专利名称：电化学检测金属标记的分析物的制作方法
电化学检测金属标记的分析物本发明涉及电化学测定，具体地所述测定利用金属纳米粒子作为电化学标记物。涉及金属标记物的现有技术测定，诸如WO 2005/121792中所述的那些，需要化学 氧化剂来溶解金属纳米粒子。关于这一点的问题是该氧化剂可以通过破坏扫描的基线而干 扰扫描的电化学曲线。WO 2005/121792中所述的测定依赖于金属离子的形成，从而使该金 属通过电解被转移到电极表面。这在分析生物样品时引起问题。生物样品溶液中的蛋白质 和其他分子典型地与金属离子结合，从而使它们电化学失活。金属离子还可以通过与化学 氧化物的螯合/偶联而引起电化学失活。 WO 2004/016160公开了化学氧化还原裂解剂(cleavant)从纳米粒子标记的分析 物中释放有机聚合物纳米粒子的应用。然后使用电化学流式细胞计数来检测由氧化还原裂 解剂从聚合物纳米粒子释放的氧化还原产物(诸如金属离子)。本发明试图克服一种或多种以上问题。根据本发明的第一方面，提供用于确定金属标记的分析物在样品中的存在或量 的方法，所述方法包括以下步骤将释放剂(release agent)加入到金属标记的分析物 中以从所述分析物中释放金属标记物，所述释放剂和所述金属标记物一起形成带电物质 (charged species)，施加电势(potential)从而将所述带电物质送至电极，向所述带电物 质施加正电势以形成金属离子，和执行量化测定步骤以确定金属标记的分析物的存在或 量。金属离子在电极表面处形成。因此金属离子仅有很小的机会在测量前被灭活。因 此不需要在金属离子和螯合剂之间形成复合物。而且，由于使用电化学势来溶解金属标记 物，所以不需要使用化学氧化剂和避免与化学氧化剂有关的问题。带电物质典型是不可溶的。典型地，释放剂包括带电成分，释放剂的带电成分和金属纳米粒子一起形成带电 物质。通过应用正电势，带电物质可以被送至电极，这也导致金属离子的形成。带电物质优选带负电，但是在一些实施方案中其可以带正电。释放剂可以是能够在金属标记物表面上形成带电层并因此能够使其在一定电势 下迁移的任何盐或化学物质。释放剂可以包括具有带电单元的硫醇。硫醇起作用来使金属标记物和分析物之间 的结合变性或将其破坏。该带电单元为金属标记物提供电荷。合适的释放剂的实例包括硫氰酸铵和硫氰酸钾。代替硫氰酸盐，释放剂可以包括 硫代硫酸盐或带电的硫醇链。释放剂可以提供离子以形成带电物质。例如，合适的释放剂包 括NaCl或HC1，它们能够提供氯离子以形成带电物质。NaCl和HCl特别有效用作释放剂， 因为它们在氧化后不与金属离子形成复合物。释放剂优选浓度为约IM以上。该范围是优选的，因为低于该摩尔浓度，银灵敏度 不佳。所述方法还可以包括使用金属标记物标记分析物，其中所述分析物与能够与所述分析物结合的结合部分温育，并被所述金属标记物标记。分析物可以用另一种结合部分来 温育，所述结合部分能够与所述分析物结合并固定于固体支持物。所述固体支持物可以是 可动的或固定的，固体支持物可以是磁化的，固体支持物可以是比金属纳米粒子更大或更 小的粒子，从而容许从结合的金属纳米粒子中滤出未结合的金属纳米粒子，固体支持物可 以是带电的粒子，以容许电分离，固体支持物可以是多孔结构，固体支持物可以是2维或3 维表面或结构。在优选的实施方案中，金属标记物是银或金，例如银纳米粒子或金纳米粒子。优选 地，金属标记物是微粒或纳米粒子标记物诸如银纳米粒子。分析物可以间接标记的，其中标记物附着于一种物质或结合部分，该物质或结合 部分再结合分析物。所述量化测定步骤可以是伏安法，诸如阳极溶出伏安法(ASV)。现将仅通过举例和参考附图的方式描述优选的实施方案，其中
图1示意性图示本发明的一个实施方案；图2和3显示标准溶液AgN03+lM NH4SCN(l_50ppm Ag+)的阳极溶出伏安法(ASV) 扫描结果；图4禾Π 5显示标准溶液AgN03+lM NH4SCN(0. 01-0. 8ppm Ag+)的阳极溶出伏安法 (ASV)扫描结果；图6和7显示在存在氧化剂铁氰化物的条件下的Ag+浓度；图8-11显示在存在/缺乏铁氰化物的条件下的Ag+浓度；图12和13显示在存在或不存在NH4SCN的条件下的银纳米粒子的吸光度；图14a_f显示80%和100%银纳米粒子溶液对尺寸分布的影响；图15和16比较关于KSCN和NH4SCN的结果；图17和18比较预处理时间对方法的实施方案的影响；图19显示关于肌红蛋白的测定的结果，以确定最大化该测定灵敏度所需要的抗
