肠疾病中的新的治疗靶标的制作方法

专利名称：肠疾病中的新的治疗靶标的制作方法
肠疾病中的新的治疗靶标相关申请本申请要求2008年10月17日申请的美国临时申请60/999，234的权益。上述申 请的全部内容都通过弓I用结合到本文中。
背景技术：
2004年，FDA批准将Xifaxan (利福昔明(Rifaximin)，RIFax)用于治疗旅行者 腹泻(Laustsen and Wimmett，2005)。研究表明，RIFax是对抑制细菌RNA合成起作用的通 用抗生素。并不完全了解促成RIFax在慢性胃肠疾病中起有益作用的机制。因此，在本领域中存在对提供涉及肠疾病(BD)，特别是肠易激综合征(IBS)的多 核苷酸和多肽序列的需求。在本领域中还存在对提供与各种BD有关的抗原(BD相关多肽) 作为诊断和/或治疗化合物和组合物的靶标的需求，包括对提供抗体的需求。这些抗原还 可用于药物开发(例如小分子)，以及用于细胞调节、生长和分化的进一步表征。还存在对 鉴定和表征可以用作药剂或药物靶标，或者可以在预防、改善或纠正功能障碍或疾病中起 作用的基因和相关蛋白质的需求。发明概述—方面，本文提供筛选调节孕烷X受体(PXR)蛋白或其片段的化合物或其盐的方 法，所述方法包括使PXR受体与一种或多种候选化合物接触。在一个实施方案中，候选化合物包含利福霉素类似物。在一个相关实施方案中，利福霉素类似物包含利福昔明。在一个实施方案中，调节包括调节由PXR蛋白或其片段与利福霉素类似物的结合 所诱导的信号转导。在一个实施方案中，PXR受体与膜缔合、在转基因小鼠中、在测定板中、在细胞中和 /或在人工膜中。在一个实施方案中，PXR蛋白包含由序列登录号075469、Q8SQ01、Q9R1A7、054915、 NP_148934、NP 003880或NP 071285所表示的氨基酸序列或其片段或变体或者由序列登录 号 NM 033013,NM 009803,NM 022002,NM 003889、CS618137、CS618135、CS618133 所表示的
核酸或其片段或变体。在另一个实施方案中，CYP3A11、GSTAl、MRP2和0ATP2上调。在一个实施方案中，所述方法还可包括用利福昔明、利福霉素类似物或候选化合 物的一种或多种预治疗。在一个实施方案中，用候选化合物预治疗不会影响CYP3A底物咪达唑仑的药代动 力学特征。在另一个实施方案中，用候选化合物预治疗提高1'-羟基咪达唑仑的Cmax并降低 1'-羟基咪达唑仑&Tmax。在一个实施方案中，在用候选化合物治疗后与对照相比，CYP3A11增加约1倍 约4倍。在另一个实施方案中，GSTAlmRNA在候选化合物治疗后上调。
4
在另一个实施方案中，上调范围介于约65% 约200%之间。在一个实施方案中，肠MRP2mRNA在候选化合物治疗之后上调。一方面，本文提供用于筛选(I)调节PXR受体或其片段的化合物或其盐的试剂盒， 所述试剂盒包括PXR受体蛋白或其活性片段和利福霉素类似物。一方面，本文提供用于治疗PXR相关疾病的药物，所述药物包含调节孕烷X受体 (PXR)蛋白或其片段的化合物或其盐，或者调节由PXR蛋白或其片段与利福霉素类似物的 结合所诱导的信号转导的化合物或其盐。一方面，本文提供治疗、预防或减轻受治疗者的PXR相关疾病的方法，所述方法包 括给予调节孕烷X受体(PXR)蛋白或其片段的化合物或其盐。在一个实施方案中，调节孕烷X受体(PXR)蛋白或其片段的化合物或其盐不是利
福昔明。在一个实施方案中，调节包括调节由PXR蛋白或其片段与利福霉素类似物的结合 所诱导的信号转导。在另一个实施方案中，PXR受体与膜缔合、在转基因小鼠中、在测定板中、在细胞中 和/或在人工膜中。在一个实施方案中，PXR蛋白包含由序列登录号075469、Q8SQ01、Q9R1A7、054915、 NP_148934、NP_003880或NP_071285表示的氨基酸序列或其片段或变体或者由序列登录号 NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133 表示的核酸
或其片段或变体。一方面，本文提供包含有效量的产生治疗效果的PXR蛋白激动剂组合物。一方面，本文提供包含纯合破坏(homozygous disruption)的内源孕烷X受体 (PXR)基因的转基因小鼠。在另一个实施方案中，小鼠包含人PXR基因。一方面，本文提供从本文所述转基因小鼠中分离的细胞或组织。一方面，本文提供鉴定能够调节PXR基因的活性或PXR基因表达产物的活性的调 节剂的方法，所述方法包括给予本文所述的转基因小鼠推定的调节剂；给予野生型对照小 鼠所述调节剂；将转基因小鼠的生理反应与对照小鼠的生理反应进行比较；其中在转基因 小鼠与对照小鼠之间生理反应上的差异表示所述调节剂能够调节基因或基因表达产物的 活性。一方面，本文提供筛选具有抗炎性肠病活性的候选药物的方法，所述方法包括提 供表达PXR基因或其片段或变体的细胞，所述PXR基因由选自以下序列的核酸序列编码 NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133 或 075469、 Q8SQ01、Q9R1A7、054915、NP_148934、NP_003880、NP_071285 ；使细胞与候选药物接触；以及 监测组织样品中候选药物对BD多核苷酸表达的作用。一方面，本文提供与PXR多肽结合的分离抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体或其片段与固相支持体连接；其中抗体是单克隆抗体； 其中抗体是多克隆抗体；和/或其中抗体或其片段另包含可检测标记。本发明部分是基于这样的发现，即BD易感性与核受体家族的成员PXR基因的遗传 变异强相关。PXR是一种调节参与异生素(xenobiotic)和限制抗生素沉积(exposition)及解毒的基因的核受体。本发明还部分基于人PXR的RIFax特异性活化。PXR是构成参与 内源性解毒和异生素解毒的机体防御机制的固有组分(Kliewer等，2002)。PXR被包括处方 药、草药补充剂、农药、内分泌破坏物和其它环境污染物在内的广谱异生素激活(Carnahan 和RedinbO，2005)。PXR活化调节参与异生素(包括毒性化学物质)代谢和分泌的多种基 因(Kliewer，2003 ；Rosenfeld 等，2003 ；Sonoda 等，2005)。本文还公开了一种新的动物模 型PXR人源化小鼠(hPXR)，其中将完整人PXR基因重新导入Pxr失效背景中(Ma等，2007)。本发明提供用于筛选调节炎性肠病的组合物的方法。本发明还提供用于筛选调节 炎性肠病的组合物的方法。本文还提供抑制肠及相关组织和器官的炎症的方法。本文还提 供治疗炎性肠病的方法。本公开内容总的来讲涉及转基因动物，以及与基因功能的表征有关的组合物和方法。一方面，筛选候选药物的方法包括提供表达炎性肠病相关(BD)基因或其片段的 细胞系。BD基因的某些实施方案是在BD中进行差异性表达的基因。用于本文方法的BD 基因的某些实施方案包括但不限于选自NCBI登录号NM_033013、NM_009803、NM_022002、 NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133的核酸或其相当于由其产生的人mRNA的片段。 所述方法另包括将候选药物加到细胞中，并测定候选药物对BD基因的表达、结合、作用方 式的作用。在一个实施方案中，筛选候选药物的方法包括将候选药物不存在时的表达水平与 候选药物存在时的表达水平进行比较。本文还提供筛选能够与BD蛋白(BDP)结合的生物活性剂的方法，所述方法包括将 BDP与候选生物活性剂混合，并测定候选生物活性剂与BDP的结合。本文另外还提供用于筛选能够调节BDP活性的生物活性剂的方法。在一个实施方 案中，所述方法包括将BDP与候选生物活性剂混合，并测定候选生物活性剂对BDP的生物活 性的作用。本文还提供评价候选BD药物的作用的方法，所述方法包括给予受治疗者药物，并 从受治疗者体内提取细胞样品。然后测定细胞的表达谱。该方法可另外包括将受治疗者的 表达谱与健康个体的表达谱进行比较。例如，BD蛋白包含选自 NCBI 登录号 075469、Q8SQ01、Q9R1A7、054915、NP_148934、 NP_003880、NP_071285所示序列的蛋白质。本文所使用的BDP蛋白包括例如被配体活化后 在信号转导途径中的蛋白质。例如，BD蛋白包含由选自 NCBI 登录号 NM_033013、NM_009803、NM_022002、 NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133所示序列的核酸编码的蛋白质；所述核酸相当 于由其产生的人mRNA。此外，本文提供包含编码BD蛋白的核酸区段的生物芯片，所述核酸选自NCBI登录 号 NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133 所示序 列；相当于由其产生的人mRNA。本文还提供通过对受治疗者的至少一种BD基因进行测序来诊断或确定BD倾向性 的方法。在本发明的又一个方面，提供确定受治疗者的BD(包括基因拷贝数)的方法。在一些实施方案中，多核苷酸或其互补序列或其片段另包含可检测标记，所述多核苷酸或其互补序列或其片段与固相支持体连接、至少部分通过化学合成法制备、是反义 片段、是单链、是双链或包含微阵列。本文提供分离多肽，所述多肽在选自下述多核苷酸序列或互补序列的BD序列的 可读框内编码。本文提供分离多肽，其中所述多肽包含由选自下述序列的多核苷酸编码的 氨基酸序列。本文提供分离多肽，其中所述多肽包含由选自下述序列的多肽编码的氨基酸 序列。在某些实施方案中，所述多肽或其片段可与固相支持体连接。在一个实施方案中，本 文提供与这类多肽结合的分离抗体(单克隆或多克隆抗体)或其抗原结合片段。分离抗体 或其抗原结合片段可与固相支持体连接，或另包含可检测标记。在一个实施方案中，本文提供筛选抗BD活性的方法，所述方法包括(a)提供表 达BD相关基因或其片段的细胞，所述基因由选自以下登录号的BD序列的核酸序列编码 NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133 或登录号 075469、Q8SQ01、Q9R1A7、054915、NP_148934、NP_003880、NP_071285 ； (b)使从 BD 细胞中得 到的组织样品与抗BD候选药物(例如候选组合物)接触；(c)监测组织样品中抗BD候选 药物对BD多核苷酸的表达的作用，并任选(d)将候选药物不存在时的表达水平与候选药物 存在时的表达水平进行比较。候选药物可以是转录抑制剂、G蛋白偶联受体拮抗剂、生长因 子拮抗剂、丝氨酸_苏氨酸激酶拮抗剂、酪氨酸激酶拮抗剂。在一个实施方案中，化合物包括例如利福霉素衍生物，该衍生物带有在3，4_位上 稠合的杂环。示例性组合物包括例如公开于以下专利的化合物南非专利第68/0903号(吡 咯并[5,4-c]利福霉素SV衍生物)、德国专利公布号2，739，671和2，739，623 (咪唑并[5， 4-c]利福霉素SV化合物，其在1位和2位上带有取代基)。德国专利公布号2，741，066中 报告了噻唑并[5，4-c]利福霉素SV(利福霉素P)衍生物。其它利福霉素类似物包括例如 本领域技术人员熟知的利福霉素-ο和利福霉素-P，并且可与其它组合物及其衍生物一起 提供，例如 USPN 4，341，785 或 USPN4, 200，574。本文提供用于筛选能够调节BD蛋白(BDP)活性的生物活性剂的方法，其中BDP由 包含下述核酸序列的核酸编码，所述方法包括将BDP与候选生物活性剂混合；测定候选生 物活性剂对BDP的生物活性的作用。按照该方法，生物活性剂可影响BD蛋白(BDP)的表达； 影响BD蛋白(BDP)的活性。本发明提供优先与BD蛋白(BDP)结合、任选与治疗剂连接或人源化的单克隆抗 体，其中BD蛋白选自本文所述的BD蛋白。本文还提供用于检测受治疗者体内存在或不存 在BD细胞且包含这类抗体的的试剂盒和药物组合物。本公开内容提供转基因细胞，所述转基因细胞包含PXR基因中的破坏。本公开内 容的转基因细胞包括能够进行同源重组的任何细胞。优选本公开内容的细胞是干细胞，更 优选胚胎干(ES)细胞，最优选鼠ES细胞。按照一个实施方案，通过将寻靶构建体导入干细 胞以产生导致PXR基因突变的同源重组，来制备转基因细胞。在另一个实施方案中，转基因 细胞由下述转基因动物获得。由转基因动物得到的细胞包括分离的细胞或存在于组织或器 官及任何细胞系中的细胞或其任何子代。本公开内容还提供寻靶构建体和当导入干细胞时产生同源重组的产生寻靶构建 体的方法。在一个实施方案中，本公开内容的寻靶构建体包含与PXR基因同源的第一多核 苷酸序列和第二多核苷酸序列。寻靶构建体还包含编码选择标记的多核苷酸序列，所述选择标记优选位于构建体中两个不同的同源多核苷酸序列之间。寻靶构建体还可包含可以提 高同源重组的其它调节元件。本公开内容另外提供非人类转基因动物和产生这类包含PXR基因中的破坏的非 人类转基因动物的方法。本公开内容的转基因动物包括在PXR基因中对于突变是杂合和纯 合的转基因动物。一方面，本公开内容的转基因动物在PXR基因的功能方面有缺陷。另一 方面，本公开内容的转基因动物包括与PXR基因上具有突变有关的表型。本公开内容还提供鉴定能够影响转基因动物表型的作用剂(agent)的方法。例 如，将推定的作用剂给予转基因动物，测定转基因动物对推定的作用剂的反应，与“正常”或 野生型小鼠的反应进行比较，又或者与转基因动物对照(未给予作用剂)进行比较。本公 开内容另外提供按照这类方法鉴定出的作用剂。本公开内容还提供鉴定用作治疗PXR基因 破坏相关疾病的治疗剂的作用剂的方法。本公开内容另外提供鉴定对PXR表达或功能起作用的作用剂的方法。所述方法包 括给予转基因动物(例如小鼠)有效量的作用剂。例如，所述方法包括测定转基因动物对 作用剂的反应，对转基因动物的反应与对照动物的反应进行比较，对照动物可为例如野生 型动物又或者为转基因动物对照。可能对PXR表达或功能起作用的化合物也可在基于细胞 的测定法中针对细胞进行筛选，例如以鉴定这类化合物。所述细胞可以是从本文所述的PXR 转基因小鼠中得到的细胞。本公开内容还提供包含PXR基因的核酸序列的细胞系。这类细胞系能够通过与功 能性启动子有效连接，在细胞系中表达这类序列。在一个实施方案中，PXR基因序列的表达 在诱导型启动子的控制下。本文还提供鉴定与PXR基因相互作用的作用剂的方法，所述方 法包括使PXR基因与作用剂接触并检测作用剂/PXR基因复合物的步骤。例如可通过测定 有效连接的选择标记的表达，来检测这类复合物。本公开内容另外提供治疗与PXR基因中的破坏有关，更准确地讲与PXR基因表达 或功能的破坏有关的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，本公开内容的方法涉及治疗 与PXR基因表达或功能的破坏有关的疾病或病症，所述方法包括给予有需要的受治疗者实 现PXR表达或功能的治疗剂。按照这个实施方案，所述方法包括给予治疗有效量的天然、合 成、半合成或重组的PXR基因、PXR基因产物或其片段以及天然、合成、半合成或重组的类似 物。本公开内容另外提供治疗与受破坏的靶定基因表达或功能有关的疾病或病症的 方法，其中所述方法包括检测并通过基因疗法置换突变的PXR基因。在另一个实施方案中，与PXR基因中的破坏有关的表型(或表型改变)用于预测 拮抗PXR基因产物的药物的可能作用和副作用。在该实施方案中，使用小鼠评价作为“药物 性靶标”的基因，以确定例如靶向PXR基因产物的药物的开发是否值得集中进行药物研究。下文中公开了其它实施方案。附图
简述图 1 表示 RIF 和 RIFax 的 LC-MS/MS 分析。(A) RIF 的结构；(B) RIFax 的结构；(C) RIF和RIFax的典型层析谱。通过LC-MS/MS对RIF和RIFax进行检测，对于RIF(l)m/z为 823. 5/791. 5，对于 RIFax(2)m/z 为 786. 3/754. 5。图2表示在单剂量的10mg/kg RIF或RIFax治疗之后，小鼠中RIF和RIFax的代
8谢分布曲线和肠道分布。(A)在口服治疗后血清RIF和RIFax的浓度-时间曲线图。数据 用平均值士 SD表示，在每个时间点上η = 3。(B、C、D)在口服治疗后小肠(S. intestine), 盲肠和结肠中RIF和RIFax的时程。分别在给药后1. 5、3、6、9、12、24和48小时，从小肠
(B)、盲肠(C)和结肠⑶中采集内容物。从肠道内容物提取RIF和RIFax，并通过LC-MS/ MS进行分析。数据用平均值士SD表示，在每个时间点上η = 3。(E)在口服治疗后，对野 生型小鼠、Pxr失效小鼠和hPXR小鼠进行了 RIFax Cfflax比较。数据用平均值表示(η = 3)。 (F)通过静脉内、腹膜内和口服治疗的血清RIFax的浓度-时间曲线图。数据用平均值表 示(n = 3)。(G)腹膜内注射后血清RIFax和RIF的浓度-时间曲线图。数据用平均值表 示(η = 3)。(H)静脉内注射后血清RIFax和RIF的浓度-时间曲线图。数据用平均值表 示(η = 3) ο图3表示RIF和RIFax对野生型小鼠、Pxr失效小鼠和hPXR小鼠的小肠和肝中的 PXR靶基因的作用。小鼠用25mg/kg RIF或RIFax经口服治疗3天，通过qPCR对CYP3A11、 GSTAUMRP2和0ATP2的表达进行了分析。采用比较CT法对对数值进行了量化，使样品归一 化至β _肌动蛋白。数据用平均值士SD表示，η = 3。与对照相比*ρ < 0. 05。(A)RIFax 对hPXR小鼠小肠的PXR靶基因的作用；(B)RIFax对野生型小鼠小肠的PXR靶基因的作用；
(C)RIFax对Pxr失效小鼠小肠的PXR靶基因的作用；⑶RIF对hPXR小鼠小肠的PXR靶基 因的作用；(E) RIF对hPXR小鼠肝的PXR靶基因的作用；(F) RIFax对hPXR小鼠肝的PXR靶 基因的作用。图4表示基于细胞的报道分子测定法测定各种异生素核受体的RIFax活化。数据 用平均值士SD表示，η = 3。与对照相比*ρ < 0. 05。(A)RIFax对人PXR的活化的基于细 胞的报道分子测定法。分别将10 μ M RIF ;1μΜ、10μΜ、100μΜ RIFax加到培养基中。采 用DMSO作为溶媒。24小时后通过测定萤火虫萤光素酶活性，接着通过蛋白质浓度使萤光 素酶活性归一化，来确定PXR的活化。(B) RIFax对人PXR、CAR、PPAR α ,PPAR γ和FXR的活 化的基于细胞的报道分子测定法。将10 μ M RIFax加到培养基中孵育24小时。分别使用 RIF(IOyM), TCP0B0P (250nM)、Wy-14, 643 (10 μ Μ)、罗格列酮(rosiglitazone) (10 μ Μ)和 GW4064 (25 μ Μ)作为人PXR、CAR、PPAR α ,PPAR γ和FXR的阳性对照。采用DMSO作为溶媒。 采用标准双重萤光素酶测定法，并归一化至转染的对照报道分子。发明详述获准用于治疗旅行者腹泻的利福昔明(RIFax)这种利福霉素类似物，在胃肠疾病 或BD的治疗中同样有益。然而，并不完全了解促成利福昔明在慢性胃肠疾病中起作用的机 制。本发明部分基于利福昔明在调节参与异生素和限制生物体内生的沉积及解毒的基因的 核受体人孕烷X受体(PXR)的特异性活化中的作用。本发明还部分基于PXR-人源化(hPXR) 小鼠、Pxr失效小鼠和野生型小鼠的产生。要了解的是，前面的概述和下面的详述都只是示例性和说明性的，并不限制所要 求保护的本发明。在本申请中，使用的单数包括复数，除非另有说明。在本申请中，使用的 “或”是指“和/或”，除非另有说明。此外，使用的术语“包括”以及其它形式不是限制性的。 同样，术语例如“元件”或“组分”既包括包含一个单位的元件和组分，又包括包含一个以上 亚单位的元件和组分，除非另有说明。同样，使用的术语“部分”可包括部分的组成部分或 完整部分。
