专利名称：：一种龙血竭药材提取物的质量控制方法
技术领域：
：本发明属于中药分析领域，涉及种龙血竭药材提取物的质量控制方法。种中药材提取物的质量控制方法，特别涉及
背景技术：
：龙血竭为百合科剑叶龙血树Dranaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材经提取得到的树脂。主产于广西、云南。据《本草纲目》记载，性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结、生肌敛疮等显著功效。现代医学研究证实，龙血竭具有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。龙血竭药材提取物的制备方法为取龙血竭粉碎成粗粉，加8倍量乙酸乙酯回流提取2次，每次1小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓縮至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以30倍提取物量的0.35%NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液用10%HCL调pH至12，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，6(TC以下真空干燥，粉碎，过80目筛，即得。龙血竭药材提取物为红棕色至红褐色粉末；气微，味淡；具有活血化瘀，通脉舒络的功效；用于治疗中风血瘀证；证见半身不遂，口舌歪斜，言语謇涩或不语，偏身麻木，头晕目眩，舌质紫黯或有瘀点瘀斑，苔薄白或白腻，脉弦或涩。经检索，未发现有关于龙血竭药材提取物质量控制方法的相关报道，这对于控制龙血竭药材提取物的质量非常不利，为了有效地控制龙血竭药材提取物的质量，本发明提供了对龙血竭药材提取物中的总酚、7，4'-二羟基黄酮与龙血素B三种成分的含量测定方法，不仅如此，本发明还提供了龙血竭药材提取物的标准指纹图谱与该图谱的应用方法。
发明内容本发明的目的是提供一种对龙血竭药材提取物中总酚、7，4'_二羟基黄酮、龙血素B三种指标成分进行含量测定的方法，以及龙血竭药材提取物的指纹图谱的检测方法。本发明的目的是通过下列方式实现的龙血竭药材提取物的质量控制方法，可以采用以下方法中的任意一种或几种(1)采用紫外-可见分光光度法检测，龙血竭药材提取物含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)计，不得少于55.0%;(2)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材提取物含7，4'-二羟基黄酮(Cw&。04)不得少于O.50%;(3)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材提取物含龙血素8((:18112。05)不得少于0.50%;(4)采用高效液相色谱指纹图谱检测，其标准指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.400.60，2号峰0.420.65，3号峰O.520.78，4号峰70.560.79，5号峰0.650.95，6号峰0.700.98，7号峰0.821.15，S号峰1.00，8号峰1.011.35;其中S号峰为龙血素B的色谱峰。所述龙血竭药材提取物中总酚的含量测定方法为a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液；b.标准曲线的制备量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸定容；照紫外_可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取龙血竭药材提取物，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。上述总酚的含量测定方法的优选为a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1!111中含2040iig的溶液，即得;b.标准曲线的制备量取对照品溶液Oml，1.Oml，1.5ml，2.Oml，2.5ml，3.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外_可见分光光度法，在750800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取龙血竭药材提取物，研细，约取515mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺13g，置蒸发皿中，加入上述溶液10ml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇4060ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置，再加O.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。上述总酚含量测定方法的优选为a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每lml中含32iig的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取龙血竭药材提取物12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取8Q100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20X的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果龙血竭药材提取物按干燥品计算，含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)计，不得少于55.0%;所述龙血竭药材提取物中7，4'-二羟基黄酮的含量测定方法为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸溶液为流动相；b.对照品溶液制备称取7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；c.供试品溶液制备取龙血竭药材提取物，研细，称定，置量瓶中，加甲醇稀释，吸取该甲醇溶液，在硅胶G薄层板上，点供试样品溶液和对照品溶液，以氯仿_甲醇溶液为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置量瓶中，加入甲醇，称定重量，超声提取，放冷，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。上述7，4'-二羟基黄酮的含量测定方法优选为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸溶液的比例为2030:7585为流动相，流速O.51.5ml/min，检测波长为310350nm;b.