体量；图20-23显示关于方法的其他实施方案的结果；和图24和25图示其中所测物质不带电的阴性结果。所述测定确定目的分析物(诸如抗体、模拟表位或核酸链)的存在或量，且图1中 示意性示范一个实施方案。在优选的实施方案中，能够结合目的分析物12的第一结合部分 10附着于固相14(表面或磁性粒子)。能够结合分析物12上不同区域的第二结合部分用 金属标记物18、典型地微粒标记物来标记。将包含分析物12的样品溶液加至固体支持物14。分析物12与第一结合部分10 结合。支持物14然后与包含标记的第二结合部分16的溶液温育，所述标记的第二结合部 分16结合分析物12。有效地，在基底和银粒子18之间出现“夹心结构”，由此捕获粒子18。 然后除去未结合的粒子(诸如提供清洗)。这确保所述粒子不被氧化。在优选的实施方案中，银纳米粒子18用作电化学标记物。银纳米粒子18提供电 化学信号的分子放大，因为每个40nm银纳米粒子包含约IO6银离子。因此，测定的灵敏性提 高。另外，银是优选的，因为它形成可以作为生物纳米标记物18使用的稳定纳米粒子。此 夕卜，银纳米粒子18易于电氧化形成银离子。一些其他金属纳米粒子需要苛刻的化学氧化剂来形成金属离子。在优选的实施方案中，将硫氰酸铵20引入100并从其生物复合物中去除银纳米粒 子18并形成在银纳米粒子周围化学结合的层(可以是单层)，从而生成带负电的纳米粒子 22。带电纳米粒子22可以在电势下迁移200到正电极表面。在该电极处的银纳米粒子然后 在正电势300下溶解形成银离子26。银离子26然后通过累积溶出伏安法(accumulation stripping voltammetry)测量。一小部分银离子26可以采用与螯合剂复合物的形式，其中 释放剂能够螯合银离子。可以使用其他释放剂20(诸 如具有带电单元的硫醇，例如硫代硫酸盐)。还可以使 用非硫醇盐分子，诸如NaCl和HCl。比较例1该比较例解释在形成WO 2005/121792中公开的方法中测量的电活性复合物背后 的化学。1.测量银离子(Agi)复合物银离子在存在NH4SCN的条件下形成强电活性复合物Ag+ +m(NH:) + n(SCN.) —[Ag(NH:)m(SCN-)n]m-n+1那些复合物可以利用ASV电化学测量。在该过程中，处于负电势的银复合物首先 沉积在碳糊电极表面上[Ag(NH )m(SCN )n]m"n+1 + e_ — [Ag(NHt )m(SCN" )n]m"n然后将电势改变为正值，银复合物从电极溶出，产生电流峰值。m n ->[Ag(NH4+)m(SCN )n]m n+1 +e'硫氰酸铵还形成与其他金属离子的复合物，且硫氰酸铵将这些金属离子的电化学 定位而远离银离子复合物的电化学，由此消除了光谱干扰。制备AgNO3 标准溶液(1. 25，6· 25，12. 5，25，37· 5，50 和 62. 5ppmAgN03)。向每个 160 μ 1标准溶液中，加入40 μ 15Μ NH4SCN0随后，将50 μ 1每种AgNO3和NH4SCN溶液随之 应用在电极上并进行ASV。ASV参数如下a) +0. 4V, IOs (预处理)b)线性扫描+0. 4V — -1. 6V，扫描速度=lV/s和跨步电势=0. 005Vc)-l. 6V,5sd)-1.2V，55se)线性扫描-1. 2V — +0. IV，扫描速度=lV/s和跨步电势=0. OlV2)在每次测量之间，电极用5M NH4SCN清洗，运行ASV并然后用薄纸擦拭。表 1Ag+ 『ppm] 15 10 20 30 40 50
14.40E-072.48E-065.34E-061.03E-051.39E-051.68E-05 2.34E-05 24.23E-072.48E-064.86E-069.73E-061.62E-051.69E-052.10E-05
_33.91 E-072.51 E-064.73E-061.07E-051.45E-051.77E-051.96E-05
平均值 4.18E-072.49E-064.97E-061.02E-051.49E-051.71E-05 2.13E-05 标准偏差2.48E-081.94E-083.19E-07 4.8E-071.21E-064.61E-071.91E-06 CV% 5.93 0.78 6.42 4.69 8.17 2.69 8.96结果显示在图2和3中。峰下面积与l-50ppm范围内的Ag+浓度成比例。比较例2利用较低Ag+浓度进行相同的实验。表 2
\· ___________ _
Ag+ 0.01 0.025 0.05__OJ__0.250.50.8
1无峰 无峰 无峰 1.2E-086.4E-081.6E-072.7E-07
2无峰 无峰 无峰 1.7E-086.4E-081.5E-072.5E-07
_3 无峰 无峰 无峰 5.1E-095.4E-081.5E-072.4E-07
平均
值 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 1.1E-086.1E-081.5E-072.5E-07 标准