本文所使用的章节标题仅出于组织目的，不得解释为限制所述描述的主题。在本 申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书和论文，通过 引用其全部明确结合到本文中以用于任何目的。术语“有效量”包括以剂量并经过必需的一段时间有效达到所需结果的量，例如足 以治疗或预防患者或受治疗者的BD的量。PXR受体调节剂的有效量可根据受治疗者的疾病 状况、年龄和体重等因素，以及PXR受体调节剂在受治疗者体内诱导所需反应的能力而改 变。可以调整剂量方案以提供最适宜的治疗反应。有效量也是治疗有益作用胜过其中PXR 受体调节剂的任何毒性作用或有害作用(例如副作用)的量。“改善”、“改进”、“改良”等是指例如与发生在受治疗者中或在至少少部分受治疗 者中的改善一致的可检测的改善或可检测的变化，例如至少约2 %、5 %、10%、15 %、20 %、 25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、100% 或在大致任两 个数值之间的范围。与未用利福昔明治疗的受治疗者相比，在经治疗的受治疗者中观察到 这类改善或变化，其中未接受治疗的受治疗者患有或易发生相同或相似的疾病、病症、症状 等。可以通过以下方面来主观或客观地确定疾病、病症、症状或实验参数的改善受治疗者 自我评价；通过临床医生的评价；或者通过进行适当的测定或测量，包括例如生命质量的 评价、疾病或病症的进程减慢、疾病或病症的严重程度降低；或者生物分子、细胞的水平或 活性的适当测定或者通过检测受治疗者的BD发作。改善可以是短暂的、长期的或永久的， 或者在将PXR受体调节剂给予受治疗者或者用于本文或所引用的参考文献描述的测定法 或其它方法期间或之后的适当时间，改善是可变的，所述适当时间例如在下述时限内，或者 在给药或使用PXR受体调节剂后约1小时至受治疗者接受这类治疗之后约28天或1、3、6、 9个月以上。例如症状、分子的水平或生物活性等的“调节”，是指例如症状或者活性等可测量 地提高或降低。与未使用PXR受体调节剂治疗的受治疗者相比，可以在接受治疗的受治疗 者中观察到这类加重/提高或减轻/降低，其中未接受治疗的受治疗者患有或易发生相同 或相似的疾病、病症、症状等。这类加重/提高或减轻/降低可为至少约2%、5%、10%、 15%,20%,25%,30%,40%,50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98% ,100%, 150%、200 %、250%、300 %、400 %、500%、1000 %以上或在这些值的任两个之间的任何范 围内。可通过以下方面主观或客观地确定所述调节受治疗者的自我评价；通过临床医生 评价；或者进行适当的实验或测量，包括例如生命质量评价或分子水平或活性的适当测定 法、受治疗者体内的细胞或细胞迁移等。调节可以是短暂的、长期的或永久的，或者在将 PXR受体调节剂给予受治疗者或者用于本文或所引用的文献资料描述的测定法或其它方法 期间或之后的适当时间，调节是可变的，所述适当时间例如在下述时间内，或者给予或使用 PXR受体调节剂约1小时至在受治疗者接受PXR受体调节剂之后约3、6、9个月以上。术语“调节”还可指细胞在响应暴露于PXR受体调节剂时活性的提高或降低，例 如在动物中抑制至少一部分细胞的增殖和/或诱导至少一部分细胞的分化，使得达到所需 要的最终结果，例如用于治疗的PXR受体调节剂的治疗结果可随具体治疗的进程增加或减 少。如在“获得PXR受体调节剂”中一样的术语“获得”是指包括购买、合成或以别的 方式获取PXR受体调节剂。
本文所使用的术语“胃肠外给药”和“经胃肠外给予”包括例如肠内给药和局部给 药以外的给药方式，通常通过注射，包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、 心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内(intraarticulare)、囊下、蛛网膜 下、脊柱内和胸骨内注射和输注。术语化合物的“预防有效量”是指当以单剂量或多剂量给予受治疗者时有效预防 或治疗BD的PXR受体调节剂的量。本文所使用的术语“药物组合物”(或药剂或药物)是指当适当给予患者时能够诱 导所需治疗效果的化合物、组合物、药剂或药物。它不一定需要一种以上类型的成分。本文所使用的术语“全身给药”、“全身给予”、“外周给药”和“外周给予”是指给予 PXR受体调节剂、药物或其它物质，使得它进入受治疗者系统，并因此进行代谢等过程，例如 皮下给药。术语PXR受体调节剂的“治疗有效量”是指当以单剂量或多剂量给予受治疗者时， 在受治疗者体内有效抑制细菌生长和/或侵袭、或者减轻与细菌生长相关的症状(例如BD 发作)的PXR受体调节剂的量。“治疗有效量”还指足以降低受治疗者的BD严重程度的某 一疗法(例如包含PXR受体调节剂的组合物)的量。本文所使用的术语“预防”、“防止”、“阻止”是指预防BD发作或更多BD症状的复 发、起病或发生。预防包括防止BD发作的发生和严重性。本文所使用的术语“预防有效量”是指某一疗法(例如包含PXR受体调节剂的组 合物)的量足以预防BD发作的发生、复发或起病或者提高或改善另一疗法的预防效果。本文所使用的“受治疗者”包括可能患有肠疾病或用PXR调节剂可治疗的其它病 症或者除此外可从给予本文所述的PXR调节剂获益的生物，例如人和非人类动物。优选的 人类动物包括人类受治疗者。本发明的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动 物，例如小鼠等啮齿动物，以及非哺乳动物，例如非人类灵长类，例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖 动物、爬行动物等等。本发明涉及多种与BD有关的序列。本文描述了通过将PXR调节剂制剂给予受治疗者以治疗患有或易患胃肠疾病或 肠疾病的受治疗者的方法。在患有胃肠疾病的受治疗者中给予本文所述的PXR调节剂制剂 加强治疗功效。可用本发明方法治疗的示例性胃肠疾病和肠疾病(PXR相关疾病或PXR蛋 白相关疾病)包括但不限于例如肠易激综合征、克罗恩病(Crohn’ s disease)、旅行者腹 泻、溃疡性结肠炎、肠炎、小肠细菌过度生长、慢性胰腺炎、胰腺功能不全、结肠炎或肝性脑 病。可能特别受益于该治疗的受治疗者包括患有或可能易患BD的受治疗者，例如新患上食 源性疾病的受治疗者。在一个实施方案中，肠疾病包括肝性脑病。在一个实施方案中，BD包 括以下一种或多种疾病炎性肠病(IBD)、克罗恩病、肝性脑病、肠炎、结肠炎、肠易激综合 征(IBS)、纤维肌痛(FM)、慢性疲劳综合征(CFS)、抑郁症、注意力缺陷/多动症(ADHD)、多 发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、旅行者腹泻、小肠细菌过度生长、慢性胰腺炎或胰 腺功能不全。因此，本发明提供与BD有关的核酸和蛋白质序列，本文称为“BD相关”或“BD”序 列。另外，BD基因可能涉及其它疾病，例如但不限于与老化或神经变性相关的疾病。在这 个方面的“相关”是指与正常组织相比，在BD中核苷酸或蛋白质序列被差异表达、激活、钝化或改变。如下所述，BD序列包括在BD中上调(例如以较高水平表达)的序列，以及在BD中 下调(例如以较低水平表达)的序列。BD序列还包括发生变化的序列(例如截短序列或 具有取代、缺失或插入的序列，包括点突变)，以及具有相同表达谱或变化谱的序列。在一 个实施方案中，BD序列来自人；然而，正如本领域技术人员应了解的一样，来自其它生物的 BD序列可用于疾病和药物评价的动物模型；因此，本文提供得自脊椎动物、包括哺乳动物、 包括啮齿动物(大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠等)、灵长类和家畜(包括绵羊、山羊、猪、牛、马等) 的其它BD序列。在一些情况下，原核BD序列可能是有益的。可采用下述技术获得其它生 物的BD序列。BD序列包括核酸序列和氨基酸序列。在一个实施方案中，BD序列为重组核酸。在 一个实施方案中，BD序列为核酸。正如本领域技术人员应了解并且将在下面更详细描述的 一样，BD序列可用于各种应用，包括可以检测天然存在的核酸的诊断应用以及筛选应用； 例如，可以制成包含BD序列的核酸探针的生物芯片。从大的方面来看，使用的“核酸”、“多 核苷酸”或“寡核苷酸”或等同术语在本文中是指至少两个核苷酸共价连接在一起。在一些 实施方案中，寡核苷酸是6、8、10、12、20、30个或多达100个核苷酸的寡聚体。“多核苷酸” 或“寡核苷酸”可包含DNA、RNA、PNA或通过磷酸二酯和/或任何更迭键连接的核苷酸的多 聚体。术语“标记”是指例如能够产生表示实验样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的 组分。合适的标记包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁 性颗粒、生物发光部分等。因此，标记是通过分光镜方法、光化学方法、生化方法、免疫生化 方法、电学方法、光学方法、化学方法或任何其它适当的方法可检测的任何组分。术语“标 记”是用来指具有可检测的生理性质的任何化学基团或部分，或者能够引起化学基团或部 分显示可检测的物理性质的任何化合物，例如酶催化底物转化成可检测产物。术语“标记” 还包括抑制特定生理性质表达的化合物。标记还可以是作为结合对的一个成员的化合物， 其另一个成员则带有可检测的生理性质。本文所使用的“生物样品”是指例如从受治疗者中分离出来的组织或液体的样品， 包括但不限于例如血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼 泪、唾液、乳汁、细胞(包括但不限于血液细胞)、BD、器官，以及还有体外细胞培养物组分的样品。本文所使用的术语“生物源”是指例如从中得到靶多核苷酸的来源。来源可以是 如上所述的任何形式的“样品”，包括但不限于细胞、组织或体液。“不同的生物源”可指同 一个体的不同细胞/组织/器官，或来自同一物种不同个体的细胞/组织/器官，或来自不 同物种的细胞/组织/器官。术语“基因”是指例如(a)含有至少一个本文所公开的DNA序列的基因；(b)编码 由本文所公开的DNA序列编码的氨基酸序列的任何DNA序列；和/或(c)与编码本文所公 开的编码序列的互补序列杂交的任何DNA序列。优选该术语包括编码区以及非编码区，优 选包括正常基因表达所必需的所有序列，包括启动子、增强子和其它调节序列。"PXR基因”是指例如Genebank所包括的按以下登录号识别的序列NM_033013、 NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133 或登录号 075469、Q8SQ01、Q9R1A7、054915、NP_148934、NP_003880、NP_071285。当基因组 DNA 的片段定位于
内源性同源序列内以及与内源性同源序列重组时，便出现PXR基因的“破坏”。这些序列破 坏或修饰可包括插入、错义、移码、缺失或取代，或DNA序列的置换，或其任何组合。插入包 括可以是动物、植物、真菌、昆虫、原核来源或病毒来源的完整基因的插入。例如，破坏可以 改变或置换启动子、增强子或PXR基因的剪接位点，并可通过部分或完全抑制其产生，或者 通过提高正常基因产物的活性，来改变正常的基因产物。术语“转基因细胞”是指例如通过基因打靶方法在其基因组内含有遭完全或部分 破坏、修饰、改变或置换的PXR基因的细胞。术语“转基因动物”是指例如通过基因打靶的方法在其基因组内含有遭破坏的特 定基因的动物。转基因动物包括杂合子动物(例如一个缺陷型等位基因和另一个野生型等 位基因)和纯合子动物(例如两个缺陷型等位基因)。本文所使用的术语“选择标记”或“阳性选择标记”是指例如编码某一产物的基因， 该基因只能够使携带该基因的细胞在某些条件下存活和/或生长。例如，表达所导入的新 霉素抗性(NecZ)基因的植物和动物细胞对化合物G418具有抗性。没有携带Nec/基因标记 的细胞将被G418杀死。其它阳性选择标记为本领域技术人员所知。“宿主细胞”包括受治疗者细胞或细胞培养物，它们可以是或者就是载体的接受体 或掺入的核酸分子和/或蛋白质的接受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且子代 由于天然突变、偶发突变或蓄意突变所致，不一定与原亲本完全相同(在形态上或在整体 DNA互补性上)。宿主细胞包括用本公开内容的构建体转染的细胞。本文所使用的术语“调节”是指例如PXR功能、表达、活性或者与PXR基因的破坏 有关的表型的抑制、降低、增加或提高。关于PXR受体，模件还可包括改变受体的结合性质、 与受体结合、激活受体、与受体缔合和/或抑制受体的活性或分子与受体的相互作用。术语“改善”是指例如减少、减轻或消除病况、疾病、病症或表型(包括异常)或与 PXR基因中的破坏有关的症状。术语“异常”是指例如其中涉及PXR基因遭破坏的任何疾病、病症、病况或表型，包 括病理病症。利福霉素类抗生素是例如具有下式I结构的化合物
13 或者为结构A2: 其中，-χ-为共价化学键或无；R为氢或乙酰基；R1和R2独立表示氢、(Ch)烷基、苄氧基、一 _(C1J烷基氨基-(C^4)烷基和 二-(C1J烷基氨基-(C1J烷基、(Ch)烷氧基-(C1J烷基、羟基甲基、羟基-(C2_4)_烷基、 硝基或者R1和R2与吡啶核的两个连续碳原子结合在一起形成未取代或者被甲基或乙基中 的一个或两个取代的苯环；R3为氢原子或无；前提条件是，如果A为A1，则-χ-无且R3为氢 原子；且前提条件是，如果A为A2,则-χ-为共价化学键且R3无。本文还描述了如上定义的一种化合物，其中A为如上定义的A1或A2, -X-为共价 化学键或无，R为氢或乙酰基，RjPR2独立表示氢、沁_4)烷基、苄氧基、羟基_(C2_4)烷基、 二 -((V3)烷基氨基-(C1J烷基、硝基或者R1和R2与吡啶核的两个连续碳原子结合在一起 形成苯环，R3为氢原子或无；前提条件是，如果A为A1,则-χ无且R3为氢原子；且前提条件 是，如果A为A2,则-χ-为共价化学键且R3无。本文还描述了如上定义的一种化合物，其中A为如上定义的A1或A2, -χ-为共价化 学键或无，R为乙酰基，R1和R2独立表示氢、(C1^4)烷基或者R1和R2与吡啶核的两个连续碳原子结合在一起形成苯环，R3为氢原子或无；前提条件是，如果A为A1，则-χ无且R3为氢原 子；且前提条件是，如果A为A2,则-χ-为共价化学键且R3无。本文还描述了如上定义的一种化合物，它是4-脱氧-4' _甲基-吡啶并[Γ， 2' _1，2]咪唑并[5，4-c]利福霉素SV。本文还描述了如上定义的一种化合物，它是4-脱 氧-吡啶并[1' ,2' :1，2]咪唑并[5,4-c]利福霉素SV。本文还描述了如上定义的一种化合物，其中A如上定义，-X-为共价化学键或无; R为氢或乙酰基氓和R2独立表示氢、(Cy)烷基、苄氧基、一和二(Cu)烷基氨基(Cy)烷 基、(Cu)烷氧基-(C1J烷基、羟基甲基、羟基-(C2_4)_烷基、硝基或者RjPR2与吡啶核的 两个连续碳原子结合在一起形成未取代或者被甲基或乙基中的一个或两个取代的苯环；r3 为氢原子或无；前提条件是，如果A为A1，则-χ无且R3为氢原子；且前提条件是，如果A为 A2,则-χ-为共价化学键且R3无。利福昔明是具有下式II结构的化合物 BD相关序列最初可通过与本文所列BD序列同源的大量核酸序列和/或氨基酸序列来鉴定BD 序列。这种同源性可以整个核酸序列或氨基酸序列为基础，并且一般按照下述方法采用同 源程序或杂交条件来确定。在一个实施方案中，BD序列是在BD中上调的序列；也就是说，这 些基因在BD组织中的表达比正常组织的高。本文所使用的“上调”是指表达增加约50%， 优选约100%，更优选约150% 约200%，其中上调300% 1000%。在另一个实施方案中，BD序列是在BD中下调的序列；也就是说，在BD组织中这些 基因的表达比同一分化期的正常组织的低。本文所使用的“下调”是指表达降低约50%，优 选约100%，更优选约150% 约200%，其下调300% 1000%至无表达。在又一个实施方案中，BD序列是与同一分化期的正常淋巴组织相比，序列发生改 变但具有相同表达谱或经改变的表达谱的序列。本文所使用的“经改变的BD序列”还指例 如经过截短的序列、含有插入或含有点突变的序列。 在一个实施方案中，BD序列是跨膜蛋白。跨膜蛋白是跨越细胞的磷脂双层的分子。 它们可具有胞内结构域、胞外结构域或两者兼有。这类蛋白质的胞内结构域可具有多种功 能，包括已披露的胞内蛋白的功能。该蛋白质还可是胞内蛋白、核内蛋白或分泌蛋白。
一般来讲，本文所使用的术语“多肽”是指例如由所列举的多核苷酸编码的全长多 肽和由所列举的多核苷酸所代表的基因编码的多肽两者以及其部分或片段。本发明包括 天然存在的蛋白质的变体，其中这类变体与天然存在的蛋白质同源或基本类似，并且可以 是来源于相同或不同的物种作为天然存在的蛋白质形式(例如天然表达所列举的多肽的 人、鼠或某些其它物种，通常为哺乳动物物种)。一般来讲，多肽变体具有与本文所述的差 异表达的多肽有至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约 85 %、至少约86 %、至少约87 %、至少约88 %、至少约89 %、通常至少约90 %、至少91 %、至 少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%以上通常至少约 99%序列同一性的序列。属于本发明范围内的还有变体。多肽的变体包括突变体、片段和融合体。突变体 可包括氨基酸取代、加入或缺失。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或以排除非必需氨基 酸的取代，例如改变糖基化位点、磷酸化位点或乙酰化位点，或者通过取代或缺失不是功能 所必需的一个或多个半胱氨酸残基使错折叠降到最低。保守氨基酸取代是保持被取代氨基 酸的正常电荷、疏水性/亲水性和/或空间位阻的取代。可以对变体进行设计以保持或提 高蛋白质特定区域(例如功能结构域和/或当多肽是蛋白质家族的成员时与共有序列有关 的区域)的生物活性。变体还包括本文所公开的多肽的片段，特别是生物活性片段和/或相当于功能结 构域的片段。目标片段的长度通常可为至少约8个氨基酸(aa)、10aa、15aa、20aa、25aa、 30aa、35aa、40aa 至少约45aa，长度通常为至少约50aa、至少约75aa、至少约lOOaa、至少 约125aa、长度至少约150aa、至少约200aa、至少约300aa、至少约400aa，长度可长达500aa 或更长，但是长度通常不会超过约lOOOaa，其中所述片段可具有一氨基酸序列段，该氨基酸 序列段与由具有任一种本文所提供的多核苷酸序列的序列的多核苷酸或其同源物编码的 多肽具有同一性。本文所述的蛋白质变体由属于本发明范围的多核苷酸编码。可使用遗传 密码选择适当的密码子来构建相应的变体。虽然观察到与BD有关的多核苷酸的表达发生改变，但是由这些多核苷酸编码的 多肽表达水平的改变很可能在BD中起作用。在一个实施方案中，BD蛋白定义中还包括BD家族的其它BD蛋白，以及得自其它 生物的如下述方法克隆和表达的BD蛋白。因此，可采用探针或简并聚合酶链式反应(PCR) 引物序列从人或其它生物中寻找其它相关的BD蛋白。正如本领域技术人员应了解的一样， 特别有用的探针和/或PCR引物序列包括BD核酸序列的独特区域。正如本领域普遍所知 的一样，某些PCR引物长度为约15 约35个核苷酸，其中约20 约30个是确定的，并且 按需要可含有肌苷。PCR反应的条件是本领域众所周知的。另外，如本文中所述，例如，可以 通过说明的额外序列、加入表位或纯化标签、加入其它融合序列等，产生比所述数目的核酸 编码的BD蛋白长的BD蛋白。还可鉴定BD蛋白是由BD核酸编码的。因此，BD蛋白由与本 文列举的序列表的序列或其互补序列杂交的核酸编码。最初用与本文所列BD序列同源的实体核酸序列和/或氨基酸序列来鉴定BD序 列。这种同源性可以整个核酸序列或氨基酸序列为基础，并且一般按照下述方法采用同源 程序或杂交条件来确定。如果核酸序列相对于本文所述核酸之一的总体同源性优选大于约75%、大于约80 %、大于约85 %或大于90 %，则本文所使用的核酸是“BD核酸”。在一些实施方案中，同 源性高达约93% -95%或98%。在一个实施方案中，用来确定序列同一性或相似性的序列 选自本文所述核酸的序列。在另一个实施方案中，序列是本文所述的核酸序列的天然存在 的等位基因变体。在另一个实施方案中，序列是本文进一步描述的序列变体。在这个方面的同源性是指序列相似性或同一性。出于同源性目的的比较是将含 有测序错误的序列与正确序列进行比较。这种同源性可以应用本领域的标准技术来确 定，包括但不限于Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv. App 1. Math. 2 482(1981)) ；Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法(Needleman 和 Wunsch， J. Mol. Biol. 48 443 (1970)) ；Pearson 和 Lipman 的相似性检索方法(Pearson 和 Lipman， PNAS USA 85:2444(1988))；这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、 BESTFIT、FASTA禾口 TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Drive,Madison, Wis.)； Devereux 等人的最佳拟合序列程序(Devereux 等，Nucl. Acid Res. 12 :387_395 (1984))，优 选使用默认设置；或者通过检查。有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP采用渐进成对 比对，从一组相关序列中产生多序列比对。它还可画一个树状图显示用来产生比对的聚类 关系。PILEUP应用 Feng和Doolittle 的渐近比对方法(Feng和 Doolittle，J. Mol. Evol. 35 351-360(1987))的简化法；该方法类似于 Higgins 和 Sharp CABIOS 5 151-153 (1989)描 述的方法。有用的PILEUP参数包括默认空位权重(gzp weight) 3. 00、默认空位长度权重 (gap length weight) 0. 10和加权末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST (基本局部 比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool))算法，参见 Altschul 等，J. Mol. Biol. 215,403-410, (1990)和 Karlin 等，PNAS USA90 :5873_5787 (1993)。一个特别有 用的BLAST程序是从Altschul等人获得的WU-BLAST-2程序[Altschul等，Methods in Enzymology, 266 460-480 (1996) ；http //blast, wustl. edu/]。WU-BLAST-2 采用若干个检 索参数，其大多数设置成默认值。可调节参数用下列值设置重叠跨距(overlap span)= 1，重叠部分(overlap fraction) =0. 125，字阈值(wordthreshold) (T) = 11。HSP S和 HSP S2参数是动态值，是由程序本身根据具体序列的组成和针对其进行目标序列检索的具体数 据库的组成来设定的；然而，可以调节这些值以提高灵敏度。用匹配的相同残基数除以比 对区中“较长”序列的残基总数，求出氨基酸序列同一性百分比值。“较长”序列是在比对区 中具有最多实际残基的序列(由WU-Blast-2引入以使比对分值最大化的空位忽略不计)。 因此，“百分比(％)核酸序列同一性”定义为候选序列中与以下登录号的核酸的核苷酸残 基相同的核苷酸残基的百分比NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、 CS618135 或 CS618133。在本发明的另一个实施方案中，提供能够在中等严格性条件至高严格性条件下与 本文所提供的多核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交的多核苷酸组成成分。杂交技术是 分子生物学领域众所周知的。出于说明目的，用于测定本发明的多核苷酸与其它多核苷酸 杂交的合适的中等严格性条件包括在5X SSC( “柠檬酸钠盐水(saline sodiumcitrate)"； 9mM NaCl,0. 9mM柠檬酸钠)、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH 8. 0)的溶液中预洗涤；在50_60°C、 5X SSC中杂交过夜；接着在65°C下用含有0. 1%SDS的2X、0. 5X和0. 2X SSC的每一种洗 涤20分钟。本领域技术人员应了解的是可容易地控制杂交的严格性，例如通过改变杂交溶 液的含盐量和/或进行杂交的温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高严格性杂交条件
