专利名称：：添加在饲料中植酸酶的微量测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种添加在词料中植酸酶的微量测定方法。
背景技术：
：一、植酸酶在饲料中的应用及其测定方法近年来，随着畜禽养殖业的发展和磷资源的消耗，磷酸氢钙价格连年攀升，已成为继蛋白质和能量之后又一大饲料原料；另一方面，饲料中添加大量无机磷也加剧了环境污染。因此，利用微生物植酸酶减少日粮中的磷酸氢钙用量越来越受到人们的青睐。目前，植酸酶产品的种类与剂型繁多，确定科学的植酸酶以及添加到饲料后，质量检测与评判方法，对选择质优价廉的植酸酶产品尤为重要。植酸酶检测方法最初由德国巴斯夫公司推出，1个植酸酶活性单位定义为在37°C和pH为5.5的条件下每分钟从浓度为0.005mol/1的植酸钠溶液中释放出lpmol无机磷所需要的植酸酶的数量。2002年，在这一定义的基础上，起草了饲用植酸酶活性测定方法的国家标准。标准适用于作伺料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料，样品最低检出量为90U/kg。植酸酶的基因片段一些来源于大肠杆菌，而另外一些商品植酸酶则来源于曲霉。大量的植酸酶分离纯化后性质鉴定表明，不同来源的植酸酶在分子量、等电点、最适温度和pH值上都有着明显的不同，并且在对底物的选择性上也有区别。来源于曲霉的植酸酶检测方法已于2002年正式发布(GB/T18634~2002)，但因为不同来源的植酸酶作用位点、最佳pH等均不同，用GB/T18634—2002测定来源于大肠杆菌的植酸酶，检测结果变异系数较大，无法准确测定，因此，需要有一种快速、简便，具有高度特异性、灵敏度、准确度的方法，测定植酸酶的活性以及添加在词料中的植酸酶的活性，将会更有利于科学合理地制作配方，促进植酸酶产业的发展。二、目前现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的问题(一)、加酶饲料中植酸酶活性测定的问题1、加酶饲料中酶活测定的问题之一酶的活性是测定其底物或产物的变化量，但是酶降解的底物或生成的产物，在饲料中本身就存在，而且存在的量很大，其数量是酶引起的变化量的好多倍。在酶活测定时饲料中本来存在的大量底物或产物也会引起显色反应，对酶制剂引起的显色反应构成干扰，所以属于酶活测定的杂质。由于饲料中本来存在的底物或产物量更大，会引起更深的显色反应，其所引起的吸光度变化值会远大于酶促反应底物显色所引起的吸光度值的变化。所以，加酶词料中酶活检测的第一个问题存在的杂质(本底)干扰。2、加酶词料中酶活测定的问题之二酶制剂加入饲料后，100010，000倍的稀释，使得饲料中酶制剂的活性，低于可测的活性底线。这是加酶饲料中酶活测定的第二个问题活性太低的问题。加酶饲料中酶的微量测定技术的关键之二是设法浓縮酶的浓度，或采用常用比色法以外灵敏度更高的测定方法。3、其它问题(1)酶与词料中的某些成分的亲和性，导致酶的溶解不全，引起测定的误差。最典型的例子是某些来源的植酸酶。(2)词料中的少量内源酶对外源酶的干扰，等等。三、目前现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的缺点现有测定方法(GB/T18634-2002)中，"钼黄法"测定植酸酶含量的原理为植酸酶在一定温度和pH条件下，水解植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3P04NH4V(V16Mo03]复合物，在波长415nm下进行比色测定。具体过程为取待反应液(酶浓度约0.4U/ml)0.2ml，加入1.8ml0.25mol/l的pH5.0乙酸缓冲液，37。C水浴预热5分钟，加入已预热至37°(3的7.5mmo1/1的植酸钠溶液4ml，37'C精确水解30分钟，加入4ml颜色终止液(1份100g/l钼酸铵溶液+1份2.35g/L偏钒酸铵溶液+2份l:2水溶液的硝酸溶液)，反应后室温下静置10分钟，4000rpm7离心10分钟。上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nrn波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，根据实测吸光值计算植酸酶的活性。该方法用于测定植酸酶样品，相对较为准确。但是，用于测定添加在饲料中的植酸酶，该方法检测下限为2.0U/g饲料，而实际饲料中的植酸酶酶活约为0.5U/g饲料，远远低于该方法的检测下限。另外，饲料中无机磷含量远高于反应生成的无机磷量，影响植酸酶与底物的反应。样品空白吸光值超出测定范围。四、现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的结果目前，植酸酶制剂在畜禽饲料生产中已得到广泛应用，但饲料中植酸酶活性的测定方法还存在一些争议。2002年，国家颁布了饲用植酸酶活性的测定方法标准(GB/T18634-2002)，该标准注明其适用于词料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓縮饲料和添加剂预混合饲料。但配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料成分显然更为复杂，其适用性受到质疑。使用该方法测定"添加在饲料中的植酸酶活性"，结果相对偏差较大，变异系数较大。下表所示是用标准(GB/T18634-2002)方法测定加酶词料中植酸酶活性的一些实验数据加酶饲料样品中植酸酶活性测定(U/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由上述测定结果可知，该方法直接测定配合饲料或浓縮料中的植酸酶活性，变异系数较高(13%—20%)，有时甚至更高，因此，本方法用于测定配合饲料或浓缩料中的植酸酶活性时，相对偏差在20%，测定结果误差较大。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种能够准确测定添加在饲料中植酸酶活性的微量测定方法。