偏差 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 5.7E-095.9E-097.0E-091.2E-08
CV% #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 51.62 9.76 4.59 4.83
--------1\结果显示在图4和5中。比较例3现有技术测定，诸如WO 2005/121792中所述的测定，使用氧化剂(铁氰酸盐)来 形成银离子，从而用于实施例1和2中所述的方法中。以下测量在存在0.05M K3Fe(CN)6* 0. OlM K4Fe(CN)6的条件下进行。表权利要求
用于确定样品中金属标记的分析物(12)的存在或量的方法，所述方法包括以下步骤将释放剂(20)添加至所述金属标记的分析物，从而将金属标记物(18)从所述分析物中释放，所述释放剂和所述金属标记物一起形成带电物质(22)，施加电势从而将所述带电物质送至电极(24)，向所述带电物质施加正电势以形成金属离子(26)，和执行量化测定步骤以确定所述金属标记的分析物的存在或量。
2.如权利要求1中所述的方法，其中所述带电物质(22)是不可溶的。
3.如权利要求1或2中所述的方法，其中通过施加正电势将所述带电物质(22)送至电 极(24)，所述正电势也导致所述金属离子(26)的形成。
4.如权利要求1、2或3中所述的方法，其中所述带电物质(22)带负电。
5.如任一项前述权利要求中所述的方法，其中所述释放剂(20)包括具有带电单元的 硫醇。
6.如任一项前述权利要求中所述的方法，其中所述释放剂(20)是硫氰酸铵或硫氰酸钾。
7.如任一项前述权利要求中所述的方法，其中所述释放剂(20)是硫代硫酸盐或带电 的硫醇链。
8.如任一项前述权利要求中所述的方法，其中所述释放剂(20)提供多个离子以形成 所述带电物质。
9.如权利要求8中所述的方法，其中所述释放剂(20)提供多个氯离子以形成所述带电 物质(22)。
10.如权利要求9中所述的方法，其中所述释放剂(20)是NaCl或HC1。
11.如任一项前述权利要求中所述的方法，还包括用所述金属标记物(18)标记所述分 析物(12)的步骤，其中所述分析物(12)与结合部分(16)温育，所述结合部分(16)能够结 合所述分析物并用所述金属标记物标记。
12.如权利要求11中所述的方法，还包括将所述分析物(12)与另一种结合部分(10) 温育的步骤，所述结合部分(10)能够与所述分析物结合并被固定于固体支持物(14)。
13.如权利要求12中所述的方法，其中所述固体支持物(14)是可动的或固定的。
14.如权利要求13中所述的方法，其中所述可动的固体支持物(14)是磁化的。
15.如权利要求13或14中所述的方法，其中所述金属标记物(18)是金属纳米粒子且 其中所述固体支持物(14)是比所述金属纳米粒子更大或更小的粒子，从而容许从结合的 金属纳米粒子中滤出未结合的金属纳米粒子。
16.权利要求13、14或15中任一项所述的方法，其中所述固体支持物(14)是带电粒 子，从而容许电分离。
17.如权利要求13中所述的方法，其中所述固定的固体支持物(14)是三维表面或结构。
18.如权利要求17中所述的方法，其中所述固定的固体支持物(14)是三维多孔结构。
19.如权利要求13中所述的方法，其中所述固定的固体支持物(14)是二维表面或结构。
20.如任一项前述权利要求中所述的方法，其中所述金属标记物(18)是微粒标记物或 纳米粒子。
21.如权利要求20中所述的方法，其中所述金属标记物(18)是银纳米粒子或金纳米粒子。
22.如权利要求21中所述的方法，其中所述金属标记物(18)是银纳米粒子。
23.如任一项前述权利要求中所述的方法，其中所述量化测定步骤是伏安法。
24.如权利要求23中所述的方法，其中所述伏安法是阳极溶出伏安法。
全文摘要
描述了用于确定样品中金属标记的分析物(12)的存在或量的方法。所述方法包括以下步骤将释放剂(20)添加至所述金属标记的分析物(12)，从而将所述金属标记物(18)从所述分析物(12)中释放，所述释放剂(20)与金属标记物(18)形成带电稳定物质(22)，施加电势从而将所述带电稳定物质(22)送至电极(22)，在正电势下溶解所述带电稳定物质(22)，从而形成金属离子(26)，和执行量化测定步骤如阳极溶出伏安法来确定所述金属标记的分析物(12)的存在或量。
文档编号G01N33/543GK101971029SQ200880125056
公开日2011年2月9日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月26日
发明者罗伯特·安德鲁·波特, 马泰乌兹·希曼斯基 申请人:英国政府创新、大学与技能部