17包括上述条件，只是提高杂交温度至例如60-65°C或65-70°C。还可随着加入去稳定剂(例 如甲酰胺)而达到严格性条件。另外，本发明的BD核酸序列是较大基因的片段，例如，它们是核酸区段。或者，BD 核酸序列可用作癌基因位置的标志，例如，BD序列可以是激活原癌基因的增强子。在这个方 面的“基因”包括编码区，非编码区以及编码和非编码区的混合区。因此，正如本领域技术 人员应了解的一样，应用用于克隆较长序列或全长序列的本领域众所周知的技术，使用本 文所提供的序列，可以获得BD基因的额外序列；参见Maniatis等和Ausubel等(同上)， 特此通过引用明确予以结合。一般来讲，这可采用PCR，例如动力学PCR来进行。BD表达的检测一旦鉴定出BD核酸，就可以进行克隆，且必要时可将其组成部分进行重组形成完 整的BD核酸。一旦从其天然来源，例如，包含在质粒或其它载体内分离出来，或由其切离， 形成线性核酸区段，就可将重组BD核酸进一步用作鉴定和分离其它BD核酸(例如附加编 码区)的探针。它还可用作“前体”核酸以获得经修饰的BD核酸和蛋白质或变体BD核酸 和蛋白质。在一个实施方案中，一旦鉴定出BD基因，其核苷酸序列便可用来设计对BD基因 有特异性的探针。本发明的BD核酸以若干种方式使用。在第一个实施方案中，制成可与BD核酸杂交 的核酸探针，并与将用于筛选和诊断方法或基因疗法和/或反义应用的生物芯片连接。或 者，将包括BD蛋白编码区的BD核酸放入表达载体中用于BD蛋白表达，此外用于筛选目的 或用于给予受治疗者。DNA微阵列技术的最新近展使得在单个固相支持体上对大量靶BD核酸分子进行 大规模测定成为可能。美国专利第5，837，832号(Chee等)和相关专利申请描述了使一系 列寡核苷酸探针固定化以用于样品中特定核酸序列的杂交和检测。使从目标组织分离的目 标靶多核苷酸与DNA芯片杂交，根据离散的探针位置上靶多核苷酸的偏好和杂交的程度检 出特定序列。阵列的一种用途在于对差异性基因表达进行分析，其中对不同细胞(常常为 目标细胞和对照细胞)中基因的表达谱进行比较，并鉴定出相应细胞中基因表达的任何差 异。这类信息可用于鉴定在特定细胞或组织类型中表达的基因类型，并根据表达谱对BD病 况进行诊断。参见美国专利第6，410，229号(Lockhart等)。例如，采用cDNA微阵列对人类 癌症的基因表达形式进行分析可参见DeRisi等(Nature Genetics 14:457-460(1996))。在某些实施方案中，探针可以是嵌合分子；例如，可包含一种以上类型的碱基或糖 亚基，和/或在同一引物内可存在不只一种类型的键。探针可包含促进与其靶序列杂交的 部分，正如本领域已知的一样，例如嵌入剂和/或小沟结合物。碱基、糖和核苷酸间主链的 变化以及探针上任何侧基的存在，都应与探针以序列特异性方式与其靶序列结合的能力相 适应。在这些界限内，大量已知和待开发的结构修饰都是可行的。有利的是，本发明的探 针可能具有可供信号放大之用的结构特征，这类结构特征为例如Urdea等(Nucleic Acids Symp. Ser. ,24 197-200 (1991))或欧洲专利第EP-0225，807号所描述的分支DNA探针。此 外，用于制备形成探针的各种杂环碱基、糖、核苷和核苷酸的合成方法，以及预先确定的特 定序列的寡核苷酸的制备法都得到充分了开发并且是本领域已知的。用于寡核苷酸合成的 一种方法结合了美国专利第5，419，966号的教导。在一个实施方案中，使用编码BD蛋白的BD核酸以制备各种表达载体，以表达BD
18蛋白，BD蛋白然后可用于如下所述的筛选实验。表达载体可以是自我复制的染色体外载体 或整合到宿主基因组的载体。这些表达载体一般包括与编码BD蛋白的核酸有效连接的转 录和翻译的调节核酸。术语“控制序列”是指例如有效连接的编码序列在特定宿主生物中 进行表达所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选操纵子序列 和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。当核酸被置于与另一核酸序列具有功能关系的位置时，该核酸是“有效连接的”。 例如，如果要表达成为参与某一多肽分泌的前蛋白质，则将前序列或分泌前导序列的DNA 与该多肽的DNA有效连接；如果要影响某一序列的转录，则将启动子或增强子与该编码序 列有效连接；或者如果将某一编码序列定位以促进翻译，则将核糖体结合位点与该编码序 列有效连接。“有效连接” 一般是指被连接的DNA序列是邻接的，而且在分泌前导序列的情 况下，是邻接并在读框(reading phase)中。然而，增强子不必是邻接的。本领域已知用于 各种宿主细胞的多种适当表达载体的类型和合适调节序列。一般来讲，转录和翻译调节序列可包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转 录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列以及增强子或激活物序列。在一个实施 方案中，调节序列包括启动子及转录起始序列和终止序列。启动子序列编码组成型启动子 或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或杂合启动子。结合不只一个启动子的 元件的杂合启动子也是本领域已知的，并可用于本发明。另外，表达载体可包含另外的元件。例如，表达载体可能具有两个复制系统，因此 允许它保持在两种生物中，例如在哺乳动物或昆虫细胞中用于表达，以及在原核宿主中用 于克隆和扩增。另外，在一个实施方案中，表达载体含有供选择转化的宿主细胞之用的选择 标记基因。筛选基因是本领域众所周知的，并随所采用的宿主细胞而变化。可通过例如在合适的条件下，对用含有BD蛋白编码核酸的表达载体转化的宿主 细胞进行培养，诱导或引起BD蛋白的表达，来产生本发明的BD蛋白。适于BD蛋白表达的 条件将随选择的表达载体和宿主细胞而变化，并且可由本领域技术人员通过常规实验方法 容易地加以确定。例如，在表达载体中，组成型启动子的使用将需要使宿主细胞的生长和增 殖最优化，而诱导型启动子的使用则需要适于诱导的适当生长条件。另外，在一些实施方案 中，收获时机很重要。例如，用于昆虫细胞表达的杆状病毒系统是裂解病毒，因此收获期选 择对于产物产量可能是至关重要的。还可以采用本领域众所周知的技术，将BD蛋白制成融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的BD核酸、蛋白质和抗体是经标记的。所谓“标记的” 在本文中是指化合物是直接或间接标记的，并可具有至少一个提供可检测信号的元件，例 如，所连接的同位素或化合物使得能够检出所述化合物。标记一般包括可以是放射性同位 素或重同位素的同位素标记、磁性标记、酶标记、可以是抗体或抗原的免疫标记以及着色染 料或荧光染料。可将标记掺到BD核酸、蛋白质和抗体的任何位置上。例如，标记应能够 直接或间接产生可检测信号。可检测的部分可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或 125I ；荧光或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明；或萤光素；或酶，例如碱性磷 酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可以采用本领域已知的用于将抗体与标记缀合 的任何方法，包括以下文献所描述的方法Hunter等，Nature, 144 =945(1962) ；David等， Biochemistry, 13 1014(1974) ；Pain 等，J. Immunol. Meth. ,40 219(1981)；以及 Nygren，J. Histochem. and Cytochem. ,30 =407(1982)。其它标记可包括特异性结合分子。特异性结 合分子包括一对，例如生物素和链霉抗生物素、地高辛和抗地高辛(antidigoxin)等。对于 特异性结合成员，互补成员通常根据上述已知方法用供检测之用的分子进行标记。该标记 可以直接或间接提供可检测信号。在一个实施方案中，通过竞争性结合测定法确定候选生物活性剂的结合。在该实 施方案中，竞争剂是已知与靶分子(例如BD蛋白)结合的结合部分，例如抗体、肽、结合配 偶体、配体等。在某些情况下，在生物活性剂和结合部分之间可能存在竞争性结合，其中结 合部分置换生物活性剂。BD抗原和其抗体在一个实施方案中，本发明提供BD特异性抗体。在一个实施方案中，当使用BD蛋 白以产生抗体时，例如对于免疫疗法，BD蛋白应与全长蛋白有共同的至少一个表位或决定 子。所谓“表位”或“决定子”在本文中是指在MHC情况下可产生和/或结合抗体或T细胞 受体的蛋白质的部分。因此，在多数情况下，针对较小BD蛋白制成的抗体将能够与全长蛋 白结合。在一个实施方案中，表位是独特的；也就是说，针对独特表位制成的抗体几乎没有 或没有交叉反应性。可对由BD多核苷酸序列编码的任何多肽序列进行分析以确定多肽的 某些区域。例如，通过选择代表在某一环境下很可能暴露在多肽表面的多肽区域的数值，经 DNASTAR分析由数据确定高抗原性的区域，在所述环境中，在引发免疫应答的过程中可发生 抗原识别。例如，采用DNASTAR计算机算法(DNASTAR，Inc.，Madison, Wis.；参见万维网 dnastar. com)的默认参数，对由BD多核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列进行了分析。在一个实施方案中，术语“抗体”包括本领域已知的抗体片段，包括Fab、Fab2、单链 抗体(例如Fv)、嵌合抗体等，或通过完整抗体的修饰产生，或应用重组DNA技术从头合成。 制备多克隆抗体的方法为本领域技术人员所知。多克隆抗体可在哺乳动物内产生，例如，通 过免疫剂和佐剂(如有需要)的一次或多次注射。或者，抗体可以是单克隆抗体。单克隆 抗体可采用杂交瘤方法制备，例如Kohler和Milstein，Nature, 256 =495(1975)所描述的 杂交瘤。在一个实施方案中，抗BD抗体能够降低或消除BD的生物功能，正如下面所描述的 一样。也就是说，将抗BD抗体(多克隆或优选单克隆)加到BD (或含有BD的细胞)可降 低或消除BD活性。在一个实施方案中，抗BD蛋白的抗体是人源化抗体。“人源化”抗体是 这指样一种分子，该分子具有基本上得自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合部位，该分 子的其余免疫球蛋白结构以人免疫球蛋白的结构和/或序列为基础。抗BD蛋白的特异性 抗体，或为多克隆，或为单克隆，都可通过上面论述的本领域已知的任何合适方法产生。例 如，鼠或人单克隆抗体可通过杂交瘤技术产生，或者可将BD蛋白，或其免疫活性片段，或抗 独特型抗体，或其片段给予动物以诱导能够识别和结合BD蛋白的抗体的产生。这类抗体可 得自任何抗体类别，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，或者在鸟类品种的情况下为 IgY，以及得自任何抗体亚类。在另一确定的实施方案中，产生抗体所针对的BD蛋白为跨膜蛋白。虽然不受理论 的束缚，但是用于治疗的抗体与BD蛋白的胞外结构域结合，并阻止它与其它蛋白质结合， 例如循环配体或细胞缔合分子。抗体可引起跨膜BD蛋白的下调。正如本领域技术人员所了 解的一样，抗体可以是蛋白质与BD蛋白胞外结构域结合的竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂 或反竞争性抑制剂。抗体还是BD蛋白的拮抗剂。此外，抗体阻止跨膜BD蛋白的活化。一方面，当抗体阻止其它分子与BD蛋白结合时，抗体便阻止了细胞的生长。抗体还可使细胞 对细胞毒剂或化疗药物产生敏化，细胞毒剂包括但不限于TNF- α、TNF- β、IL-UINF- γ和 IL-2，化疗药物包括5FU、长春碱、放线菌素D、顺钼、甲氨蝶呤等。在一些情况下，所述抗体 属于当与跨膜蛋白复合时便激活血清补体因此介导细胞毒性的亚型。因此，通过给予受治 疗者针对跨膜BD蛋白的抗体可以治疗BD。在另一确定的实施方案中，抗体与治疗部分缀合。一方面，所述治疗部分是调节BD 蛋白活性的小分子。另一方面，所述治疗部分调节与BD蛋白缔合或与BD蛋白紧密相邻的 分子的活性。所述治疗部分可抑制酶活性，例如与BD有关的蛋白酶或蛋白激酶活性。在另一确定的实施方案中，产生抗体所针对的BD蛋白是胞内蛋白。在这种情况 下，抗体可与有利于进入细胞的蛋白质缀合。在一种情况下，抗体通过胞吞进入细胞。在另 一个实施方案中，将编码抗体的核酸给予个体或细胞。此外，其中BD蛋白可被靶定在细胞 (例如核)内，其抗体含有用于所述靶定位的信号，例如核定位信号。本发明的BD抗体与BD蛋白特异性结合。所述“特异性结合”在本文中是指抗体 与蛋白质结合的结合常数的范围为104-10_6M，其中一个范围为10_7-10_9M。在一个实施方案 中，BD蛋白在表达后进行纯化或分离。可通过本领域已知的各种方法，根据样品中存在的 其它组分，来分离或纯化BD蛋白。本文所述抗体的产生包括例如用于产生能够特异性识别一个或多个表位的抗体 的方法。这类抗体可包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化或嵌合抗体、单链 抗体、Fab片段、F (ab' ) 2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体以及上 述任一种的表位结合片段。例如在检测生物样品中的PXR基因时，又或者作为用于抑制异 常PXR基因活性的方法时，都可使用这类抗体。因此，这类抗体可用作疾病治疗方法的组成 部分，和/或可用作诊断技术的组成部分，可籍此测出受治疗者PXR基因蛋白的异常水平， 或测出这类蛋白质的异常形式的存在。对于抗体的产生，可通过注射PXR基因、其表达产物或其部分来免疫各种宿主动 物。这类宿主动物可包括但不限于兔、小鼠、大鼠、山羊和鸡等等。各种佐剂可用于增强免疫 应答，这取决于宿主物种，佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、氢氧化铝等矿物 凝胶(mineral gel)、溶血磷脂酰胆碱等表面活性物质、普流罗尼克多元醇、聚阴离子、肽、 油乳液、匙孔蜮血蓝蛋白、二硝基苯酚及潜在有益的人用佐剂，例如BCG (卡介苗)和短小棒 状杆菌(Corynebacteriumparvum)。多克隆抗体是从用抗原(例如PXR基因产物)或其抗原功能衍生物免疫的动物的 血清中获得的异质群的抗体分子。为了产生多克隆抗体，可通过注射补充了上述佐剂的基 因产物，来免疫宿主动物，例如同样如上所述的动物。单克隆抗体，是抗特定抗原的同质群的抗体，可通过供培养物中的传代细胞 系产生抗体分子之用的任何技术获得。这些包括但不限于杂交瘤技术(Kohler和 Milstein, Nature, 256 :495_7(1975)和美国专利第 4，376，110 号))；人 B 细胞杂交瘤技 术(Kosbor 等，Immunology Today，4 :72 (1983) ；Cote 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 2026-30(1983))；以及 EBV 杂交瘤技术(Cole 等，Monoclonal Antibodies And BDTherapy, Alan R. Liss，Inc.，New York，第77-96页(1985))。这类抗体可以是任何免疫球蛋白类别， 包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。产生本公开内容的mAb的杂交瘤可以在体外或体内进行培养。体内产生高效价的mAb构成本发明的某些产生方法。另外，可采用开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,81 6851-6855(1984) ；Takeda 等，Nature，314 :452_54 (1985))，该技术通过将得自具 有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与得自具有合适生物活性的人抗体分子的基因 剪接在一起。嵌合抗体是其中不同部分得自不同动物物种的分子，例如具有得自鼠mAb的 可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。或者，可以采用所述用于产生单链抗体的技术(美国专利第4，946，778号；Bird， Science 242:423-26(1988) ；Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 85 5879-83 (1988)； 以及Ward等，Nature, 334 544-46 (1989))来产生基因-单链抗体。单链抗体通常通过氨 基酸桥使Fv区的重链和轻链片段连接形成，从而产生单链多肽。识别特定表位的抗体片段可通过已知技术产生。例如，这类片段包括但不限于可 通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab' )2片段，以及通过还原F(ab' )2片段的二硫键 产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，Science，246 1275-81 (1989))， 以供快速和容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。BD表型的检测一旦经表达和纯化，必要时，BD蛋白和核酸便可用于多种应用。一方面，测定在BD 表型中不同细胞状态的基因表达水平；也就是说，评价正常组织中和BD组织中基因的表达 水平以提供表达谱。特定细胞状态或发育点的表达谱是所述状态的重要“指纹”；虽然两种 状态可能具有进行类似表达的任何特定基因，但是同时评价多种基因可供产生对于所述细 胞状态是唯一的基因表达谱。通过比较不同状态中细胞的表达谱，获得在这些状态的每一 个中有关该基因的信息(包括基因的上调和下调)。然后，可进行诊断或确定例如得自具体 受治疗者的组织是否具有正常组织或BD组织的基因表达谱。在一个实施方案中，将本文所述的三类蛋白质(分泌蛋白、跨膜蛋白或胞内蛋白) 中的任一类用于诊断实验。将BD蛋白、抗体、核酸、修饰蛋白和含有BD序列的细胞用于诊 断实验。这可在受治疗者基因水平或相应的多肽水平上进行，或者作为一组实验进行。在另一个确定的方法中，抗BD蛋白的抗体应用于原位成像技术。在这种方法中， 使细胞与多种抗BD蛋白抗体中的一种接触。在洗涤除去非特异性结合的抗体之后，检测一 种或多种抗体的存在。在一个实施方案中，通过与含有可检测标记的第二抗体一起孵育来 检测抗体。在另一种方法中，第一抗BD蛋白抗体含有可检测标记。在另一确定的实施方案 中，多种第一抗体的每一种中含有独特的可检测标记。该方法特别应用于多种BD蛋白的同 时筛选。正如本领域技术人员所了解的一样，多种其它组织学成像技术可用于本发明。要了解的是，在受治疗者和标准之间进行表达指纹比较时，技术人员可做出诊断 以及预后。此外还要了解的是，指示诊断结果的基因可不同于指示预后结果的基因。筛选候选组合物在一个实施方案中，任一个本文所述的BD序列都可用于药物筛选实验。BD蛋白、 抗体、核酸、修饰蛋白和含有BD序列的细胞或用于药物筛选实验，或评价候选药物对“基因 表达谱”或多肽表达谱的作用。在一个实施方案中，表达谱优选与高通量筛选技术联用，以 供在用候选药剂治疗之后监测表达谱基因(Zlokarnik等，Science 279,84-8 (1998), Heid 等，Genome Res.，6 :986_994 (1996))。