本发明所采用的技术方案是本发明所述添加在饲料中植酸酶的微量测定方法，其步骤如下(1)试剂和溶液的配制(U)乙酸缓冲液(I)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:称取34.02g三水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01,再转移至lOOOmL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效；(1.2)乙酸缓冲液(II)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:称取34.02g三水乙酸钠，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00士0.01,再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效；(1.3)植酸钠溶液(C6H6024P6Na,2)为7.5mmol/l:称取0.6929g植酸钠(C6H6024P6Na12，相对分子质量为923.8，纯度为95%)，精确至O.lmg，置于100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液(I)溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00土0.01，转移至100ml容量瓶中，并用乙酸缓冲液(I)定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/l);(1.4)硝酸溶液l份浓硝酸+2份水；(1.5)钼酸铵溶液，100g/l:称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo70244H20]于50ml烧杯中加水溶解，再转移至lOOmL容量瓶中，加入1.0ml氨水(25%)用水定容至刻度；(1.6)偏钒酸铵溶液，2.35g/l:称取0.235g偏钒酸铵,4￥03)于50ml烧杯中，加入2ml硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至lOOmL棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光条件下保存；(1.7)颜色终止液取2份硝酸溶液，1份钼酸铵溶液，1份钒酸铵溶液混合使用，现用现配；(1.8)标准植酸酶(标明准确活性单位和类型)；(2)测定(2.1)标准曲线准确称取一定量的标准植酸酶，精确至0.0001g，于50ml容量瓶中，用乙酸缓冲液(II)溶解并定容至刻度，做两次稀释，使植酸酶活性为0.30U/ml左右，当日配制；将上述植酸酶按表1用缓冲液(II)进行稀释，需要准确计算植酸酶的浓度，与样品一起反应测定，以植酸酶浓度为横坐标，吸光度为纵坐标,列出直线回归方程(广ax+b):表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2.2)试样溶液的制备(2.2.1)样品处理将取有代表性样品预冷至4'C，全部粉碎(采取间断式粉碎，防止粉碎时饲料发热)通过0.45mm的标准筛，充分混匀后准确称取样品50.00g，加入500ml乙酸缓冲液n，在4"C环境下磁力搅拌45分钟，过滤(弃去初滤液50ml)，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4t:预冷的透析外液(乙酸缓冲液I)中，透析外液体积约为透析酶液的10倍，透析时间为20小时(透析10小时需换一次透析外液)；透析后准确量取体积并记录；(2.2.2)已知酶液配制取标准植酸酶配制成酶活为0.05U/ml的酶液，取100ml，如步骤(2.2.1)的方法进行透析、测定；(2.2.3)样品+已知酶准确称取待测定饲料样品预冷至4°C，全部粉碎并通过0.45mm的标准筛，充分混匀后取样50.00g，量入步骤(2.2.2)所得已知酶液500ml，在4"C环境下磁力搅拌45分钟，过滤(弃去初滤液50ml)，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4r预冷的透析外液(乙酸缓冲液I)中，透析外液体积约为透析酶液的10倍，透析时间为20小时(透析10小时需换一次透析外液)；透析后准确量取体积并记录；得加有己知酶的样品透析液.(2.3)反应取透析液l.Oml，加入l.Oml乙酸缓冲液(I)，37。C水浴预热5分钟，加入已预热至37'C的7.5mmo1/1的植酸钠溶液4ml，37'C精确水解30分钟，加入4ml颜色终止液，反应后室温下静置10分钟，4000rpm离心10分钟；上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值；根据实测吸光值计算植酸酶的活性取25mL试管按表2所示顺序进行操作，在反应过程中，从加入植酸钠溶液开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37"C水解30min:表2反应步骤、溶液用量反应顺序样品、标准样品空白(标准空白)l.加入乙酸缓冲液(I)l.Oml1.0ml(2.0ml)2.加入待反应液l.Omll.Oml3.混合V々11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2.4)样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零,在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，用直线回归方程计算植酸酶的活性；(2.5)结果计算和表示(2.5.1)植酸酶活性计算C植酸酶活性(U/g"-xFm式中C-…根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性；F—试样溶液反应前的总稀释倍数；m画—-试样重量；(2.5.2)结果表示两个平行样品的测定结果用算式平均值表示，保留整数。