通道存在于与固定的捕获分子比较的支持物的另一侧 上。
71.权利要求70的装置，其中每个脊通道与一个亚阵列对应。
72.权利要求69和70的装置，其中所述脊的角(0)等于90°。
73.权利要求70的装置，其包含彼此相距18、9、4.5或甚至2. 25mm的几个分开的观察区。
74.权利要求70的装置，其中所述观察区由彼此相距与多孔形式中的24、96、384或甚 至1536个孔的距离一致的间距的表面组成。
75.根据权利要求74的装置，其中所述多孔平板的每个观察区具有脊通道用于所述区 域的个别观察。
76.根据权利要求69的装置，其具有在管的外表部分上存在的脊通道的管形式。
77.根据权利要求69的装置，其中所述脊通道的表面之一是曲线以便校正图像失真。
78.权利要求69的装置，其用于执行实时PCR扩增和检测。
79.用于检测和/或定量靶分子的反应物装置，其包含固定在所述装置的内表面(观 察区)上的至少一种捕获分子，所述内表面通过光学透明的固体支持物与外部观察表面分 开，用于沿着其为禁止角的观察角(eobin)检测靶分子，并且其中所述固体支持物具有高 于1.33的折光指数，并且其中显微结构存在于与具有固定的捕获分子的所述观察区比较 的支持物的对侧上。
80.用于鉴定和/或定量在固体支持物上存在的靶核酸的反应物试剂盒，其包括 用于扩增和检测和/或定量靶核酸的封闭装置，其包含固定在所述封闭装置的内表面上的给定位置处的至少一种捕获分子，所述内表面通过具有至少等于d/(2 tan(0 obin)) 的厚度的光学透明的固体支持物与外表面分开，d是观察区长度，和(eobin)观察角，并且其中所述固体支持物具有高于1. 33的折光指数， -至少一种核酸引物， -任选地脱氧核糖核苷酸， -任选地适合于延伸核酸引物的酶， -荧光标记，-用于在禁止角中检测给定位置处存在的扩增产物的工具。
81.用于检测和/或定量固体支持物上存在的靶核酸的反应物试剂盒，其包括用于检 测和/或定量靶分子的装置，其包含固定在所述装置的内表面(观察区)上的至少一种捕 获分子，所述内表面通过光学透明的固体支持物与外部观察表面分开，用于沿着其为禁止 角的观察角(9 ob)检测靶分子，并且其中所述固体支持物具有高于1. 33的折光指数，并且 其中脊通道存在于与观察区比较的支持物的对侧上，所述观察区具有固定的捕获分子。-至少一种核酸引物， -任选地脱氧核糖核苷酸， -任选地适合于延伸核酸引物的酶， -任选地荧光标记，-用于在禁止角中检测给定位置处存在的扩增产物的工具。
82.权利要求80或81的反应物试剂盒，其中所述封闭装置整合有在注入反应物溶液后 能够密封所述装置的密封过程。
83.权利要求80或81的反应物试剂盒，其中适合于在禁止角中检测扩增产物的所述固 体支持物的厚度通过使具有相同组成的2种固体支持物连接来获得，所述2种固体支持物 通过具有与所述固体支持物的折光指数接近的折光指数的材料(凝胶、液体、油)分开。
全文摘要
描述的是用于检测和/或定量固体支持物(6)上存在的生物靶分子(2)的方法和仪器(1)。该方法包括步骤提供具有折光指数n1的光学透明的固体支持物表面(6)，所述固体支持物与具有折光指数n2的介质接触，由此n1＞n2，提供光源(9)以照射靶分子，从而引起靶分子发射光以相对于在支持物中的所述固体支持物表面的法线的观察角θobin检测通过所述支持物从靶分子发射的光，从而使得90°＞θobin＞sin-1(n2/n1)。所述设置具有在PCR扩增动力学的实时监控中的特别应用。
文档编号G01N21/55GK101981204SQ200880107020
公开日2011年2月23日 申请日期2008年7月17日 优先权日2007年7月20日
发明者A·佩雷曼斯, H·科恩, I·亚历山大, J·雷马克勒, L·丹, S·马尔盖纳, V·布鲁尼克斯-卡里斯, Y·萨特奈尔 申请人:埃佩多夫股份公司