在另一个实施方案中，在细胞筛选实验中使用BD蛋白、抗体、核酸、修饰蛋白和含 有天然或修饰的BD蛋白。也就是说，本发明提供用于筛选调节BD表型的组合物的新方法。 如上所述，这可以通过筛选基因表达的调节剂或蛋白质活性的调节剂来进行。同样，这可在 受治疗者的基因水平或蛋白质水平上或者通过评价候选药物对“基因表达谱”的作用来进 行。在一个实施方案中，表达谱优选与高通量筛选技术联用，以供在用候选药剂治疗之后监 测表达谱基因，参见Zlokarnik，同上。在鉴定出本文的BD基因后，可以进行多种实验以评价药剂对基因表达的作用。在 一个实施方案中，实验可以在受治疗者的基因水平或蛋白质水平上进行。也就是说，鉴定出 作为在BD中异常调节的特定基因时，可对候选生物活性剂进行筛选以调节基因的调节。因 此，“调节”包括基因表达或活性的增加和降低。特定的调节量将取决于正常组织相对于BD 组织的基因表达的起始变化，其中变化至少10%，优选50%，更优选100-300%，在一些实 施方案中为300-1000%或更高。因此，如果与正常组织相比，基因在BD中增加4倍，则需要 候选药剂降低约4倍；与正常组织相比在BD中得到10倍的降低，则在表达中需要候选药剂 增加10倍等。或者，如果BD序列发生了改变却具有相同的表达谱或变化的表达谱，则蛋白 质按照本文所述进行检测。正如本领域技术人员应了解的一样，这可通过在基因水平或蛋白质水平上的评价 来进行；也就是说，可以采用核酸探针和基因表达水平的定量测定来监测基因表达的量，又 或者，可以通过例如使用抗BD蛋白抗体和标准免疫测定法来监测基因产物本身的水平。或 者，可按下述方法进行与蛋白质的结合和生物活性测定。在一个实施方案中，进行了基因表达监测，同时监测了多种基因(例如表达谱)， 虽然也可进行多种蛋白质表达监测。在一个实施方案中，一般在分析之前将候选生物活性剂加到细胞中。此外，提供鉴 定调节特定BD类型、调节BD蛋白、结合BD蛋白或干扰BD蛋白与抗体结合的候选生物活性 剂的筛选法。本文所使用的术语“候选生物活性剂”、“候选活性剂”、“候选组合物”或“候选药 物”或语法上的等同术语描述了待用于生物活性剂测定的任何分子，例如蛋白质、寡肽、有 机小分子或无机小分子、多糖、多核苷酸等，所述生物活性剂能够直接或间接改变BD表型、 结合BD蛋白和/或调节BD蛋白的生物活性或BD序列(同时包括核酸序列和蛋白质序列) 的表达。在一个特别确定的实施方案中，候选活性剂抑制BD表型以达到例如正常组织指 纹。同样，候选活性剂优选抑制严重的BD表型。一般将多种实验混合物与不同浓度的活性 剂一起平行进行以获得对各种浓度的不同反应。通常，这些浓度之一用作阴性对照，例如， 在0浓度下或在检出水平以下。一方面，候选活性剂可中和BD蛋白的作用。所谓“中和”是指蛋白质的活性被抑 制或被抵消使得基本上对细胞无作用。候选活性剂包括多种化合物类别，虽然它们通常是有机分子或无机分子，优选分 子量大于100道尔顿且小于约2，500道尔顿的有机小分子化合物。小分子可以是例如小于 2000D，或小于1500D或小于1000D或小于500D。候选活性剂包含与蛋白质相互作用的结构 上所必需的官能团，特别是氢键，通常包括至少胺基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个官能 化学基团。候选活性剂常常包含环碳或杂环结构和/或被一个或多个上述官能团取代的芳族结构或聚芳结构。还存在于生物分子中的候选活性剂包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、 嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。候选活性剂可获自各种来源，包括合成化合物文库或天然化合物文库。例如，可利 用多种用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子(包括随机化寡核苷酸的表达)的 方法。或者，可获得或容易产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此 外，通过常规的化学、物理和生物化学方法，容易对天然文库或经合成产生的文库和化合物 进行修饰。可以对已知的药物进行定向或随机化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化或酰胺化 以产生结构类似物。在一个实施方案中，候选生物活性剂是蛋白质。在一个实施方案中，候 选生物活性剂是天然存在的蛋白质或天然存在的蛋白质的片段。因此，例如，可以使用含有 蛋白质的细胞提取物，或者随机或定向消化的蛋白质性质的细胞提取物。这样，可以制备原 核蛋白和真核蛋白的文库用于本发明方法的筛选。在一些实施方案中，文库由例如细菌、真 菌、病毒和哺乳动物蛋白质构成。在另一个实施方案中，候选生物活性剂是约5 约30个氨基酸、约5 约20个氨 基酸或约7 约15个氨基酸的肽。所述肽可以是如上所述的天然存在的蛋白质的消化物、 随机肽或“有偏(biased)”随机肽。在一个实施方案中，候选生物活性剂是核酸。正如对于蛋白质的一般描述中所述， 核酸候选生物活性剂可以是天然存在的核酸、随机核酸或“有偏”随机核酸。在另一个实施 方案中，候选生物活性剂是有机化学部分，在文献中可获得大量的候选生物活性剂。在进行测定期间或之后，对数据进行分析以确定表达水平和状态之间各个基因表 达水平的变化，以形成基因表达谱。在一个实施方案中，对于诊断和预测应用，在任一种状态中鉴定出差异表达基因 或突变基因时，可以进行筛选以检测各种BD基因表达的变化。也就是说，可以对单一基因 表达调控的调节进行筛选。因此，例如，在两种状态之间靶基因的存在或不存在是唯一的情 况下，对靶基因表达的调节剂进行筛选。在一个实施方案中，候选生物活性剂是经标记的。 将候选生物活性剂或竞争剂或两者先加到蛋白质(如存在的话)中达足够的时间使之结 合。孵育可以在有利于最佳活性的任何温度下进行，温度通常介于4°C和40°C之间。选择 适于最佳活性的孵育期，但是也可使之最优化以利于快速的高通量筛选。通常在0. 1小时 和1小时之间便足够。一般除去或洗去过量的试剂。然后加入第二组分，根据标记组分的 存在或不存在来说明结合。在一个实施方案中，首先加入竞争剂，接着加入候选生物活性剂。竞争剂的置换表 明候选生物活性剂与BD蛋白结合，因此能够结合BD蛋白并可能调节BD蛋白的活性。在该 实施方案中，任一种组分都可以是标记的。因此，例如，如果竞争剂是标记的，洗涤溶液中标 记的存在则表明被活性剂置换。或者，如果候选生物活性剂是标记的，支持体上标记的存在 则表明置换。在一个替代性实施方案中，先加入候选生物活性剂，孵育并洗涤，接着加入竞争 剂。由竞争剂所引起的结合不存在可表明生物活性剂以较高亲和力与BD蛋白结合。因此， 如果候选生物活性剂是标记的，支持体上标记的存在，同缺乏竞争剂结合联系起来，可表明 候选活性剂能够与BD蛋白结合。在一个实施方案中，所述方法包括示差筛选以鉴定(identity)能够调节BD蛋白活性的生物活性剂。在该实施方案中，所述方法包括在第一样品中将BD蛋白和竞争剂混 合。第二样品包含候选生物活性剂、BD蛋白和竞争剂。测定两种样品中竞争剂的结合，两种 样品之间结合的变化或差异表明存在能够结合BD蛋白和可能调节其活性的活性剂。也就 是说，如果与第一样品相比，在第二样品中竞争剂的结合有所不同，则活性剂能够与BD蛋
还可对调节BD蛋白活性的活性剂进行筛选。在一个实施方案中，用于筛选能够调 节BD蛋白活性的生物活性剂的方法包含将候选生物活性剂加到上述BD蛋白的样品中，并 测定BD蛋白的生物活性的变化的步骤。“调节BD蛋白活性”包括活性的提高、活性的降低 或存在的活性类型或种类的变化。因此，在该实施方案中，候选活性剂应与BD蛋白结合(虽 然这可并非是必需的)，并如本文所述改变其生物活性或生化活性。所述方法包括如上文中 所概述的体外筛选方法，以及体内筛选在BD蛋白的存在、分布、活性或量方面发生变化的 细胞。因此，在该实施方案中，所述方法包括将BD样品和候选生物活性剂混合，并评价 对BD活性的作用。所谓“BD活性”或本文语法上的等同术语是指BD蛋白的生物活性之一， 包括但不限于其在BD中的作用。在一个实施方案中，BD蛋白的活性提高；在另一个实施方案中，BD蛋白的活性降 低。因此，在一些实施方案中，生物活性剂是拮抗剂，在其它实施方案中，生物活性剂是激动 剂。应用在一个实施方案中，提供抑制BD的方法。在另一个实施方案中，提供改善BD的方 法。在又一个实施方案中，提供治疗具有BD的细胞或患有BD的个体的方法。所述方法包括给予BD抑制剂。在具体的实施方案中，BD抑制剂为反义分子、药物 组合物、治疗剂或小分子、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在具体的实施 方案中，治疗剂与抗体、优选单克隆抗体偶联。在具体的实施方案中，BD抑制剂为PXR激活 物，例如利福霉素类似物。利福霉素类似物包括例如利福昔明和利福霉素。在其它实施方案中，提供用于检测或诊断受治疗者的BD细胞的方法。在具体的实 施方案中，诊断剂/检测剂是优先结合本发明BDP的小分子。在一个实施方案中，诊断剂/ 检测剂是抗体，例如任选与可检测试剂连接的单克隆抗体。在本发明的其它实施方案中，提供动物模型和转基因动物，用于产生BD动物模型。反义分子(antisense)、核酶和抗体可用作治疗药的其它物质包括PXR基因、其表达产物及其功能片段。此外，降低或 抑制突变型PXR基因活性的物质可用来改善疾病症状。这类物质包括反义分子、核酶和三 股螺旋分子。本领域技术人员熟知用于产生和使用这类分子的技术。核酶是能够催化RNA特异性切割的具有酶特性的RNA分子。核酶的作用机制涉及 核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，接着进行内核降解切割。核酶分子的组成必须 包括一种或多种与PXR基因mRNA互补的序列，并且必需包括众所周知的负责mRNA切割的 催化序列。有关该序列可参见美国专利第5，093，246号，所述专利通过引用其全部结合到 本文中。因此属于本公开内容的范围的有工程改造的锤头状基序核酶分子，它特异性并有效地催化编码PXR基因蛋白的RNA序列的内核降解切割。通过仔细研究包括下列序列GUA、GUU和GUC在内的核酶切割位点的目标分子，初 步鉴定出任何可能的RNA靶标内的特异性核酶切割位点。一经鉴定，便可以评价介于15个 和20个核糖核苷酸之间的短RNA序列(相当于含有切割位点的PXR基因的区域)的预计 结构特征，例如可能提供不适当的寡核苷酸序列的二级结构。应用核糖核酸酶保护实验，通 过测定候选序列与互补寡核苷酸杂交的可及性，可以评价候选序列的适合性。用于三股螺旋形成以抑制转录的核酸分子应为单链，并由脱氧核糖核苷酸组成。 必需通过Hoogsteen碱基配对法则，设计这些寡核苷酸的碱基组成以促使三股螺旋形成， 这一般需要相当大的嘌呤或嘧啶序列段存在于双螺旋的一条上。核苷酸序列可以是基于嘧 啶的，这将导致跨过所得到的三股螺旋的3条缔合链的TAT和CGC三联体。富含嘧啶的分子 提供与双螺旋单条链的富含嘌呤区互补的碱基，其取向与所述链平行。另外，可以选择富含 嘌呤的核酸分子，例如含有一段G残基。这些分子将与富含GC对的DNA双螺旋形成三股螺 旋，其中大量的嘌呤残基定位于靶定的双螺旋的一条链上，导致GGC三联体跨过三螺旋的3 条链。或者，可通过产生所谓的“Z型转向(switchback) ”核酸分子来增加可以靶定用于 三股螺旋形成的可能序列。Z型转向分子以交替的5' -3'、3' -5'方式合成，使得与双 螺旋的第一条链进行碱基配对，然后与另一条链进行碱基配对，消除了一条双螺旋上存在 相当大的嘌呤或嘧啶序列段的必要性。有可能的是，本文所述的反义分子、核酶和/或三股螺旋分子可降低或抑制通过 正常和突变型PXR基因等位基因产生的mRNA的转录(三股螺旋)和/或翻译(反义分子、 核酶)。为了确保维持基本正常的PXR基因活性水平，可将编码和表达具有正常活性的PXR 基因多肽的核酸分子导入细胞，所述细胞不含对不论是所要利用的反义分子、核酶还是三 股螺旋治疗敏感的序列。或者，可优选将正常的PXR基因蛋白共同给予细胞或组织以维持 细胞或组织PXR基因活性所必需的水平。本公开内容的反义RNA和DNA、核酶和三股螺旋分子可通过本领域已知的用于合 成DNA和RNA分子的任何方法制备。这些包括本领域众所周知的用于化学合成寡脱氧核糖 核苷酸和寡核糖核苷酸的技术，例如固相亚磷酰胺化学合成法。或者，RNA分子可通过编码 反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录来形成。可将这类DNA序列整合到多种整合了 合适的RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6聚合酶启动子)的载体中。或者，可将经组成型 或诱导型(取决于所使用的启动子)合成的反义RNA的反义cDNA构建体稳定导入细胞系 中。可将各种熟知的修饰引入DNA分子中作为提高胞内稳定性和半寿期的手段。可能 的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的旁侧序列加到分子的5'端和/或 3'端，或者使用硫代磷酸酯或2' 0-甲基而不是寡脱氧核糖核苷酸主链内磷酸二酯酶键。对PXR基因蛋白、特别是突变型基因蛋白有特异性，并干扰其活性的抗体可用来 抑制突变型PXR基因功能。应用本领域的标准技术以及按照本文所述方法，可以针对蛋白 质本身或针对相当于所述蛋白质的部分的肽，来形成这类抗体。这类抗体包括但不限于多 克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、单链抗体、嵌合抗体等。在其中PXR基因蛋白是胞内的，并且使用完整抗体的情况下，使抗体内化将是确
26定的。然而，可以使用脂质转染试剂脂质体递送抗体或与PXR基因表位结合的Fab区的 片段进入细胞。当使用抗体片段时，结合靶标的最小抑制片段或延伸的靶蛋白的结合结构 域是确定的。例如，可以使用具有相当于与PXR基因蛋白结合的抗体可变区结构域的氨 基酸序列的肽。可以应用本领域众所周知的方法(参见例如Creighton，Structures and Molecular Principles (1984) W. H. Freeman, New York 1983，同上；以及 Sambrook等，1989， 同上)，用化学方法合成或用重组DNA技术产生这类肽。或者，还可以给予与胞内PXR基因 表位结合的单链中和抗体。可通过利用例如文献中披露的技术(例如Marasco等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，90 :7889_93 (1993))，通过例如在靶细胞群内表达编码单链抗体的核 苷酸序列，来给予这类单链抗体。可以浓度足以产生使疾病症状得到改善的PXR基因蛋白的水平，将编码PXR基因 蛋白的RNA序列直接给予患有疾病症状的受治疗者。可通过基因置换疗法对受治疗者进行 治疗。除将DNA导入细胞的其它颗粒(例如脂质体)以外，还可使用载体将一个或多个拷贝 的正常PXR基因或具有PXR基因功能指导产生正常PXR基因蛋白的基因部分插入细胞中， 载体包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒和反转录病毒载体。此外，可以应用有关技术(例如 上面所述技术)将正常PXR基因序列导入人细胞中。然后可将含有表达正常PXR基因的基因序列的细胞，优选自体细胞引入或再引入 供改善疾病症状的位置。反义RNA和DNA分子通过与靶定的mRNA杂交并阻止蛋白质翻译，起着直接阻断 mRNA翻译的作用。对于反义DNA这种从翻译起始位点衍生的寡脱氧核糖核苷酸(例如目标 PXR基因核苷酸序列-10和+10间的区域)是确定的。在一个实施方案中，BD抑制剂或激活物是反义分子，例如PXR激活物。本文所使 用的反义分子包括反义或有义寡核苷酸，所述寡核苷酸包含能够结合BD分子的靶mRNA (有 义)或靶DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)。本发明的反义或有义寡核苷酸， 包含一般为至少约14个核苷酸、优选约14-30个核苷酸的片段。基于编码指定蛋白质的 cDNA序列，驱动反义或有义寡核苷酸的能力可参见例如Stein和Cohen，Cancer Res. 48 2659，(1988)以及 van der Krol 等，BioTechniques 6 :958，(1988)。反义分子可以是修饰或未修饰的RNA、DNA或混合多聚体寡核苷酸。这些分子通 过与匹配序列特异性结合，通过空间阻断或通过激活RNA酶H酶导致肽合成受抑制而起作 用(Wu-Pong，1994年11月，BioPharm，20-33)。反义分子还可通过干扰RNA加工或由核转 运到胞质，来改变蛋白质合成(Mukhopadhyay 和 Roth，1996，Crit. Rev. inOncogenesis 7， 151-190)。另外，单链DNA与RNA的结合可导致核酸酶介导的异源双链体降解(Wu-Pong，同 上)。迄今显示用作RNA酶H的底物、主链被修饰的DNA化学结构为硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯、三氟硼酸酯(borontrifluoridates)及含有2'阿糖寡核苷酸和2'-氟代阿糖的寡 核苷酸。RNA干扰是指例如在动物中由短干扰RNA(SiRNA)介导的序列特异性转录后基因 沉默的过程(Fire等，Nature, 391,806(1998)).植物中相应的过程称为转录后基因沉默 或RNA沉默，在真菌中亦称压抑(quelling)。细胞中dsRNA的存在通过尚未充分表征的机 制引发RNAi反应。这种机制似乎不同于干扰素反应，所述反应是由dsRNA介导的蛋白激 酶PKR和导致由核糖核酸酶L对mRNA非特异性切割的2' ,5'-寡腺苷酸合成酶的活化弓丨起的(有关综述参见 Sharp，P. Α.，RNA interference—2001, Genes&Development 15 485-490(2001))ο本文提供包含分离核酸分子的表达系统，所述核酸分子包含能够与BD序列特异 性杂交的序列。在一个实施方案中，所述核酸分子能够抑制BD蛋白的表达。本发明提供通 过短RNA的载体定向表达抑制细胞内BD表达的一种方法，所述短RNA本身可折叠并产生具 有BD mRNA序列同一性的双链RNA，且能够在细胞内引发BD基因的转录后基因沉默即RNA 干扰(RNAi)。在另一种方法中，将具有BDmRNA序列同一性的短的双链RNA递送到细胞内以 引发BD基因的转录后基因沉默即RNAi。在各种实施方案中，核酸分子为至少7聚体，至少 10聚体，或至少20聚体。在又一个实施方案中，所述序列唯一的。药物组合物本文提供的药物组合物包括治疗有效量的本文所公开的小分子多肽、多核苷酸、 反义寡核苷酸或抗体作为活性剂。“有效量”是足以引起有益结果或所需结果(包括临床结 果)的量。可以一种或多种给药法给予有效量。对于本发明来说，腺病毒载体的有效量是 足以减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟疾病状况的进程的量。所述组合物可用来治疗BD。本文所使用的术语“治疗，，等一般是指获得所需要的 药学作用和/或生理作用。该作用从完全或部分预防疾病或其症状来看可以是预防性的和 /或从部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于该疾病的不良作用来看可以是治疗性的。 本文所使用的“治疗”包括哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，并包括(a)防止可能易 患疾病或症状但还未诊断患有该疾病或症状的受治疗者发生疾病或症状；(b)抑制疾病症 状，例如阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，例如引起疾病或症状消退。对本发明来说，“受治疗者”包括人和其它动物，特别是哺乳动物，以及生物体。因 此，所述方法适用于人类疗法和兽医应用。在某些实施方案中，受治疗者是哺乳动物，在大 多数确定的实施方案中，受治疗者是人。本文所使用的术语“治疗有效量”是指例如治疗、改善或预防需要治疗的疾病或病 症，或具有可检测的治疗或预防效果的治疗剂的量。可通过例如化学标记或抗原水平检测 效果。治疗效果还包括生理症状的减轻，例如体温降低。用于受治疗者的确切的有效量将 取决于受治疗者的尺寸和健康状况、病症的性质和程度、以及选用于给药的治疗药或治疗 药的组合。给定情况下的有效量由常规实验方法确定，并由临床医生予以判断。从本发明 来看，给予个体的本发明组合物的有效剂量一般为约0. 