对照品溶液制备称取干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成lml含5iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液制备取龙血竭药材提取物0.050.15g，加入甲醇25ml，称定重量，超声提取使溶解，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，点供试样品溶液和对照品溶液，以氯仿_甲醇的比例为515:0.51.5为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下检视，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，加入甲醇10ml，称定重量，超声提取，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1030ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；上述7，4'-二羟基黄酮的含量测定方法优选为照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸溶液的比例为24:76为流动相，流速lml/min，检测波长为330nm，理论塔板数按7，4'-二羟基黄酮峰计，应不低于3000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每lml含5iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物0.llg，精密加入甲醇25ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min使溶解，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，精密吸取该溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，于左边距lcm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距lcm处点5ia对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为10:l为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45ym的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品含7，4'_二羟基黄酮(C15H1Q04)不得少于0.50%。所述龙血素B的含量测定方法为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液为流动相；b.对照品溶液的制备称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。上述龙血素B的含量测定方法的优选为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为3050:5070为流动相，流速0.51.5ml/min，检测波长为250300nm;b.对照品溶液的制备称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成lml含20iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，取约O.050.15g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各520ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；上述龙血素B的含量测定方法的优选为10照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为40:60为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含20g的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物O.lg，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ill，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果龙血竭药材提取物含龙血素B(C18H2。05)不得少于0.50%。所述龙血竭药材提取物指纹图谱测定方法为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1X的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得。上述龙血竭药材提取物指纹图谱测定方法的优选为采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1X的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70X线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.41.Oml/min，检测波长为250300nm;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成lml含50iig的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，取约O.30.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各520ii1，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。上述龙血竭药材提取物指纹图谱测定方法的优选为参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:110.1X的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70X线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每lml含50iig的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10iU，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。对上述测定方法的研究与说明—、对总酚含量测定的研究说明1、测定条件的考察(1)仪器与试药紫外分光光度计，龙血竭提取物，7，4'-二羟基黄酮对照品，纯度为98.23%;水(超纯水)，其余试剂均为分析纯。(2)测定方法的选择根据化学成分研究结果，采用三氯化铁、铁氰化钾显色后，测定龙血竭提取物有效部位中总酚类化合物的含量。(3)对照品的选择选择7，4'_二羟基黄酮作为本品含量测定的对照品。(4)供试品制备方法与测定方法经研究，确定供试品制备方法为取龙血竭药材提取物12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20%的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；本发明中，O.3%的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为取0.3g十二烷基磺酸钠，置100ml容量瓶中，加50%乙醇溶液微热使溶解，放冷，加50%乙醇溶液定容至刻度，即得。2、7，4'-二羟基黄酮线性关系和回归方程(1)对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每lml中含32.5iig的溶液，即得。(2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，O.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在780nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定结果见表l，标准曲线见附图1。回归方程:y=0.1062x-0.01086其中x为浓度(iig/ml)，y为吸收度相关系数:r=0.9995，线形范围为1.2963.888yg/ml。表17，4'-二羟基黄酮标准曲线标准品浓度(吗/ml)1.302.603.95.26.5吸收度A0.1460.2950.4220.5550.7063、精密度试验取龙血竭提取物，按上述供试液制备方法制备成供试品溶液，在6分钟内，连续测定6次，结果见表2，结果表明精密度良好。