本发明的有益效果是本发明所述添加在饲料中植酸酶的微量测定方法与现有技术对加酶饲料的测定方法(用标准(GB/T18634-2002)方法)相比存在以下不同首先，通过预处理方法降低饲料中无机磷含量用乙酸缓冲液I作为透析外液对样品进行透析处理，来消除饲料中的无机磷对植酸酶水解反应的影响。植酸酶水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，如果无机磷含量过高，则会抑制植酸酶水解底物，从而影响测定的准确性，本发明方法通过将样品提取液低温透析后，可以将样品提取液中的无机磷透析出来，排除了样品中无机磷含量过高对植酸酶水解底物的抑制作用。其次，反应时取待反应液体积lml代替现有方法中的0.2ml，加lml乙酸缓冲液I代替现有方法的1.8ml乙酸缓冲液I，使样品空白的吸光值落在一个合理的测定范围内，避免因样品空白中无机磷含量过高而引起测定的误差。饲料中酶活约为0.5U/g饲料，远低于现有方法中测定酶活的下限(2.0U/g饲料)，提取后的待反应液酶活约为0.05U/ml，本发明将现有方法中待反应液体积由0.2ml提高到lml，待反应液中酶活提高了5倍，使得样品吸光值落入一个有效的测定范围。第三，在词料中添加已知酶，通过测定已知酶，检验已知酶在样品提取、透析、测定过程中是否有损失。具体计算步骤为已知酶回收率(%)=(Al-A2)/A3xl00%Al:已知酶液与饲料(体积/质量)为10:l进行提取、透析后的测定值(U/ml)A2:乙酸缓冲液II与饲料(体积/质量)为10:l进行提取、透析后的测定值(U/ml)A3:已知酶液进行透析后的测定值(U/ml)饲料样品酶活(U/g饲料)=八2><稀释倍数><(透析后体积/透析前体积)计算已知酶添加到饲料中是否与理论添加量相符己知酶回收率允许误差不大于10%;同一个样品两个平行测定值的相对偏差不大于10%。综上分析，本发明所述添加在词料中植酸酶的微量测定方法通过饲料样品的预处理，消除了无机磷对植酸酶水解反应的影响，降低了植酸酶检测下限，因此能够准确测定添加在饲料中植酸酶含量。具体实施例方式下面通过具体的实验测定过程来说明本发明。l.试剂和溶液本标准中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯和符合GB/T6682中规定的三级水。1.1乙酸缓冲液(I)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:称取34.02g三水乙酸钠于lOOOml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，再转移至lOOOml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月内有效。1.2乙酸缓冲液(II)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:称取34.02g三水乙酸钠，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于lOOOml烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00士0.01，再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月内有效。1.3植酸钠溶液(C6H6024P6Na,2)为7.5mmol/l:称取0.6929g植酸钠(C6H6024P6Na12，相对分子质量为923.8，纯度为95%)，精确至O.lmg，置于100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液(I)溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，转移至100ml容量瓶中，并用乙酸缓冲液(I)定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/l)。1.4硝酸溶液l份浓硝酸+2份水。1.5钼酸铵溶液，100g/l:称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo70244H20〗于50ml烧杯中加水溶解，再转移至100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25%)用水定容至刻度。1.6偏钒酸铵溶液，2.35g/l:称取0.235g偏钒酸铵,4￥03)于50ml烧杯中，加入2ml硝酸溶液(1.4)及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。避光条件下保存。1.7颜色终止液取2份硝酸溶液(1.4)，1份钼酸铵溶液(L5)，l份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。1.8标准植酸酶(标明准确活性单位和类型)。2.仪器和设备实验室常用仪器设备2.1分析天平感量0.1mg2.2恒温水浴(37士0.1)。C2.3分光光度计有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。2.4磁力搅拌器。2.5涡流式混合物。2.6酸度计精确至小数点后2位。2.7离心机转速4000r/min以上。3.试样制备取有代表性样品，用四分法将试样缩分至500g，配合伺料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封器，防止试样成分变化。4.测定步骤4.1标准曲线准确称取一定量的标准植酸酶(1.8)，精确至0.0001g，于50ml容量瓶中，用乙酸缓冲液(II)溶解并定容至刻度，做两次稀释，使植酸酶活性大约为0.30U/ml左右，当日配制。