01mg/kg 约5mg/kg、或约0. Olmg/ kg 约 50mg/kg 或约 0. 05mg/kg 约 10mg/kg 或约 0. lm/kg 约 100mg/kgo药物组合物还可含有药物可接受的载体。术语“药物可接受的载体”是指例如用于 给予治疗剂(例如抗体或多肽、基因和其它治疗剂)的载体。该术语是指例如任何药用载 体本身不会诱导产生对接受组合物的个体是有害的抗体，并且可以给予而无过度毒性。合 适的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乙酸(polylaceticacid)、聚 乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。这类载体是本领域普通技术人员 熟知的。治疗组合物中药物可接受的载体可包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物 质，例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等，也可存在于这类溶媒中。治疗组合物通常被制成 作为液体溶液剂或混悬剂的注射剂；还可制成固体形式，适于在注射之前混于液体溶媒的 溶液剂或混悬剂。脂质体包括在药物可接受的载体的定义内。药物可接受的盐也可存在于药物组合物中，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐， 例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。有关药物可接受的赋形剂的全面论述可参见 Remington :The Science andPractice of Pharmacy (1995)Alfonso Gennaro，Lippincott， Williams, &Wilkins。可以各种形式制备药物组合物，例如颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、混悬剂、软 膏剂、洗剂等。可以采用适于口服和局部用途的药用级有机或无机载体和/或稀释剂配制 含有有治疗活性的化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物油及动物油 和脂肪。稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐或用于确保适当PH值的缓冲剂和 皮肤渗透促进剂可以用作助剂。本发明的药物组合物包含适于给予受治疗者的某一形式的BD蛋白。在某些实施 方案中，所述药物组合物是水溶性形式，例如作为药物可接受的盐存在，这就意味着同时包 括酸加成盐和碱加成盐。“药物可接受的酸加成盐”是指例如保持游离碱基的生物功效以及 不是生物学上不良或其它方面不良的与以下无机酸和有机酸形成的盐无机酸例如盐酸、 氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，有机酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、 琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水 杨酸等。“药物可接受的碱加成盐”包括由无机碱衍生的盐，例如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙 盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。特别确定的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。衍 生自药物可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代 胺)、环胺的盐和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺 的盐。本发明的治疗性多核苷酸和多肽可使用基因递送溶媒递送。基因递送溶媒可以 是病毒来源或非病毒来源(一般参见 Jolly，BD GeneTherapy (1994) 1 51 ；Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5 845 ；Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1 185 ；以及 Kaplitt， NatureGenetics (1994) 6 :148)。可以采用内源哺乳动物启动子或异源启动子诱导这类编码 序列的表达。编码序列的表达可以是组成型或调节型。本发明的BD蛋白和调节剂的给药可按上述各种方法进行，包括但不限于口服、皮 下、静脉内、鼻内、经皮、腹膜内、肌内、经肺、阴道、直肠或眼内。在一些情况下，例如在创伤 和炎症的治疗中，BD蛋白和调节剂可以直接用作溶液剂或喷雾剂。在一个实施方案中，提供调节细胞或生物体中的BD基因活性的方法。在一个实施 方案中，所述方法包括给予细胞降低或消除内源BD蛋白的生物活性的抗BD抗体。或者，所 述方法包括给予细胞或生物体编码BD蛋白的重组核酸。正如本领域技术人员应了解的一 样，这可以用多种方法来完成。在一个实施方案中，例如当BD序列在BD中下调时，通过增 加BD在细胞中的表达来增加BD基因产物的活性，例如采用已知的基因疗法技术，通过内源 BD基因过量表达或者通过给予BD序列的编码基因。在一个实施方案中，基因疗法技术包括 利用增强型同源重组(enhanced homologous recombination, EHR)掺入外源基因，例如参 见PCT/US93/03868 (特此通过引用其全部予以结合)。或者，例如当BD序列在BD中上调 时，例如通过给予BD反义核酸，降低内源BD基因的活性。可以提供所述检测方法作为试剂盒的组成部分。因此，本发明另外提供试剂盒，用 于在生物样品中，检测BD细胞中差异表达的多核苷酸(例如通过检测由差异表达的目标基因编码的mRNA)和/或由其编码的多肽的存在和/或水平。使用这些试剂盒的方法步 骤可通过临床实验室、实验室、开业医生或私营个体进行。用于检测由在BD细胞中差异表 达的多核苷酸编码的多肽的本发明试剂盒可包括特异性结合多肽的部分，其可以是结合多 肽或其片段的抗体。用于检测在BD细胞中差异表达的多核苷酸的本发明试剂盒可包括与 这类多核苷酸特异性杂交的部分。试剂盒可任选提供可用于所述方法步骤的其它组分，包 括但不限于缓冲剂、显影剂、标记、反应表面、检测方法、对照样品、标准品、说明书和说明资 料。因此，本发明提供用于检测前列腺BD的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种如以下NCBI 登录号所示序列的多核苷酸或其片段NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、 CS618137、CS618135、CS618133。可将经鉴定出的抑制靶突变型基因表达、合成和/或活性的化合物以治疗或改善 疾病的治疗有效剂量给予受治疗者。治疗有效剂量是指例如足以引起疾病症状得到改善的 化合物的量。可以通过标准药学规程，在细胞培养或实验动物中测定这类化合物的毒性和治疗 功效，例如，测定LD5Q(50%群体的致死剂量)和ED5tl(50%群体中治疗有效的剂量)。毒性 作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，它可以用比率LD5tZED5tl表示。治疗指数大的化 合物是确定的。虽然可以使用具有毒副作用的化合物，但是要注意应设计使这类化合物靶 向受累组织部位的递送系统，以使对未被感染细胞的损害最小化，从而降低副作用。可以利用从细胞培养实验和动物研究获得的数据配制一系列剂量用于人体。这类 化合物的剂量优选介于包括ED5tl在内的循环浓度范围内，几乎没有毒性或者没有毒性。剂 量可以在这个范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的给药途径。对于用于本公开 内容的方法中的任何化合物，最初可从细胞培养实验中估计治疗有效剂量。可在动物模型 中配制某一剂量以达到包括在细胞培养物中测定的IC5tl在内的循环血浆浓度范围(例如达 到症状最大抑制一半的试验化合物的浓度)。可以利用这类信息，更准确地确定人体中的有 益剂量。可通过例如高效液相层析法测定血浆中的水平。用于本公开内容的药物组合物可按常规方式使用一种或多种生理上可接受的载 体或赋形剂配制。因此，可以配制化合物及其生理上可接受的盐和溶剂化物用于通过以下 方式给药吸入或吹入(经口或经鼻)或口服、口腔、胃肠夕卜、局部、皮下、腹膜内、静脉内、胸 膜内、眼内、动脉内或直肠给药。还预期药物组合物可与增强所述化合物的活性的其它产品 一起给予，任选可包括其它治疗成分。对于口服给药，药物组合物可呈例如通过常规方法与以下药物可接受的赋形剂一 起制备的片剂或胶囊剂的形式例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟 丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、 滑石粉或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基 硫酸钠)。片剂可通过本领域众所周知的方法包衣。口服给药的液体制剂可呈例如溶液剂、 糖浆剂或混悬剂的形式，或者可以干制品提供，用前与水或其它合适的溶媒配制。这类液 体制剂可通过常规方法与以下药物可接受的添加剂一起制备例如悬浮剂(例如山梨醇糖 浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；无水溶媒(例如 杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙 酯或山梨酸)。适当时制剂还可含有缓冲盐、矫味剂、着色剂和甜味剂。可适当地配制口服
30给药的制剂以得到控释的活性化合物。对于口腔给药，组合物可呈以常规方式配制的片剂 或糖锭剂的形式。对于吸入给药，用于本公开内容的化合物可用合适的抛射剂从加压包装或雾化吸 入器发出喷雾剂的形式方便地递送，所述抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟 乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，可通过提供递送定量的阀，来 确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可制成装有化合物和合适粉 末基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。可以配制化合物用于通过注射(例如通过推注或连续输注)的胃肠外给药。用 于注射的剂型可呈单位剂型，例如装入具有添加防腐剂的安瓿或多次剂量容器中。组合 物可呈诸如油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂的这类形式，并且可含有调配剂 (formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可呈粉剂形式， 用前用合适的溶媒(例如无菌无热原水)配制。还可将化合物配制成例如含有常规栓剂基料(例如可可脂或其它甘油酯)的直肠 组合物，例如栓剂或滞留型灌肠剂。口服法可能是服用任何药物最简单的方法。这类给药 途径从受治疗者的观点来看一般简单易用并且常常是不便或不适最少的给药途径。然而， 这包括使药物材料通过胃，这对于包括蛋白质和其它生物活性组合物在内的许多物质来说 是不利的环境。由于胃的酸性、水解和蛋白水解环境进化成将蛋白质性质的物质有效地消 化成为氨基酸和寡肽用于后续的合成代谢，因此，如果只是口服用药时，不难预料，多种有 生物活性的蛋白质性质的物质在经过胃以后极少或没有可能存在并在小肠中被机体吸收。 结果是许多蛋白质性质的药物必需通过其它方法摄取，例如经胃肠外，常常通过皮下、肌内 或静脉内注射。为了稳定药物活性，药物组合物还可包括各种缓冲剂(例如Tris、乙酸盐、磷酸 盐)、稳定剂(例如吐温、聚山梨酯)、载体(例如人血清白蛋白)、防腐剂(硫柳汞、苯甲 醇)和抗氧化剂(例如抗坏血酸)。稳定剂可以是洗涤剂，例如吐温-20、吐温-80、NP-40 或曲通X-100。还可将EBP掺入聚合物的粉粒制剂中以在延长的一段时间内有控制地递送 给受治疗者。有关药物组合物中各组分的更多论述可参见Remington' sPharmaceutical Sciences,第 18 版，A. R. Gennaro,主编，MackPublishing, Easton, Pa. (1990)。除了前述剂型外，也可将化合物制成贮库制剂。这类长效剂型通过植入(例如皮 下或肌内)或通过肌内注射给予。因此，例如化合物可与合适的聚合材料或疏水材料(例 如作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或者作为微溶衍生物，例如作为 微溶盐。如有需要，可以在装有一个或多个含有活性成分的单位剂型的小包或分配器中提 供组合物。小包可包括例如金属或塑料箔，例如泡罩包装。小包或分配器可随附用药说明 书。孕烷X受体(PXR)用于本发明的细胞包括真核细胞和原核细胞，包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、 真菌细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物细胞和动物细胞。合适的动物细胞包括但不限于BDK 细胞、HeLa细胞、COS细胞、U20S细胞、CHO-KI细胞和各种哺乳动物原代细胞。用于本发明的细胞包括表达PXR、未知PXRdfW PXR的细胞及其组合。表达PXR的细胞在其细胞膜上含有PXR作为功能受体的细胞。细胞可以天然地表达PXR，可以经遗传 工程改造以在不同的表达水平上表达PXR，或者可经遗传工程改造以诱导型地表达PXR。正 如本领域技术人员容易理解的一样，可以通过遗传工程领域的分子生物学技术标准，对细 胞进行遗传工程改造以表达PXR。另外，用于本发明的细胞可以稳定或瞬时表达用于本文所述方法PXR。本发明 的方法可以采用使用以下专利中所描述的非哺乳动物病毒(例如杆状病毒)表达基因的 方法美国专利第 4，745，051,4, 879，236,5, 348，886,5, 731，182,5, 871，986,6, 281，009 和 6，238，914 号。美国专利第 4，745，051,4, 879，236,5, 348，886,5, 731，182,5, 871，986、 6，281，009和6，238，914号的全部内容特此通过引用其全部予以结合。与本发明的方法一 起使用的检测方法还可参见美国专利申请顺序号10/095，620、美国专利第5，891，646号和 美国专利第6，110，693号，其内容特此通过引用其全部予以结合。动物模型和转基因动物在另一个实施方案中，BD基因应用于产生BD的动物模型。正如本领域普通技术 人员所了解的一样，当所鉴定的BD基因在BD组织中受抑制或减少时，其中反义RNA针对BD 基因的基因疗法技术也将减少或抑制该基因的表达。由此产生的动物用作用于筛选候选生 物活性药物的BD动物模型。同样，基因敲除技术，例如由于与适当的基因寻靶载体进行同 源重组的结果，将导致缺乏BD蛋白。需要时，BD蛋白的组织特异性表达或敲除可能是必要 的。还有可能的是，在BD中BD蛋白过量表达。因此，可以产生过量表达BD蛋白的转 基因动物。根据所需要的表达水平，可以利用各种强度的启动子以表达转基因。同样，可以 测定经整合的转基因的拷贝数并进行比较，以确定转基因的表达水平。通过这类方法产生 的动物可用作BD的动物模型，此外还可用于筛选治疗BD的生物活性分子。寻靶构建体的产生本公开内容的寻靶构建体可采用本领域已知的标准方法产生(参见例如 Sambrook 1989, Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 二 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ；E. N. Glover (编著)，1985, DNA Cloning :A Practical Approach,第 I 禾口 II 卷；M. J. Gait (编著)，1984，Oligonucleotide Synthesis ；B.D. Hames 禾口 S. J. Higgins(编 著),1985, Nucleic Acid Hybridization ； B.D.Hames 禾口 S.J.Higgins(编 著),1984, Transcription and Translation ； R. I. Freshney (编著)，1986, Animal Cell Culture ；Immobilized Cells andEnzymes, IRL Press, 1986 ；B. Perbal, 1984, Practical Guide To Molecular 克隆；F. M. Ausubel 等，1994， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 禾口 Sons, Inc.)。例如，寻革巴构建 体可以按照常规方法制备，其中序列可以合成、从天然来源分离、操纵、克隆、连接、进行体 外诱变、引物修复等。在不同阶段，连接的序列可以进行克隆，并通过限制性分析、测序等进 行分析。可以应用本领域众所周知的技术构建寻靶DNA。例如，可通过寡核苷酸的化学合 成、双链DNA模板的切口平移、序列的聚合酶链式扩增(或连接酶链式反应扩增)、带有目标 序列(例如克隆cDNA或基因组DNA、合成DNA或上述组合的任一种)的原核载体或靶克隆 载体的纯化来合成寻靶DNA，所述载体例如质粒、噬菌粒、YAC、黏粒、噬菌体DNA、其它病毒DNA或复制中间体、或其纯化的限制片段、以及具有所需核苷酸序列的单链和双链多核苷酸 的其它来源。此外，可应用本领域已知的方法选择同源性的长度。例如，选择可以序列组成 和预定的内源靶DNA序列的复杂性为基础。在本公开内容的一个实施方案中，采用2004年11月9日授予专利权的美国专利 第6，815，185号(其公开内容通过引用其全部结合到本文)中所描述的方法，直接由质粒 基因组文库制备寻靶构建体，美国专利第6，815，185号以2001年6月19日申请的美国专 利申请顺序号09/885，816为基础，美国专利申请顺序号09/885，816是1998年11月17 日申请、现已放弃的美国专利申请顺序号09/193，834的继续申请，美国专利申请顺序号 09/193，834要求1998年5月11日申请的临时申请号60/084，949、临时申请号60/084，194 以及1997年11月17日申请的已转为临时申请号60/084，194的美国专利申请顺序号 08/971,310的权益。一般来讲，应用例如长片段PCR，在单一步骤中从质粒文库鉴定和分 离目标序列。分离出该序列之后，可容易地将可破坏靶序列的第二多核苷酸插入编码目标 序列的两个区域之间。按照这个方面，构建体以两个步骤产生(1)扩增(例如使用长片段 PCR)与靶序列同源的序列，和(2)将另一多核苷酸(例如选择标记)插入PCR产物中使得 它的两侧是同源序列。通常，载体是得自质粒基因组文库的质粒。完成的构建体也通常是 环状质粒。在另一个实施方案中，按照对2001年9月17日申请的美国专利申请顺序号 09/954，483，现为已公布的美国专利公布号20030032175 (其公开内容通过引用其全部结 合到本文中)所描述的阳性选择方法进行的调整，设计寻靶构建体。将寻靶构建体设计成 包括具有定位于PGK启动子上的两个lacO位点的PGK-neo融合基因，以及包含lac阻抑蛋 白的NLS-lacI基因，所述lac阻抑蛋白与编码得自SV40T抗原的NLS的序列融合。在另一 个实施方案中，寻靶构建体还含有一个以上的选择标记基因，包括阴性选择标记，例如单纯 疱疹病毒tk(HSV-tk)基因。阴性选择标记可与启动子和聚腺苷酸化信号有效连接。(参见 例如美国专利第5，464，764,5, 487，992,5, 627，059号；以及美国专利第5，631，153号)。一旦制成合适的寻靶构建体，则可应用本领域已知的任何方法，将寻靶构建体导 入合适的宿主细胞中。本公开内容可应用各种技术，包括例如前核显微注射、反转录病毒 介导的基因转移至种系、胚胎干细胞中的基因打靶、胚胎的电穿孔、精子介导的基因转移、 磷酸钙/DNA共沉淀、将DNA显微注射入核中、细菌原生质体与完整细胞融合、转染、聚阳离 子(例如多聚季铵盐、polyomithine)等(参见例如美国专利第4，873，191号；Van der Putten 等，1985，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA82 :6148_6152 ；Thompson 等，1989，Cell56 313-321 ；Lo,1983，MolCell. Biol. 3 :1803_1814 ；Lavitrano 等，1989，Cell,57 :717_723)。 本领域已知转化哺乳动物细胞的各种技术(参见例如Gordon，1989，Intl. Rev. Cytol.