表2精密度试验结果序号123456RSD%吸收度A0,3010.3010.3020.3010.3020,3020.324、稳定性试验取龙血竭提取物，按上述供试液制备方法制成供试品溶液，分别在不同时间测定其吸收度，结果见表3，表明供试品溶液在06分钟吸收度保持相对稳定。表3样品稳定性考察数据测定时间(min)0123456RSD(%)吸收度A0.3010.3010.3020.3020.3040.3030.3030.4测定时间(min)78910203040RSD(%)吸收度A0.3040.3050.3060.3080.3120.3220.3423.75、重复性试验取龙血竭提取物样品6份，按上述含量测定方法测定，结果见表4，表明样品测定重现性好。表4重复性试验结果序号123456平均RSD%称样量(mg)12,1912.1112,2712.3812.0512.09--吸收度A0.3030.3020.3080.310.3050.303--总酚量(％)70.5370.7671.2771.1271.8471.1271.110.636、加样回收试验取龙血竭提取物(含量为71.11X)6份，每份约5.0mg，精密称定，置25ml棕色容量瓶中，分别加入7，4'-二羟基黄酮约5!^，置水浴上挥干，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，按上述含量测定方法测定，计算总酚的含量和加样回收率，结果见表5。表5加样回收试验结果13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2、对照品溶液的制备与标准曲线的制作(1)对照品溶液的制备密称取6(TC减压干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮10mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取该溶液2ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液；(2)标准曲线的制作精密吸取对照品溶液4iii，8ia，i2ia，i6ia，20ia，分别注入液相色谱仪中，测定峰面积，见表7，以峰面积为纵坐标(Y)，进样体积为横坐标(X)，作图，得标准曲线，见附图2。线性关系和回归方程为:Y=20908.2X+7511.1;r=0.9997;线性范围为0.0380.192iig。表7标准曲线实验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3、精密度试验取样品，按上述供试品溶液制备方法制备，连续测定5次，结果见表8，表明精密度较好。表8精密度试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4、稳定性试验取样品，按上述供试品溶液的制备方法制备，分别在配置后0、2、6、12、24、48小时测定，结果见表9，表明供试品在48小时内稳定。表9样品稳定性考察数据<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>5、重复性试验精密称取同一批号样品5份，按本发明含量测定方法测定，每次进样20iU，结果表明方法重复性较好。表10重复性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6、加样回收试验精密称取样品(含7，4'-二羟基黄酮为6.7mg/g)5份，分别加入浓度为358.4iig/ml的7，4'_二羟基黄酮对照品溶液lml，水浴上挥干溶剂后，按本发明含量测定方法测定，计算回收率，结果见表ll，平均回收率为97.42%。表ll加样回收试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>限度确定根据龙血竭提取物10批20个数据的含测结果，规定本品按干燥品计算，含7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)不得少于0.50%。三、龙血素B含量测定的的研究说明1、系统适应性研究(1)仪器与试药高效液相色谱仪，紫外检测器，龙血素B对照品，乙腈(色谱纯)，水(超纯水)；(2)色谱条件流动相的选择经研究，选择乙腈-1%HAc(冰醋酸)比例为40:60系统作为流动相；测定波长的选择经研究，将测定波长定为278nm;柱温30。C;系统适用性在系统实验中龙血素B的理论塔板数不得低于4000。2、供试品溶液和对照品溶液的制备16(1)供试品溶液的制备精密称取龙血竭药材提取物粉末0.lg，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60°C水浴锅表面，加热回流60分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得。(2)对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含20lig的溶液，作为对照品溶液。3、线性关系考察精密称取龙血素B对照品10.05mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为100.5ug/ml的标准品储备液，分别精密吸取该溶液0.4ml，1.Oml，2.Oml，4.Oml，6.Oml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；分别进样10yl，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，见表13和附图3。线性关系和回归方程回归方程为y=35.206x-17.105，r=0.9999;线性范围为4.02ug/ml100.5yg/ml。表13标准曲线的测定进样浓度(Hg/ml)4.0210.0520.140.260.3跳5峰面积积分值(Y)136.63343.97688.261390.772075,783541.264、精密度试验精密吸取对照品(20.1iig/ml)溶液10iU，重复进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD，结果见下表14，表明精密度良好。表14精密度试验测定次数(次)1__^_456RSD(%)峰面积积分值(Y)~~690.97693.92^131696.29"""""&5.605^1~"5、稳定性试验精密吸取供试品溶液10li1，分别于第0、3、6、9、12、15小时进样一次，共进样6次，测得峰面积积分值，见表15，计算RSD，结果表明龙血素B峰面积在15小时内基本稳定。表15稳定性试验测定时间(hr)03691215RSD(%)峰面积积分值488.13480.83484.21488.49480,%484,700.696、重复性试验取龙血竭提取物，按照供试品溶液制备方法制备，平行试验5份，测定，结果见表16，龙血素B平均含量为6.96mg/g，RSD=0.98%。表16重复性试验测定次数(次)12345均值RSD(%)—龙血素B(mg/g)7.047.006.866.966,936.960.987、加样回收率试验取已知含量的龙血竭提取物(含量6.96mg/g)约0.05g，5份，分别精密加入浓度为354.0g/ml的龙血素B对照品溶液1.0ml，按龙血竭提取物供试品溶液制备方法制备，测定，结果见表17，平均加样回收率为97.74%，RSD=1.96%，表明方法重复性较好。表17加样回收率试验序号取样量(g)样品含量(ug)加对照品量(ug)铋w加样回收率(%)平均加样回收率(％)RSD(%)10.0531369.58354.0715.2497.6520.0584406.47354.0759.2399.650.0524364.70354.0703.4495.6897.741.%40.0621432.22354.0785.1299.6950.0519361.22354.0701.1299.028、样品测定依上述方法对十批龙血竭提取物进行测定，结果见下表18。