将上述植酸酶按表1用缓冲液(II)进行稀释，需要准确计算植酸酶的浓度，与样品一起反应测定，以植酸酶浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，列出直线回归方程(厂ax+b)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.2试样溶液的制备、4.2.1样品处理将取有代表性样品预冷至4°C，全部粉碎(采取间断式粉碎，防止粉碎时饲料发热)通过0.45mm的标准筛，充分混匀后准确称取样品50.00g，加入500ml乙酸缓冲液n，在4"环境下磁力搅拌45分钟，过滤(弃去初滤液50ml)，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4。C预冷的透析外液(乙酸缓冲液I)中，透析外液体积约为透析酶液的10倍，透析时间为20小时(透析10小时需换一次透析外液)。透析后准确量取体积并记录。4.2.2已知酶液配制取一已知酶配制成酶活为0.05U/ml的酶液。取100ml进行透析、测定。(方法同样品组)4.2.3样品+已知酶准确称取样品50.00g，量入已知酶液(4.2.2)500ml，在4"C环境下磁力搅拌45分钟，过滤(弃去初滤液50ml)，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4t:预冷的透析外液(乙酸缓冲液I)中，透析外液体积约为透析酶液的10倍，透析时间为20小时(透析10小时需换一次透析外液)。透析后准确量取体积并记录。4.3反应具体测定过程取透析液l.Oml，加入l.Oml乙酸缓冲液(I)，37。C水浴预热5分钟，加入已预热至37-C的7.5mmol/L的植酸钠溶液(1.3)4ml，37。C精确水解30分钟，加入4ml颜色终止液(1.7)，反应后室温下静置10分钟，4000rpm离心10分钟。上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值。根据实测吸光值计算植酸酶的活性。取25mL试管按下面顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(1.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37t水解30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表2表2反应步骤及试剂、溶液用量反应顺序样品、标准样品空白(标准空白)l.加入乙酸缓冲液(I)l.Oml1.0ml(2.0ml)2.加入待反应液l.Omll.Oml3.混合々4.37。C预热5min5.依次加入底物(1.3)4ml4ml(第二步)6.混合V167.37i:水解30minVV8.依次加入终止液4ml4ml(第一步)9.混合总体积10ml10ml4.4样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机(2.7)上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零,在分光光度计(2.3)415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，A—AO为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。4.5结果计算和表示4.5.1植酸酶活性计算C植酸酶活性(U/g"-xFm式中C---根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U/g;F一一试样溶液反应前的总稀释倍数；m-誦—试样重量，g;4.5.2结果表示两个平行样品的测定结果用算式平均值表示，保留整数。4.5.3重复性同一样品两个平行测定的相对偏差，添加植酸酶的各种饲料样品不大于10%。以下是两种测定方法对于同一个词料样品，添加0.5U/g饲料的植酸酶，经过测定得到的结果。表3添加在(仔猪料、中大猪料、肉仔鸡料、中大肉鸡料)中0.5U/g伺料植酸酶的测定结果17样品名称仔猪料中大猪料肉仔鸡料中大肉鸡料理论值(U/g饲料)0.50.50.50.5本发明方法测定结果(U/g伺料)10.4930.5360.5270.53720.4S70.4290.4960.48830.5400.4410.5600.44340.4680.4340.5160.46150.5070.5220.4520.58460.4890.4470.5370.44270.5130.5340.5190.53780.4340.4970.4890.52890.5150.5050.4510.496100.4440.4500.4840.449110.4660.4580.4990.473120.5280.4300.6170.444平均值0.4880.4740.5120.490标准偏差0.030.040.050.05变异系数6.988.888.999.56最大值0.5400.5360.6170.584最小值0.4340.4290.4510.442已知酶透析前、(U/ml)0.05050.04910.05130.0508透析后(U/ml)0.05030.04960.05080.0501加到空白饲料中透析后(U/ml)0.05130.05010.04990.0503回收率(％)102.0101.098.2100.4现有技术测定方《S测定结果(U/g伺料)10.5420.5830.6580.66320.4340.4520.6070.41130.6290.5160.4620.58440.4400.5720.3800.60818<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4織t^(肉/J呷輒W^Ns^f4)中05u/gWli^TOi^m<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表5添加在(罗非鱼料、草鱼料、鲫鱼料)中0.511/8饲料植酸酶的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>40.4730.5130.59450.6790.5840.44160.6750.6410.5卯70.6560.4660.39280.4190.7320.37690.7180.6360.646100.4040.4100.697110.3卯0.4070.443120.4410.3950.342平均值0.5510.5490.507标准偏差0.130.120.15变异系数24.3121.9228.60最大值0.7180.7320.768最小值0.3卯0.3950.342由上述测定结果可知，现有技术测定方法测定结果(即添加在饲料中的植酸酶)相对偏差较大，变异系数CVX较大，可高达20%(有时甚至更高)，尤其是测定饲料中含有高含量的磷酸氢钙或磷酸二氢钙时，例如罗非鱼料、草鱼料、鲫鱼料，变异系数较大，有时甚至无法测定。