， 115 :171-229 ;Keown 等，1989，Methods in Enzymology ;Keown 等，1990，Methods and Enzymology,第 185 卷，第 527-537 页；Mansour 等，1988，Nature, 336 :348_352)。然后将选出的细胞注入动物(例如小鼠)的胚泡(或发育的其它阶段以 适于产生可生长发育的动物，例如桑葚胚)中以形成嵌合体(参见例如Bradley， A.Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells :APractical Approach,E. J. Robertson, 编著，IRL，0xfOrd，第113-152页(1987))。或者，可使选出的ES细胞与解离的小鼠胚胎细 胞聚集形成聚集嵌合体。然后将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性代孕动物内，使胚胎达到足孕。可使用在其生殖细胞中具有同源重组DNA的嵌合子代来繁殖动物，其中动物的所有细 胞都含有同源重组DNA。在一个实施方案中，使用嵌合子代小鼠产生PXR基因中具有杂合破 坏(heterozygous disruption)的小鼠。然后使杂合转基因小鼠交配。本领域众所周知的 是，通常这类交配的1/4后代在PXR基因中可具有纯合破坏。在一个实施方案中，将与PXR基因的破坏有关的表型(或表型改变)接入或存储 在数据库中。优选数据库包括(i)基因型数据(例如被破坏基因的鉴定)和(ii)与基因 型数据有关的表型数据(例如因基因破坏而产生的表型)。数据库优选为电子数据库。本公开内容另还提供条件性转基因动物或敲除动物，例如采用重组方法产生的转 基因动物或敲除动物。噬菌体Pl Cre重组酶和得自酵母质粒的flp重组酶是在特定靶位 点(ere重组酶的Iox P位点和flp重组酶的frt位点)切割DNA并催化该DNA与第二切割 位点连接的位点特异性DNA重组酶的两个非限制性实例。已经披露了多个合适的替代性位 点特异性重组酶，并且其基因可用于本公开内容的方法。这类重组酶包括噬菌体λ的Int 重组酶(含有或不含 Xis 时)(ffeisberg, R.等，Lambda II，(Hendrix, R.等编著)，Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, N. Y.，第 211-50 页(1983)，通过引用予以结 合)；TpnI 和 β-内酰胺酶转座子(Mercier 等，J Bacteriol. ,172 3745-57 (1990)) ；Τη3 解离酶(Flanagan 和 Fennewald J. Molec. Biol.，206 :295_304 (1989) ；Stark 等，Cell，58 779-90(1989))；酵母重组酶(Matsuzaki 等，J Bacteriol. , 172 610-18 (1990))；枯草芽孢 杆菌(B. subtilis) SpoIVC 重组酶(Sato 等，J Bacteriol. 172 1092-98 (1990)) ；Flp 重组 酶(Schwartz 和 Sadowski，JMolec. Biol.，205 :647_658 (1989) ；Parsons 等，J Biol. Chem.， 265:4527-33(1990) ；Golic 和 Lindquist, Cell, 59 499-509 (1989) ；Amin 等，J Molec. Biol. ,214 55-72(1990)) ；Hin 重组酶(Glasgow 等，J Biol. Chem.，264 10072-82 (1989))； 免疫球蛋白重组酶(Malynn等，Cell, 54 =453-460(1988))；以及Cin重组酶(Haffter和 Bickle, EMBO J，7 :3991_3996(1988) ；Hubner 等，J Molec. Biol.，205 :493_500(1989))， 所有文献都通过引用予以结合。Echols(J Biol. Chem. 265 14697-14700 (1990))； deVillartay(Nature, 335 170-74(1988)) ；Craig, (Ann. Rev. Genet. , 22 77-105(1988))； Poyart-Salmeron 等(EMBO J 8:2425-33(1989)) ；Hunger-Bertling 等(Mol Cell. Biochem.，92 107-16 (1990))以及 Cregg 和 Madden (Mol. Gen. Genet.，219 :320_23 (1989)) 论述了这类系统，所有文献都通过引用结合到本文中。Cre已被纯化成均质，且它与IoxP 位点的反应得到了广泛深入的表征(Abremski和Hess J Mol. Biol. 259 1509-14 (1984)， 通过引用结合到本文)。Cre蛋白的分子量为35，000，可购自New England Nuclear/ Du Pont公司。已经对ere基因(其编码Cre蛋白)进行了克隆和表达(Abremski等， Cell 32 :1301-11 (1983)，通过引用结合到本文)。Cre蛋白介导两个IoxP序列之间的 重组(Sternberg 等，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45 :297_309 (1981))，它可 存在于相同或不同的DNA分子上。因为IoxP位点的内部间隔序列是不对称的，所以两个 Ioxp 位点可具有彼此相对的方向性(Hoess 和 Abremski Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81 1026-29(1984))。因此，当位于相同DNA分子中的两个位点是正向重复取向时，Cre将切下 两个位点之间的DNA(Abremski等，Cell 32 :1301_11 (1983))。然而，如果两个位点彼此是 反向的，则在重组之后不会切掉它们之间的DNA，而只是简单地反转。因此，具有正向取向的 两个IoxP位点的环状DNA分子将重组产生两个较小的环，而具有两个反向取向的IoxP位点的环状分子只是将loxP位点两侧的DNA序列反转。另外，当靶标存在于不同DNA分子上 时，重组酶作用可导致靶位点的远端区发生相互交换。在一个实施方案中，通过直接显微注射将将经纯化的重组酶供给细胞。在另一个 实施方案中，重组酶是从共转染的构建体或载体中表达的，其中所述重组酶基因与功能启 动子有效连接。该实施方案另外的方面是组织特异性或诱导型重组酶构建体的用途，所述 构建体允许选择重组发生的时间及位置。本文所述的基于细胞的系统和基于动物的系统可用作疾病的模型。可以利用任何 物种的动物来产生疾病动物模型，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪、山羊和非 人类灵长类，例如狒狒、猴和黑猩猩。另外，可以使用人的细胞。这些系统可用于各种应用 中。可以利用这类实验作为所设计的鉴定药剂的筛选策略的组成部分，所述药剂例如能够 改善疾病症状的化合物。因此，可以采用基于动物的模型和基于细胞的模型鉴定在治疗疾 病中将是有效的药物、药品、疗法和干预。可以采用基于细胞的系统鉴定可对改善疾病症状 起作用的化合物。例如，可将这类细胞系统暴露在疑似具有能力改善疾病症状的化合物中， 所述化合物有足够的浓度并且在暴露的细胞中达到足以引起这种疾病症状改善的一段时 间。在暴露之后，对细胞进行分析以确定一种或多种疾病细胞表型是否改变而类似于更加 正常或更接近野生型的无疾病表型。另外，可以采用基于动物的疾病系统(例如本文所述的基于动物的疾病系统)鉴 定能够改善疾病症状的化合物。这类动物模型可用作试验基体(substrate)以鉴定在治疗 动物的疾病或其它表型特征中将是有用的药物、药品、疗法和干预法。例如，可将动物模型 暴露于疑似具有能力改善疾病症状的化合物或药剂中，所述化合物或药剂有足够的浓度并 且在暴露的动物中达到足以引起这类疾病症状的改善的一段时间。通过评价所述疾病相关 病症的逆转，可以监测动物对暴露的反应。暴露可以包括在本文所述的模型动物怀孕期间 治疗母体动物，由此将胚胎或胎儿暴露在可预防或改善疾病或表型的化合物或药剂中。也 可暴露新生、幼稚和成年动物。更具体地讲，本发明提供采用本公开内容的动物模型，特别是转基因小鼠，优选以 影响至少一个与PXR基因的破坏有关的表型的能力为基础，来鉴定包括化合物在内的药剂 的方法。在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定对PXR表达或功能具有作用的药剂的方 法。所述方法包括例如测量动物对药剂的生理反应，并将这类动物的生理反应与对照动物 的生理反应进行比较，其中与对照动物相比，所述动物的生理反应包括PXR的破坏则表明 药剂的特异性。“生理反应”是指可以测量的动物的任何生物学参数或生理学参数。分子实 验(例如基因转录、蛋白质产生和降解速率)、生理参数(例如运动生理学测验、各种呼吸 参数的测量、心率或血压的测量、出血时间的测量、aPTT.T或TT)以及细胞实验(例如细胞 表面标记的免疫组织化学测定，或者细胞聚集或增殖的能力)可以用来评价生理反应。本 公开内容的转基因动物和细胞可以用作与PXR破坏相关表型有关的疾病、病症或病况的模 型。本公开内容提供独特的动物模型，用于测定和开发新的与BD相关的疗法。BD表型 分析可供开发动物模型，所述动物模型可用于测定例如建议的BD药物疗法的功效。筛选方法本公开内容可用于筛选活性剂例如激动剂(例如结合并激活PXR多肽的活性剂)或拮抗剂(例如抑制PXR多肽的活性或PXR多肽与其配体相互作用)的方法中。因此，还 可以在例如细胞、不含细胞制备物、化学文库和本领域已知的天然产物混合物中，使用本公 开内容的多肽评价小分子底物与配体的结合。可以按照本公开内容应用常规用来鉴定和筛 选可以调节受体的调节剂的任何方法。在一个实施方案中，在与利福昔明比较时，在筛选方法中鉴定出的组合物可以至 少根据下列5个特征来进行分类溶解度、吸收、细菌穿透性、RNA聚合酶抑制和/或PXR特 异性。这些特征中的每一个可不同于利福昔明在一个或多个这些特征中的性质，还可以是 所述特征的任何组合。 溶解度例如，在筛选实验中鉴定出来的示例性分子的溶解度将会提高以促进递 送至结肠中。如果需要更多被吸收的分子，则溶解度提高和改进对全身吸收也将会是有益 的。·吸收最好可提高或改进系统抗细菌活性。例如，在筛选实验中鉴定出来的示例 性分子的吸收提高。 细菌穿透性最好可增加或改进细菌穿透性，这可导致抗细菌活性提高。如果需 要最优化抗炎分子来降低细菌穿透性，则这也将是有益的。-RNA Pol.抑制最好可提高或改进抗细菌性能，这可用在筛选中选出的化合物的 RNA聚合酶活性提高来衡量。如果需要最优化的抗炎分子降低聚合酶抑制活性，则这也将是 有益的。*PXR特异性最好可提高或改进特异性，如通过结合、活化和/或下游信号转导途 径反应所测定的一样。PXR特异性较高的化合物可能较低水平的剂量给予，或者可诱导较大 的PXR作用，或者改进抗炎性能。获益于本公开内容的本领域技术人员应了解，测定在筛选实验中鉴定出来的化合 物的5个特征与利福昔明相比较的实验。一旦通过筛选实验鉴定出少数示例性化合物时， 所述化合物也可彼此进行比较。本公开内容提供用于鉴定和筛选调节PXR表达或功能的治疗剂的方法。更具体 地讲，含有和表达PXR基因序列的细胞可用来筛选治疗剂。这类细胞可包括非重组单核细 胞细胞系，例如 U937(ATCC#CRL-1593)、THP-I (ATCC#TIB-202)和 P388D1 (ATCC#TIB-63)； DPX2 ；内皮细胞例如HUVEC内皮细胞和牛主动脉内皮细胞(BAEC)；以及通用哺乳动物细胞 系，例如HeLa细胞和COS细胞，例如C0S-7 (ATCC#CRL-1651)。此外，这类细胞可包括重组 的转基因细胞系。例如，本公开内容的转基因小鼠可用来产生细胞系，它含有涉及某一疾病 的一种或多种细胞类型可用作该疾病的细胞培养物模型。虽然可以利用衍生自本公开内容 的疾病转基因动物的细胞、组织和原代培养物，但是传代细胞系的产生也是确定的。对于可 以应用的由转基因动物获得传代细胞系的技术的实例可参见Small等，Mol. Cell Biol.，5 642-48(1985)。可将PXR基因序列导入目标细胞的基因组，并在其中过量表达。为了过量表达PXR 基因序列，可将PXR基因序列的编码部分与能够驱动基因在目标细胞类型中进行表达的调 节序列连接。这类调节区是本领域技术人员熟知的，并且可在不存在过多实验的情况下应 用。PXR基因序列也可被破坏或表达不足。例如，可以采用存在PXR基因破坏或PXR基因序 列表达不足的细胞来筛选药剂，所述药剂能够影响补偿由破坏或表达不足引起的任何功能丧失的替代途径。可以设计体外系统以鉴定能够结合PXR基因产物的化合物。这类化合物可包括但 不限于由D-构型氨基酸和/或L-构型氨基酸制成的肽(例如在随机肽文库的形成中(参 见例如Lam等，Nature, 354 :82_4 (1991))、磷酸肽(例如在随机或部分简并序列、定向磷酸 肽文库的形成中；参见例如Songyang等，Cell，72 :767_78 (1993))、抗体和有机小分子或无 机分子。例如，已鉴定出来的化合物可用于调节PXR基因蛋白、优选突变型PXR基因蛋白的 活性；精心设计PXR基因蛋白的生物功能；或筛选破坏正常PXR基因相互作用或自身破坏 这类相互作用的化合物。例如，用于鉴定结合PXR基因蛋白的化合物的实验包括在足以允许两种组分相互 作用和结合的时间和条件下，制备PXR基因蛋白和试验化合物的反应混合物，因此在反应 混合物形成可以提取和/或检测的复合物。这些实验以各种方法进行。例如，进行这类实 验的一种方法可包括将PXR基因蛋白或试验物质锚定在固相上，并检测在反应结束时锚定 在固相上的靶蛋白/试验物质复合物。在这类方法的一个实施方案中，PXR基因蛋白可锚 定在固体表面上，可对未被锚定的试验化合物进行直接或间接的标记。可方便的利用微量滴定板。可通过非共价或共价连接使锚定组分固定化。仅仅将 固体表面用蛋白质溶液包被并干燥，就可实现非共价连接。或者，可以采用对蛋白质具有特 异性的固定化抗体、优选单克隆抗体，将该蛋白质固定在固体表面上。可提前制备该表面并 保存。为了进行实验，将非固定化组分加到含有锚定组分的包被表面上。在反应完成后， 在使所形成的任何复合物保持固体化在表面上的条件下，除去未反应的组分(例如通过洗 涤)。可按多种方法完成锚定在固体表面上的复合物的检测。如果之前未固定化的组分是 预先标记的，则测出表面上固定化的标记便表明形成了复合物。如果之前未固定化的组分 没预先标记，则可以采用间接标记检查锚定在表面上的复合物；例如，使用对之前非固定化 组分有特异性的标记抗体(该抗体进而可用标记的抗Ig抗体直接标记或间接标记)。或者，可以在液相中进行反应，将反应产物与未反应的组分分离开来，并检测复合 物；例如，使用对PXR基因产物有特异性的固定化的抗体或锚定溶液中所形成的任何复合 物的试验化合物，以及对可能的复合物的另一组分有特异性的标记抗体，以检测锚定的复 合物。可对通过上述方法之一结合特定PXR基因产物的化合物诱导PXR基因蛋白的生化 反应的能力进行进一步的测定。可以利用本领域众所周知的测定法来鉴定表达产物的激动 剂、拮抗剂和/或抑制剂。可以利用多种方法诊断PXR基因相关疾病。具体地讲，可以采用例如用于检测PXR 基因突变的存在，或检测PXR基因mRNA过量表达或表达不足的试剂。下列实施例仅旨在说明本公开内容，不得以任何方式解释为是对主题公开内容的 限制。
实施例材料与方法化学试剂
37
利福平(Rifampicin，RIF)即3_(4_甲基哌嗪基亚氨基甲基)利福霉素SV ；利福昔 明(RIFax)即4-脱氧-4'-甲基吡啶并[1'，2' _1，2]咪唑并[5，4_c]利福霉素SV ；以 及咪达唑仑(MDZ)获自 Sigma-Aldrich (St. Louis,MO)。1'-羟基咪达唑仑(l' -0H-MDZ) 购自BD Gentest (ffoburn, ΜΑ) 0其它所有化学试剂都是市售的最高等级。动物和治疗将PXR-人源化(hPXR)小鼠、Pxr失效小鼠和野生型(WT)小鼠维持培养在标 准12小时光/12小时暗周期下，随意饮食。Pxr失效小鼠和hPXR小鼠如以前文献中所述 (Staudinger等，2001 ；Ma等，2007)。为了研究RIFax在PXR活化中的潜在作用，2-4月龄 雄性hPXR小鼠、Pxr失效小鼠和WT小鼠用25mg/kg/天的RIFax 口服治疗3天。RIF、特异 性人PXR配体用作阳性对照，以25mg/kg/天(口服)给药3天。玉米油用作RIF和RIFax 治疗两者的溶媒。在最后一剂之后24小时，用CO2使全部小鼠窒息致死。采集肝和小肠， 并在-80°C保存以备进一步分析。RIFax药代动力学及其在肠道中的分布对于药代动力学分析，WT小鼠、Pxr失效小鼠和hPXR小鼠经口管饲法用IOmg/ kg RIF或RIFax治疗。玉米油用作RIF和RIFax治疗两者的溶媒。在给药前、给药后 0. 25,0. 5,1. 5、3、6、9、12、24和48小时，使用肝素化管，从框下静脉采集血样。为了比 较RIFax和RIF的代谢分布曲线，经静脉内(i. v.)和腹膜内(i. p.)给予10mg/kgRIFax 和RIF。对于腹膜内注射，使用玉米油作为RIF和RIFax两者的溶媒，在给药前、给药后 0. 25、0. 5、1、2、4、8、24和48小时，从框下静脉采集血样。对于静脉内注射，使用30%聚乙 二醇(PEG，分子量400)作为RIF和RIFax两者的溶媒，在给药前、给药后0. 0833,0. 25、 0. 5、1、2、4、8、24和48小时，从框下静脉中采集血样。在8，OOOg下离心10分钟分离出血 清。取50 μ 1血清与150 μ 1甲醇混合，涡旋两次达20秒钟，在4°C下以14，OOOrpm离心 10分钟。然后将上部的有机层转移到自动进样器小瓶中，用于使用API2000SCIEX三重四 级杆质谱仪(Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City，CA)的 LC-MS/MS 对 RIF 或 RIFax进行了检测。通过采用WinNonlin(Pharsight，Mountain View,CA)的非区室分析法 (non-compartmentalapproach)，由血清浓度-时间数据估算RIF和RIFax的药代动力学参 数。从原始数据得出血清中的最大浓度(Cmax)。通过梯形法则计算得到血清浓度-时间曲 线下面积(AUCch4m、时)。为了检测在肠道中的分布，小鼠用lOmg/kgRIFax或RIF( 口服)治 疗。在给药后1.5、3、6、9、12、24和48小时，处死小鼠，在肠道的不同区段收集内容物。将 肠内容物称重，并在甲醇(100mg/ml)中勻浆。勻浆物在4°C下以14，OOOrpm离心10分钟。 然后将上部的有机层转移到自动进样器小瓶中，用于通过LC-MS/MS对RIF或RIFax进行检 测。通过LC-MS/MS对RIFax和RIF进行分析通过LC-MS/MS测定了 RIFax和RIF，采用高效液相层析系统进行，该系统由 PerkinElmer Series 200四元泵、真空脱气器和带有接入上述LC-MS/MS的100 μ 1环的 自动进样器构成。在 Luna C1850mm x4. 6mm(内径)柱(Phenomenex，Torrance, CA)中对 RIFax和RIF进行分离。在环境温度下，用含有0. 甲酸的85%甲醇和15% H2O过柱的 流速为0.25ml/分钟。以具有阳离子检测的涡轮离子喷雾模式操作质谱仪。涡轮离子喷雾 温度保持在300°C，向喷雾针施加4. SkV的电压。使用N2作为涡轮离子喷雾气体和雾化气体。采用多重反应监测(MRM)模式进行了检测和量化，对于RIFax的m/z为786. 3/754. 5， 对于 RIF 的 m/z 为 823. 5/791. 5。用RIFax预治疗的hPXR小鼠中MDZ的药代动力学分析hPXR小鼠用或不用10mg/kg RIFax预治疗，一天一次共3天。使用玉米油作为 RIFax治疗的溶媒。最后一剂RIFax后24小时，经口管饲法给予小鼠2. 5mg/kg MDZ。在给予 MDZ之前、之后5、10、20、30、60和90分钟，使用肝素化管，从框下静脉采集血样。在8，OOOg 下离心10分钟分离出血清。对于MDZ和1 ‘ -OH-MDZ提取，取50 μ 1血清与150 μ 1磷酸盐 缓冲盐水、200 μ 1乙酸乙酯和200 μ 1甲基叔丁基醚混合。混合物在4°C、3，OOOrpm离心下5 分钟。然后将有机层转移到新管内，用N2干燥，并用100 μ 1含有0. 甲酸的70%甲醇水 溶液和30 % H2O重配。按照前述方法(Ma等，2007)，通过LC-MS/MS对MDZ和1 ‘ -OH-MDZ 进行了检测。通过采用WinNonlin(Pharsight，Mountain View, CA)的非区室分析法，由血 浆浓度_时间数据估算MDZ和1' -OH-MDZ的药代动力学参数。通过梯形法则计算得到血 清浓度-时间曲线下面积(AUCch9c^w)。从原始数据得出血清中的最大浓度(Cmax)及其相应 时间(Tmax)。PXR靶基因的qPCR分析通过定量实时PCR(qPCR)对下列PXR靶基因进行了分析细胞色素 P4503A11(CYP3A11)、谷胱甘肽S-转移酶α 1 (GSTAl)、多种药物耐药性蛋白2 (MRP2)和 有机阴离子转运多肽 2(0ATP2) (Guo 等，2002 ；Kast 等，2002 ；Rosenfeld 等，2003)。使用 TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)，从不同的组织提取RNA0使用由1 μ g总RNA与 SuperScript II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)所产生的cDNA进行了 qPCR。应用引物表 达软件(Applied Biosystems)，设计了用于qPCR的引物；引物序列见表1。在ABI Prism 7900HT 序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City, CA)中，采用 SYBR green PCR master mix (SuperArray)进行了 PCR反应。所得数值采用比较CT法量化，将样品归一化至 β-肌动蛋白。表1.用于qPCR分析的引物序列。引物序列CYP3A11GSTAlMRP20ATP2