本发明方法测定结果，消除了无机磷对测定的干扰、降低了酶活检测下限、用添加已知酶来检验该测定方法的可行性与准确性，变异系数较小(CV%《0%)，而且有比较好的重复性和准确性。2权利要求1、一种添加在饲料中植酸酶的微量测定方法，特征在于，其步骤如下(1)试剂和溶液的配制(1.1)乙酸缓冲液(I)，c(CH3COONa)＝0.25mol/l称取34.02g三水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效；(1.2)乙酸缓冲液(II)，c(CH3COONa)＝0.25mol/l称取34.02g三水乙酸钠，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效；(1.3)植酸钠溶液(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol/L称取0.6929g植酸钠(C6H6O24P6Na12，相对分子质量为923.8，纯度为95％)，精确至0.1mg，置于100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液(I)溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，转移至100ml容量瓶中，并用乙酸缓冲液(I)定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/l)；(1.4)硝酸溶液1份浓硝酸+2份水；(1.5)钼酸铵溶液，100g/l称取10g钼酸铵[NH4)6Mo7O24·4H2O]于50ml烧杯中加水溶解，再转移至100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水定容至刻度；(1.6)偏钒酸铵溶液，2.35g/l称取0.235g偏钒酸铵(NH4VO3)于50ml烧杯中，加入2ml硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100ml棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光条件下保存；(1.7)颜色终止液取2份硝酸溶液，1份钼酸铵溶液，1份钒酸铵溶液混合使用，现用现配；(1.8)标准植酸酶(标明准确活性单位和类型)；(2)测定(2.1)标准曲线准确称取一定量的标准植酸酶，精确至0.0001g，于50ml容量瓶中，用乙酸缓冲液(II)溶解并定容至刻度，做两次稀释，使植酸酶活性为0.30U/ml左右，当日配制；将上述植酸酶按表1用缓冲液(II)进行稀释，需要准确计算植酸酶的浓度，与样品一起反应测定，以植酸酶浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，列出直线回归方程(y＝ax+b)表1<tablesid="tabl0001"num="0001"><table><tgroupcols="2"><colspeccolname="c001"colwidth="50%"/><colspeccolname="c002"colwidth="50%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">标准编号</entry><entrymorerows="1">酶活(U/ml)</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">1</entry><entrymorerows="1">0.010</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">2</entry><entrymorerows="1">0.020</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">3</entry><entrymorerows="1">0.041</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">4</entry><entrymorerows="1">0.081</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">5</entry><entrymorerows="1">0.122</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">6</entry><entrymorerows="1">0.162</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">7</entry><entrymorerows="1">0.244</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>(2.2)试样溶液的制备(2.2.1)样品处理将取有代表性样品预冷至4℃，全部粉碎(采取间断式粉碎，防止粉碎时饲料发热)通过0.45mm的标准筛，充分混匀后准确称取样品50.00g，加入500ml乙酸缓冲液II，在4℃环境下磁力搅拌45分钟，过滤(弃去初滤液50ml)，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