39
正向引物5'1 -AGCAGGGATGGACCTGG-3，(SEQ ID NO 1)反向引物5'1 -CGGTAGAGGAGCACCAA-3，(SEQ ID NO 2)正向引物5'1 -CAGCCTGGCAGCCAGAGA--3，(SEQ ID NO 3)反向引物5'1 -TCTGTGGCTCCATCAATGCA-3， (SEQ IDNO 4)正向引物5'1 -CGTGGCTGTTGAGCGAATAA-3， (SEQ IDNO 5)反向引物5'1 -TCTCACCTTTTTTGGGCCAAT-3， (SEQ IDNO 6)正向引物5'1 -TGCTGACTGCAACACAAAGTG T-3’ (SEQ IDNO 7)反向引物5'1 -AGCTGACATGTATGATAGACC ATT GTC-3'(SEQ ID NO8)
基于细胞的报道分子测定法具有稳定表达的重组人PXR的h印G2细胞系(DPX2)和克隆至萤光素酶载体的PXR 反应元件获自Puracyp Inc. (Carlsbad，CA)。以前有研究报告了细胞系的构建和验证(Yueh 等，2005)。根据批发商的说明书接种细胞。将RIFax(IyMUOyMUOOyM)加到培养基中， 使用ΙΟμΜ RIF作为阳性对照。通过测定24小时后萤火虫萤光素酶活性，然后通过蛋白质 浓度使萤光素酶活性归一化，来确定PXR的活化。对于核受体CAR、PPARa ,PPARy和FXR的 基于细胞的报道分子测定法，将HCTl 16细胞接种在24孔板(5X IO4细胞/孔，在含有10% FBS的DMEM之中培养)中，并使用Fugene转染试剂(Roche, Indianapolis, IN)，用各种表 达载体转染。以前的报告中描述了小鼠PPAR和CAR载体(Kliewer等，1992 ;SWales等， 2005)。小鼠FXR载体由DrChristopher J. Sinal博士提供。在转染后24小时之后，细胞 用溶媒(DMSO)和10 μ M RIFax孵育24小时。对于小鼠CAR、PPAR α、PPAR γ和FXR,分别 使用 TCP0B0P (250nM) ,ffy-14, 643 (10 μ Μ)、罗格列酮(10 μ Μ)禾PGW4064 (25 μ Μ)作为阳性对 照。采用标准双重萤光素酶测定法，并归一化至共转染的对照报道分子(Promeg^Madison， WI)。每项体外测定都重复进行3次。统计学分析所有数值都用平均值士 SD表示，并通过双尾斯氏t检验进行了分析。ρ < 0. 05视 为组间显著不同。PXR-人源化(hPXR)小鼠、Pxr失效小鼠和野生型小鼠用利福昔明和利福平、充分 表征的人PXR配体经口服治疗。当与利福平相比时，利福昔明高度集中在肠道内。利福昔 明治疗在hPXR小鼠肠中显著诱导PXR靶基因，但是在野生型小鼠和Pxr失效小鼠中并不如 此。然而，在野生型小鼠、Pxr失效小鼠和hPXR小鼠中，利福昔明治疗证实对肝PXR靶基因 没有显著作用。与体内数据一致，基于细胞的报道基因实验揭示了利福昔明介导的人PXR 的活化，但对于其它异生素核受体CAR、PPAR α、PPAR γ和FXR却并非如此。用利福昔明进 行预治疗不影响CYP3A底物咪达唑仑的药代动力学特征，但却增加1'-羟基咪达唑仑的 Cmax，并降低1' _羟基咪达唑仑的1~_。总的来说，本研究将利福昔明鉴定为肠特异性人PXR 配体。小鼠中RIFax的代谢特征和肠道分布应用LC-MS/MS研究了 RIF和RIFax的药代动力学特征。保留时间对于RIF为2. 21 分钟，m/z 为 823. 5/791. 5(图 IC 峰值 1)，对于 RIFax，为 3. 03 分钟，m/z 为 786. 3/754. 5 (图 IC峰值2)。检出限对于RIF为0.023pmol，对于RIFax为0.012pmol。在一次口服剂量的 RIF或RIFax之后，在治疗后的不同时间点采集小鼠血样和肠内容物长达48小时。在药代 动力学研究中，血清RIFax的Cmax为0.04 μ M，低于RIF (2.75 μ M) 70倍。血清RIFax的 AUCQ_48/W低于RIF 300倍(图2A)。然而，对于肠道分布，RIFax浓度显著高于RIF浓度。 在小肠中，在所测量的所有时间点上，RIF浓度都低于20μ g/g(图2B)。对于RIFax，在给 药后浓度为 160 μ g/g并持续9小时。在盲肠(图2C)和结肠(图2D)中，RIFax肠道分 布类似于小肠中的分布。在口服治疗之后，在野生型小鼠、Pxr失效小鼠和hPXR小鼠之间 未发现RIFax代谢的显著差异。在野生型小鼠、Pxr失效小鼠和hPXR小鼠中，RIFax ( 口服 治疗)的Cmax如图2E中所示。众所周知，RIFax是通过口服治疗无法吸收的利福霉素。通 过腹膜内注射，RIFax无法很好地吸收，且生物利用度显著低于RIF的生物利用度(图2F、图2G)。在静脉内治疗之后，观察到RIFax和RIF之间代谢分布曲线上的差异，当与RIF比 较时，RIFax呈超短T1/2和超低AUC (图2Η)。由RIFax所引起的PXR活化对野生型小鼠和hPXR小鼠的十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中的PXR进行了检 测，但未检测胃中的PXR (Ma等，2007)。由于RIFax在肠道中的高分布及在肠中PXR的表达， 因此通过qPCR研究了 RIFax对肠PXR靶基因的作用。在用RIFax治疗的hPXR小鼠小肠中， CYP3A11、GSTA1、MRP2和0ATP2全都上调(图3A)。与溶媒治疗的hPXR小鼠相比，肠CYP3A11 增加 4倍，虽然在野生型小鼠中表达受到抑制，在Pxr失效小鼠中未观察到显著变化(图 3B和图3C)。在RIFax治疗之后，肠GSTAlmRNA在所有3个小鼠品系中都上调，在野生型小 鼠、Pxr失效小鼠和hPXR小鼠中记录到增加87%、74%和172%这就表明了 Gstal基因可能 不是直接的PXR靶标，但却可能通过间接机制增加。虽无意受任何特定学术理论的束缚，但 是RIFax对GSTAl的作用的一种可能解释是RIFax的抗生素活性。RIFax以25mg/kg 口服 治疗3天，这可能改变肠细菌稳态，并间接影响GSTAl表达。在RIFax治疗之后，在hPXR小 鼠中注意到肠MRP2mRNA显著上调，但是在野生型小鼠中其表达显著受到抑制，在Pxr失效 小鼠中未观察到变化(图3B和图3C)。据报导，在人和大鼠肝细胞中分别被RIF和PCN激 活的MRP2(Kast等，2002)，在肝中不被RIF显著诱导，在肠中只被RIF或RIFax适度诱导。 其他研究者发现，MRP2不被小鼠PXR配体(例如PCN)显著诱导(Maher等，2005)。在hPXR 小鼠中MRP2不被RIF诱导的研究结果表明，在人和小鼠之间，在控制Mrp2基因的顺式元件 中存在可能的物种差异。在RIFax治疗之后，在hPXR小鼠中，肠0ATP2mRNA增加3. 4倍，但 是在野生型小鼠和Pxr失效小鼠两者中都未记录到这种mRNA的显著诱导(图3B和图3C)。 正如所预期的一样，RIF在肠中也诱导4种mRNA，但是诱导程度都小于用RIFax所观察到的 程度(图3D)。相比之下，在肝中RIF显著诱导CYP3A11、GSTAl和0ATP2，而在RIFax治疗 的hPXR小鼠肝中，仅GSTAlmRNA增加(图3E和3F)。这些数据表明RIFax是肠特异性人 PXR配体。在基于细胞的报道分子测定法中由RIFax所引起的人PXR活化在由RIFax所引起的hPXR活化的基于细胞的报道分子测定法中观察到萤光素酶 活性剂量依赖性的增加。在hPXR报道分子系统中，与1 μ M、10 μ M禾P 100 μ M RIFax 一起孵 育，相对于DMSO对照，分别产生2. 1倍、6. 7倍和25. 2倍的增加(图4Α)。在IOOnM下的 RIFax对hPXR没有显著作用，而在PPAR α、PPAR γ、CAR和FXR存在下，10 μ M RIFax在萤光 素酶活性方面没有产生显著变化(图4Β)。用RIFax预治疗的hPXR小鼠中MDZ的药代动力 学特征在单次口服给予MDZ (2. 5mg/kg)之后，测定了 hPXR小鼠中MDZ和1 ‘ -OH-MDZ的 血清浓度-时程。通过非区室分析对药代动力学参数进行了估算。在用或不用RIFax预 治疗的hPXR小鼠中，MDZ的Cmax、Tmax和AUCchxi分钟没有显著变化(ρ > 0. 05)。在hPXR小鼠 中，RIFax预治疗对1 ‘ -OH-MDZ这种MDZ的主要代谢物的AUCch9ci没有显著作用。然而， 在hPXR小鼠预治疗的RIFax中，1 ‘ -OH-MDZ的Cmax值比对照组高50% (ρ < 0. 05)，相应的 Tmax比对照组的显著较短(表2)。这些结果表明，在hPXR小鼠肠中RIFax-介导的CYP3A11 上调对MDZ的肝外首过代谢产生影响。表2.在用或不用RIFax，以10mg/kg/天预治疗3天的hPXR小鼠中MDZ的药代动力学特征。通过 LC-MS/MS 检测了血清 MDZ 和 1 ‘ -0H-MDZ。应用 WinNonlin(Pharsight， Mountain View, CA)通过非区室分析法，由血浆浓度_时间数据对MDZ和1 ‘ -OH-MDZ的 AUCchxi■进行了估算。从原始数据得出Cmax和1_。数据用平均值士SD表示，η = 3。与对 照相比*Ρ <0.05。表2对照RIFaxRIFax/对照MDZCmax (nmol/L) 477 士 40. 3 383 士 19. 10.8Tmax (分钟)10.0 士 0.012. 5 士 10. 61.3AUCch90分种(μ mo 1 分 中/L)8.0士0.48. 9士0.71.11' -OH-MDZCmax (nmol/L)562士4.9823士55. 2*1.5Tmax (分钟)25. 0 士 7. 17. 5 士 3. 5*0. 3AUC0_90分钟(μ mo 1 分 中/L)32. 4士3.036. 5士4. 21.1研究了 RIFax对PXR的作用。采用hPXR小鼠、Pxr失效小鼠和野生型小鼠，以及 基于细胞的人PXR报道基因实验，鉴定出RIFax为肠特异性人PXR配体。在RIFax的药物 开发期间，在人肝细胞模型中记录到由RIFax所引起的CYP3A4诱导。本文所报告的是一 个新发现，即RIFax是使包括CYP3A在内的PXR靶基因上调的肠特异性人PXR配体。在具 有稳定的重组人PXR表达的DPX2细胞系中，在1 μ M以上的RIFax浓度下，hPXR被显著激 活，因为萤光素酶活性相对于溶媒提高了 2. 1倍。在DPX2细胞系中，估计由RIFax引起的 hPXR活化的EC50约为20 μ M。在RIFax治疗之后，肠中的RIFax浓度比20 μ M高出很多。 在最新研究中，当小鼠用10mg/kg RIFax(单剂量，口服)治疗时，肠道中的RIFax浓度高达 150 μ g/g(约200 μ M)肠内容物。在人体中，在3天的RIFax治疗(每天800mg，口服)之 后，RIFax浓度约为8mg/g (约10，000μΜ)大便(Jiang等，2000)，这就表明RIFax暴露于 肠中的浓度极高。RIFax对肠PXR的作用(但对肝受体并非如此)，可能与吸收差有关。在 这项研究中，RIFax的代谢特征与之前的研究一致，因为肠道中RIFax的浓度非常高，而仅 有少量分布在血液中(Venturini，1983 ;Cellai等，1984)；这不依赖于肠中的PXR表达，说 明了缺乏吸收不是由PXR诱导的代谢所引起的。在人体中，在口服给药后，RIFax吸收也可 忽略。在一次口服剂量的RIFax (400mg)之后，血浆RIFax浓度低于检出限(2ng/ml)。在尿 中，检测出极少量的未改变的分子，为所给剂量的< 0. 01% (Descombe等，1994)。因此，本 研究表明，在临床应用中，RIFax起抗生素的作用，并且在肠内还起PXR激活物的作用。将RIFax鉴定为人PXR配体为了解RIFax在药理学和治疗学中的作用提供了新的 视野。PXR，这个配体激活的转录因子的核受体家族的成员，是参与异生素解毒的机体防御 机制所固有的组分(Kliewer等，2002)。PXR活化调节异生素氧化和缀合酶(xenobiotics oxidationand conjugation enzyme)，以及参与代谢并从机体中将潜在的有害化学物质清 除掉的转运蛋白的表达。以前的研究揭示了在人肝细胞模型中由RIFax引起的CYP3A4诱 导。使用MDZ和含有炔雌醇和诺孕酯的口服避孕药(Trapnell等，2007)的两项临床研究 证实，RIFax不会改变这些药物的药代动力学特征，因此表明RIFax对肠或肝CYP3A4没有 显著作用。然而，在本文中，在用RIFax治疗的hPXR小鼠中，肠CYP3A11显著上调。在用RIFax预治疗的hPXR小鼠中，对MDZ进行的药代动力学研究发现C_降低20%，这与其主 要代谢物1 ‘ "0HMDZ的C_提高一致，虽无意受任何特定学术理论的束缚，但是可用通过肠 CYP3A代谢的首过效应来解释。然而，用RIFax预治疗的hPXR小鼠中，没有平行的MDZ AUC 的降低。AUC不仅仅与首过消除有关，而且还与其它因素有关，例如吸收。在用RIFax预治 疗的hPXR小鼠中，包括转运蛋白在内的若干肠基因上调，例如流入转运蛋白0ATP2 (influx transporter 0ATP2)，这可能是MDZ吸收增加的原因之一。没有对MDZ的生物利用度进行研 究，因为在小鼠中它的生物利用度差，并且变化大(Granvil等，2003)。PXR活化的有益方面 是其通过上调参与消除异生素的酶和转运蛋白在解毒中的作用，包括P450s、GST、0ATP、MRP 等(Kliewer，2003 ；Saini等，2005 ；Wagner等，2005)。PXR靶基因是在肠屏障功能中针对 异生素和细菌的组分(Langmann等，2004)。在用RIFax治疗的hPXR小鼠小肠中，CYP3A11、 GSTA1、MRP2和0ATP2等若干PXR靶基因上调。RIFax有益于多发性慢性胃肠疾病的治 疗，例如肝性脑病、肠气和肠气相关症状、憩室病、囊炎(pouchitis)和BD(Scarpignato和 Pelosini,2005)。不完全了解促成RIFax在慢性胃肠疾病中的有益作用的机制。subject 在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的BD小鼠模型中，PCN介导的PXR活化显著预防DSS诱发的结 肠炎(Shah等，2007)，这就表明PXR配体作为BD治疗的潜在价值。进一步的人体研究建议 在慢性胃肠疾病的治疗学中，对RIFax介导的肠PXR活化的作用进行评价。虽然为了清楚理解起见，通过实例和实施例对前述发明进行了某种程度的详细描 述，按照本发明的教导对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不偏离所附权利要求书 的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改动和修改。缩略词RIF，利福平；RIFax，利福昔明；PXR，孕烷X受体；CAR，组成型雄烷受体； PPARa，过氧化物增殖物激活受体a ；PPAR Y，过氧化物增殖物激活受体、；FXR，法尼醇 X受体；WT，野生型小鼠；hPXR，PXR人源化小鼠；CYP3A，细胞色素P4503A ；GSTA,谷胱甘肽 S-转移酶a ；MRP，多种药物耐药性蛋白；0ATP，有机阴离子转运多肽；MDZ，咪达唑仑。参考文献Abdelrazeq AS, Kelly SM, Lund JN 禾口 Leveson SH (2005) Rifaximin-ciprofloxacin combination therapy is effective in chronic activerefractory pouchitis (利福昔明-环丙沙星联合疗法有效用于慢性活动性难治性 囊炎).Colorectal Dis 7:182-186。Bertilsson G, Heidrich J, Svensson K, Asman M, Jendeberg L, Sydow-Backman M, Ohlsson R, Postlind H, Blomquist P 禾口 BerkenstamA(1998)Identification of a human nuclear receptor defines a newsignaling pathway for CYP3A induction(人 核受体的鉴定对于CYP3A诱导确定了新的信号转导途径).Proc Natl Acad Sci U S A95 12208-12213。Carnahan VE 禾口 Redinbo MR(2005)Structure and function of thehuman nuclear xenobiotic receptor PXR (人核异生素受体 PXR 的结构和功能) Curr Drug Metab 6 :357_367。Cellai L, Colosimo M, Marchi E, Venturini AP 禾口 Zanolo G(1984) Rifaximin(L/105), a new topical intestinal antibiotic :pharmacokineticstudy after single oral administration of 3H-rifaximin to rats (新的局部肠抗生素禾福昔明(L/105)单次口服给予大鼠3H-利福昔明之后的药代动力学研究).Chemioterapia 3 :373-377。Descombe JJiDubourg D，Picard M禾口Palazzini E (1994)Pharmacokinetic study of rifaximin after oral administration in healthyvolunteers (□月艮给予健康志愿者 利福昔明之后的药代动力学研究).IntJ Clin Pharmacol Res 14:51-56。Di Stefano M，Strocchi A，Malservisi S，Veneto G，Ferrieri A 禾口 Corazza GR(2000)Non-absorbab1e antibiotics for managing intestinalgas production and gas-related symptoms (用于控制肠气产生和肠气相关症状的非吸收性抗生素).Aliment Pharmacol Ther 14:1001—1008。Doherty MM 禾口 Charman WN(2002)The mucosa of the smallintestine :how clinically relevant as an organ of drug metabolism(小肠粘膜作为药物代谢器官 的临床重大意义如何)？ Clin Pharmacokinet41 :235-253。Dring MM,Goulding CA,Trimble VI, Keegan D,Ryan AW,Brophy KM, Smyth CM， Keeling PW, Of Donoghue D，Of Sullivan M，Of Morain C，Mahmud N，Wikstrom AC， Kelleher D 禾口 McManus R(2006)The pregnane X receptor locus is associated with susceptibility toinf lammatory bowel disease (孕烷X受体基因座与炎性肠病易感性有 关)· Gastroenterology 130 341-348 ；quiz 592。Gionchetti P，Rizzello F，Lammers KM，Morselli C，Tambasco R 禾口 Campieri M(2006) Antimicrobials in the management of inf lammatorybowel disease (在炎性肠 病控制中的抗微生物药物).Digestion 73Suppll :77_85。