4℃预冷的透析外液(乙酸缓冲液I)中，透析外液体积约为透析酶液的10倍，透析时间为20小时(透析10小时需换一次透析外液)；透析后准确量取体积并记录；(2.2.2)已知酶液配制取标准植酸酶配制成酶活为0.05U/ml的酶液，取100ml，如步骤(2.2.1)的方法进行透析、测定；(2.2.3)样品+已知酶准确称取待测定饲料样品预冷至4℃，全部粉碎并通过0.45mm的标准筛，充分混匀后取样50.00g，量入步骤(2.2.2)所得已知酶液500ml，在4℃环境下磁力搅拌45分钟，过滤(弃去初滤液50ml)，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4℃预冷的透析外液(乙酸缓冲液I)中，透析外液体积约为透析酶液的10倍，透析时间为20小时(透析10小时需换一次透析外液)；透析后准确量取体积并记录，得加有已知酶的样品透析液；(2.3)反应取透析液1.0ml，加入1.0ml乙酸缓冲液(I)，37℃水浴预热5分钟，加入已预热至37℃的7.5mmol/l的植酸钠溶液4ml，37℃精确水解30分钟，加入4ml颜色终止液，反应后室温下静置10分钟，4000rpm离心10分钟；上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值；根据实测吸光值计算植酸酶的活性取25mL试管按表2所示顺序进行操作，在反应过程中，从加入植酸钠溶液开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃水解30min表2反应步骤、溶液用量<tablesid="tabl0002"num="0002"><table><tgroupcols="3"><colspeccolname="c001"colwidth="33%"/><colspeccolname="c002"colwidth="33%"/><colspeccolname="c003"colwidth="34%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">反应顺序</entry><entrymorerows="1">样品、标准</entry><entrymorerows="1">样品空白(标准空白)</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">1.加入乙酸缓冲液(I)</entry><entrymorerows="1">1.0ml</entry><entrymorerows="1">1.0ml(2.0ml)</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">2.加入待反应液</entry><entrymorerows="1">1.0ml</entry><entrymorerows="1">1.0ml</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">3.混合</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">4.37℃预热5min</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">5.依次加入植酸钠溶液</entry><entrymorerows="1">4ml</entry><entrymorerows="1">4ml(第二步)</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">6.混合</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">7.37℃水解30min</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">8.依次加入终止液</entry><entrymorerows="1">4ml</entry><entrymorerows="1">4ml(第一步)</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">9.混合</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">总体积</entry><entrymorerows="1">10ml</entry><entrymorerows="1">10ml</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>(2.4)样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，用直线回归方程计算植酸酶的活性；(2.5)结果计算和表示(2.5.1)植酸酶活性计算式中C-----根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性；F-----试样溶液反应前的总稀释倍数；m----试样重量；(2.5.2)结果表示两个平行样品的测定结果用算式平均值表示，保留整数。全文摘要本发明公开了一种添加在饲料中植酸酶活性的微量测定方法。该方法首先，用乙酸缓冲液I作为透析外液对样品进行透析处理，降低饲料中无机磷含量，以消除饲料中的无机磷对植酸酶水解反应的影响；其次，在反应时取待反应液体积1ml代替现有方法中的0.2ml，加1ml乙酸缓冲液I代替现有方法的1.8ml乙酸缓冲液I，使样品空白的吸光值落在一个合理的测定范围内，以避免因样品空白中无机磷含量过高而引起测定的误差；第三，在饲料中添加已知酶，通过测定已知酶，检验已知酶在样品提取、透析、测定过程中是否有损失。本发明能够准确测定添加在饲料中植酸酶含量。文档编号G01N21/75GK101493418SQ20091000942公开日2009年7月29日申请日期2009年2月24日优先权日2009年2月24日发明者刘金山,史宝军,崔细鹏,陈丽芝申请人:广东溢多利生物科技股份有限公司