Gionchetti P，Rizzello F，Venturi A，Ugolini F，Rossi M，BrigidiP，Johansson R， Ferrieri A， Poggioli G 禾口 Campieri M(1999)Antibioticcombination therapy in patients with chronic, treatment-resistant pouchitis (慢性难治性囊炎患者中的抗 生素联合疗法)· Aliment Pharmacol Therl3 :713_718。Granvil CP，Yu AM，Elizondo G，Akiyama TE, Cheung C，Feigenbaum L，Krausz KW禾口Gonzalez FJ(2003)Expression ofthehuman CYP3A4gene in the smallintestine of transgenic mice :in νitrometabo 1 ism and pharmacokinetics of midazolam(人CYP3A4 基因在转基因小鼠小肠中的表达咪达唑仑的体外代谢和药代动力学特征).DrugMetab Dispos 31 :548-558。Guo GL,Staudinger J,Ogura K禾口Klaassen CD(2002)Induction ofrat organic anion transporting polypeptide 2 bypregnenolone-16alpha-carbonitrile is via interaction with pregnane Xrec印tor (孕烯诺龙-16 α -甲腈通过与孕烧X受体相互作 用诱导的大鼠有机阴离子转运多肽2). Mol Pharmacol 61:832-839。Guslandi Μ,Petrone MC禾口Testoni PA(2006)Rifaximin for activeulcerative colitis (用于活动性溃疡性结肠炎的利福昔明).Infla_B0Wel Dis 12:335。Jiang ZD, Ke S, Palazzini Ε, Riopel L 禾口 Dupont H(2000)In vitroactivity and fecal concentration of rifaximin after oral administration(在□月艮给药后利 福昔明的体外活性和粪便浓度).Antimicrob AgentsChemother 44 :2205_2206。Kast HR, Goodwin B, Tarr PT, Jones SA, Anisfeld AM, Stoltz CM,Tontonoz P， Kliewer S， Willson TM 禾口 Edwards PA(2002)Regulation ofmultidrug resistance-associated protein 2 (ABCC2)by the nuclearreceptors pregnane X receptor， farnesoid X-activated receptor， andconstitutive androstane rec印tor (通过核受体孕烷X受体、法尼醇X激活的受体和组成型雄烷受体引起的多种药物 耐药性相关蛋白 2 (ABCC2)的调节).J Biol Chem 277 :2908_2915。Kliewer SA(2003)The nuclear pregnane X receptor regulatesxenobiotic detoxification (核孕烷 X 受体调节异生素解毒).J Nutrl33 :2444S_2447S。Kliewer SA,Goodwin B禾口Willson TM(2002)The nuclearpregnane X receptor a key regulator of xenobiotic metabolism(核孕烷X受体异生素代谢的关键调节因 子).Endocr Rev 23:687-702。Kliewer SA, Umesono K, Noonan DJ, Heyman RA 禾口 Evans RM(1992)Convergence of 9-cis retinoic acid and peroxisome proliferatorsignalling pathways through heterodimer formation of their rec印tors (9-顺式维甲酸和过氧化物酶增殖物信号转 导途径通过其受体形成异二聚体的会聚).Nature 358 :771_774。Langmann T, Moehle C, Mauerer R, Scharl M, Liebisch G, ZahnA, Stremmel ff 禾口 Schmitz G(2004)Loss of detoxification ininflammatory bowel disease dysregulation of pregnane X receptor targetgenes (炎j"生肠病中角军毒作用白勺丧失孕 烷 X 受体靶基因失调) Gastroenterology 127 :26_40。Latella G, Pimpo MT, Sottili S, Zippi M, Viscido A, ChiaramonteM 禾口 Frieri G(2003)Rifaximin improves symptoms of acquireduncomplicated diverticular disease of the colon(利福昔明改善获得性非复杂性结肠憩室病的症状).Int J Colorectal Dis 18 :55_62。Laustsen G 禾口 Wimmett L(2005) 2004 drug approval highlights :FDA update (2004 药物批准集锦FDA 修订) Nurse Pract 30 14-29 ；quiz29_31。Loguercio C, Federico A, De Girolamo V, Ferrieri A 禾口 Del VecchioBlanco C(2003)Cyclic treatment of chronic hepatic encephalopathy withrifaximin. Results of a double-blind clinical study (慢性肝性脑病使用利福昔明的循环治疗。 双盲临床研究结果).Minerva Gastroenterol Dietol49 :53_62。MaX, Shah Y, Cheung C, Guo GL, Feigenbaum L, Krausz Kff,Idle JR 禾口 Gonzalez FJ (2007)The PREgnane X receptor gene-humanizedmouse :a model for investigating drug-drug interactionsmediated bycytochromes P4503A(孕烧 X 受体基因-人源化 小鼠研究细胞色素P4503A介导的药物之间相互作用的模型).Drug Metab Dispos35 194-200。Maher JM, Cheng X，Slitt AL, Dieter MZ 禾口 Klaassen CD(2005)Induction of the multidrug resistance-associated protein family oftransporters by chemical activators of receptor-mediated pathways inmouse liver(小鼠月干中受体介导的途径 的化学激活物诱导多种药物耐药性相关蛋白家族的转运蛋白).Drug Metab Dispos 33: 956-962。Mas A, Rodes J, Sunyer L, Rodrigo L, Planas R, Vargas V, CastellsL,
45Rodriguez-Martinez D， Fernandez-Rodriguez C， Coll I 禾口 Pardo A(2003)Comparison of rifaximin and lactitolin the treatment of acutehepatic encephalopathy results of a randomized,double-blind,double-dummy,controlled clinical trial(在 急性肝性脑病的治疗中利福昔明与乳糖醇的比较随机、双盲、双模拟、对照临床试验的结 果) JH印atol 38 :51-58。Miki Y, Suzuki T, Tazawa C, Blumberg B 禾口 Sasano H (2005) Steroid and xenobiotic receptor(SXR), cytochrome P4503A4andmu11idrug resistance gene 1 in human adult and fetal tissues (成人和人胚胎组织中的类固醇和异生素受体(SXR)、细 胞色素P4503A4和多种药物耐药性基因l).Mol Cell Endocrinol 231:75-85。Papi C, Koch M 禾口 Capurso L(2005)Management of diverticulardisease is there room for rifaximin ？(憩室病管理利福昔明有机会吗？)Chemotherapy 51Suppl 1 :110-114。Pistoia MA, Lombardi L, Rossi M, Vittorini C, Cavaliere GF 禾口 Pistoia F(2004)Does rifaximin prevent complications of diverticulardisease ？ A retrospective study (利福昔明预防憩室病并发症吗？回顾性研究).Eur Rev Med Pharmacol Sci 8 :283-287。Rosenfeld JM, Vargas R, Jr. ， Xie ff 禾口 Evans RM(2003)Geneticprofiling defines the xenobiotic gene networkcontrolled by the nuclearreceptor pregnane X rec印tor(遗传谱测定限定受控于核受体孕烷X受体的异生素基因网).Mol Endocrinol 17 :1268-1282。Saini SP, Mu Y, Gong H, Toma D, Uppal H, Ren S, Li S, PoloyacSM 禾口 Xie ff(2005)Dual role of orphan nuclear receptor pregnane Xreceptor in bilirubin detoxification in mice (小鼠中孤儿核受体孕烷X受体在胆红素解毒中的双重作 用).Hepatology 41 :497_505。Scarpignato C禾口Pelosini I (2005)Rifaximin,a poorly absorbedantibiotic pharmacology and clinical potential (不易吸收的抗生素利福昔明药理和临床潜 力) Chemotherapy 51Suppl 1:36-66。Shafran I 禾口Johnson LK (2005)An open-label evaluation ofrifaximin in the treatment of active Crohn' s disease (对利福昔明在治疗活动性克罗恩病中的非盲评 价).Curr Med Res Op in 21 :1165_1169。Shah YM, Ma X，Morimura K, Kim I 禾口 Gonzalez FJ (2007) Pregnane X receptor activation ameliorates DSS-induced inflammatorybowel disease via inhibition of NF- {kappa} B target gene expression (孕烷X受体活化通过抑制NF_{> }B靶基因表达改 善 DSS 诱发的炎性肠病).Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 292 :G1114_1122。Sonoda J,Chong Lff,Downes M,Barish GD,Coulter S,LiddleC,Lee CH 禾口 Evans RM(2005)Pregnane X receptor prevents hepatorenaltoxicity from cholesterol metabolites (孕烷X受体预防来自胆固醇代谢物的肝肾毒性).Proc Natl Acad Sci U S A 102 :2198-2203oStaudinger JL, Goodwin B, Jones SA, Hawkins-Brown D, MacKenzie KI, LaTourA，Liu Y,Klaassen CD,Brown KK,ReinhardJ,Willson TM,Roller BH和Kliewer SA(2001) The nuclear receptorPXR is a lithocholic acid sensor that protects against liver toxicity (核受体PXR是防止肝毒性的石胆酸感受器).Proc Natl Acad Sci U S A98 :3369-3374。Swales K, Kakizaki S, Yamamoto Y, Inoue K, Kobayashi K 禾口 Negishi M(2005) Novel CAR-mediated mechanism for synergisticactivation of two distinct elements within the human cytochrome P4502B6gene in HepG2cells (HepG2 MMrP AMM^ 素P4502B6基因内两个不同元件协同活化的新的CAR-介导的机制).J Biol Chem280 3458-3466。Trapnell CB, Connolly Μ, Pentikis H, Forbes WP 禾口 BettenhausenDK(2007) Absence of effect of oral rifaximin on the pharmacokinetics ofethinyl estradiol/norgestimate in healthy females (健康女性中口服利福昔明对炔雌醇/诺孕 酯的药代动力学特征没有影响).Ann Pharmacother41 :222_228。Venturini AP(1983)Pharmacokinetics of L/105,a new rifamycin,inrats and dogs,after oral administration(在大鼠和狗中口服给予一种新的利福霉素L/105后的 药代动力学特征)· Chemotherapy 29 :1_3。Wagner M, Halilbasic E, Marschall HU, Zollner G, Fickert P, Langner C, Zatloukal K,Denk H禾口Trauner M(2005)CAR and PXRagonists stimulate hepatic bile acid and bilirubin detoxification andelimination pathways in mice (小鼠中 CAR禾口 PXR激动剂刺激肝脏胆汁酸和胆红素解毒和清除途径).Hepatology 42 :420_430。Yueh MF, Kawahara M 禾口 Raucy J(2005)High volume bioassays toassess CYP3A4_mediated drug interactions !induction and inhibition in asingle cell line(评价CYP3A4-介导的药物相互作用的高容量生物测定法在单一细胞系中的诱导和 抑制)· Drug Metab Dispos 33:38—48。
权利要求
一种筛选调节孕烷X受体(PXR)蛋白或其片段的化合物或其盐的方法，所述方法包括使PXR受体与一种或多种候选化合物接触，并选出调节PXR受体的化合物或其盐。
2.权利要求1的方法，其中所述候选化合物包含利福霉素类似物。
3.权利要求1的方法，其中调节包括调节由PXR蛋白或其片段与利福霉素类似物的结 合所诱导的信号转导。
4.权利要求1的方法，其中所述PXR受体与膜缔合、在转基因小鼠中、在测定板中、在细 胞中和/或在人工膜中。
5.权利要求1的方法，其中所述PXR蛋白包含由序列登录号075469、Q8SQ01、Q9R1A7、 054915、NP_148934、NP_003880或NP_071285所表示的氨基酸序列或其片段或变体或者由 序列登录号 NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133 所表示的核酸或其片段或变体。
6.权利要求1的方法，其中CYP3A11、GSTAl、MRP2和0ATP2全都上调。
7.权利要求1的方法，所述方法另外包括用利福昔明预治疗。
8.权利要求1的方法，所述方法另外包括用PXR受体蛋白与候选化合物预治疗。
9.权利要求8的方法，其中用候选化合物预治疗不会影响CYP3A底物咪达唑仑的药代 动力学。
10.权利要求8的方法，其中用候选化合物预治疗提高1'-羟基咪达唑仑的Cmax并降 低1'-羟基咪达唑仑的1~_。
11.权利要求1的方法，其中在用候选化合物治疗后与对照相比，CYP3A11增加约1 约4倍。
12.权利要求1的方法，在候选化合物治疗后，GSTAlmRNA上调。
13.权利要求12的方法，其中上调范围介于约65% 约200%之间。
14.权利要求1的方法，其中在候选化合物治疗之后肠MRP2mRNA上调。
15.一种用于筛选调节PXR受体或其片段的化合物或其盐的试剂盒，所述试剂盒包括 PXR受体蛋白或其活性片段和利福霉素类似物。
16.一种用于治疗PXR相关疾病的药物，所述药物包含调节孕烷X受体(PXR)蛋白或其 片段的化合物或其盐，或者调节由PXR蛋白或其片段与利福霉素类似物的结合所诱导的信 号转导的化合物或其盐。
17.一种治疗、预防或减轻受治疗者的PXR相关疾病的方法，所述方法包括给予调节孕 烷X受体(PXR)蛋白或其片段的化合物或其盐。
18.权利要求17的方法，其中调节包括调节由PXR蛋白或其片段与利福霉素类似物的 结合所诱导的信号转导。
19.权利要求17的方法，其中所述PXR受体与膜缔合、在转基因小鼠中、在测定板中、在 细胞中和/或在人工膜中。
20.权利要求17的方法，其中所述PXR蛋白包含由序列登录号075469、Q8SQ01、 Q9R1A7、054915、NP_148934、NP_003880或NP 071285所表示的氨基酸序列或其片段或变 体或者由序列登录号 NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、 CS618133所表示的核酸或其片段或变体。
21.一种组合物，所述组合物包含产生治疗效果的有效量的PXR蛋白激动剂。
22.—种转基因小鼠，所述转基因小鼠包含纯合破坏的内源孕烷X受体(PXR)基因。
23.权利要求22的转基因小鼠，其中所述小鼠包含人PXR基因。
24.一种细胞或组织，所述细胞或组织分离自权利要求22的转基因小鼠。
25.一种鉴定能够调节PXR基因活性或PXR基因表达产物活性的调节剂的方法，所述方 法包括给予权利要求23的转基因小鼠推定的调节剂；给予野生型对照小鼠所述调节剂；和将转基因小鼠的生理反应与对照小鼠的生理反应进行比较；其中在转基因小鼠与对照 小鼠之间生理反应上的差异表示所述调节剂能够调节基因或基因表达产物的活性。
26.—种筛选具有肠疾病活性的候选药物的方法，所述方法包括提供表达PXR基因或其片段或变体的细胞，所述PXR基因由选自以下序列的核酸序列 编码NM_033013、NM_009803、NM_022002、NM_003889、CS618137、CS618135、CS618133 或 075469、Q8SQ01、Q9R1A7、054915、NP_148934、NP_003880、NP_071285 ；使所述细胞与候选药物接触；和监测组织样品中候选药物对BD多核苷酸表达的作用。
27.—种与PXR多肽结合的分离抗体或其抗原结合片段。
28.权利要求27的分离抗体，其中将所述抗体或其片段与固相支持体连接；其中所述 抗体是单克隆抗体；其中所述抗体是多克隆抗体；和/或其中所述抗体或其片段另包含可 检测标记。全文摘要
本发明涉及用于检测、诊断和治疗肠疾病(BD)的新的序列。本发明提供其表达与BD有关的BD相关多核苷酸序列。本文提供用于检测BD的诊断组合物和方法。本发明提供对BD多肽有特异性的单克隆和多克隆抗体。本发明还提供用于筛选、预防和治疗BD的诊断工具和治疗组合物及方法。
文档编号G01N33/53GK101896815SQ200880121074
公开日2010年11月24日 申请日期2008年10月16日 优先权日2007年10月17日
发明者F·J·冈萨雷斯, L·约翰逊, X·马 申请人:萨利克斯药品有限公司;美国政府卫生与公众服务部