表18十批样品中龙血素B含量测定批号含量:(%)平均含量(％)0309010.700.690.70030卯20,690.680.680309030.750.740.750309070.840.840.840309080.710.730.720309090.750.770.760309120.740.720.730309160.780.790.790309190.770.750.760309200.730.730.73限度确定根据龙血竭提取物10批20个数据的含测结果，规定本品按干燥品计算，含龙血素B不得少于0.50%。四、指纹图谱测定方法的研究与说明1、概述龙血竭提取物由龙血竭单味药材提取而成，具有活血化瘀，通脉舒络的功效，用于血瘀引起的中风。为了更全面、有效的控制龙血竭提取物的质量，提高质量控制水平，发明人参照中药注射剂指纹图谱的要求，对龙血竭提取物指纹图谱进行了研究，经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批龙血竭提取物指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了龙血竭提取物的指纹图谱标准草案，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制质量的目的。对所测得的指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经多次试验研究，且通过与计算相对保留时间及相对保留峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对龙血竭提取物指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。所以我们采用该软件做为龙血竭提取物指纹图谱相似度的计算软件。182、标准指纹图谱的研究说明(1)参照物:龙血竭提取物处方由龙血竭提取物组成，根据对龙血竭的成分的分析，选择龙血素B作为参照物；(2)供试品溶液的制备取龙血竭提取物粉末，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加50%甲醇25ml，超声30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，做为供试品溶液。[O205](3)检测方法①仪器和试剂仪器高效液相色谱仪；多波长紫外-可见检测器，全自动进样器，流动相为O.1%的磷酸-甲醇梯度洗脱，洗脱顺序为时间(min)A%(0.1%磷酸)B%(乙腈)07030502080602080流速为0.7ml/min;检测波长为280nm;理论板数按参照物(龙血素B)峰计算，应不低于6000。试剂甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。②色谱柱经试验考察，选择用WatersXterra(:18色谱柱作为龙血竭提取物指纹图谱测定专用色谱柱。③测定波长发明人检测了五个波长下的指纹图谱，经比较分析，确定280nm为龙血竭药材提取物指纹图谱的检测波长，在该波长下的指纹图谱中，除已知成分龙血素B能够较好的检测出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好，基线较平稳、重复性好；(4)稳定性试验取龙血竭提取物，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔3小时测定一次其指纹图谱，共测6次，以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，结果见表19，相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液15小时内成分是稳定的，符合指纹图谱的技术要求。表19稳定性分析结果(参照文件名为龙血竭提取物对照图谱.Sep)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(5)精密度试验取龙血竭提取物，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定；测定结果见表20、21、22;结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD<3%)，又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，均符合指纹图谱的技术要求；表明该方法精密度良好。表20精密度考察结果(占总峰面积5%以上主要峰的保留时间)123456averRSD%RtRtRtRtRtRtRtRts26.89726.87726.93226.90326.90626.90226.9030.07i13.06613.05613.08513.06813.07513.07113.0700.07213.85213.83913.87013.85213.86013.85813.8550.08317,74617.73017.77317.74817.75517.75017.7500.08418.69518.67818.72418.69818.70518.70018,7000.08521.17121.15621.20421.17921.18421.18021.1790.07622.03322.01922.06822.04322.04722.04322.0420.07726.29726.27726.33026.30326.30726.30126.3030.07830.84030.81830.88030,84630.84930.84830.8470.07表21精密度考察结果(占总峰面积5%以上的主要峰的峰面积)123456averRSD%AAAAAAAAs3797.2263794.2793810.8183808.1363804.0093804.2113803.1130.17i1514.3021510.9011512.8941515.9641517.9591522.0101515.6720.2621961.0231958.5591961.4401960.6921960.9621959.5171960.3660.0633031.5943031.1003037.3543040.9963039.1463040.9383036.8550.1541599.1601600.6771602.8231602.7041606.6261606.8981603,1480.191499.4921502.9611509.5651504.3711505.1871499.9451503.5870.2561428.3471430.9201421.0561428.7941435.4431440.1201430.780.4672110.4662116.8462121.9542119.8172119.3832113.5232116.9980.2082604.6922603.4542618.9342606.9022609.6222607.0672608.4450.20表22精密度分析结果(参照文件名为龙血竭提取物对照图谱.Sep)20<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(6)重复性试验取龙血竭提取物，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液5份，依法测定，结果见表23，计算相似度，相似度结果均不小于0.95，符合指纹图谱的技术要求。表23重复性分析结果(参照文件名为龙血竭提取物对照图谱.Sep)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>根据以上方法学考察结果，表明该方法测定龙血竭提取物的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。(7)十批大生产成品的测定及标准指纹图谱的获得十批成品按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表24，结果计算相似度，在相似度软件中以这十批供试品指纹图谱为基础获得"共有模式"作为标准指纹图谱，见附图4，并规定龙血竭提取物指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算，相似度应大于O.80。表24龙血竭提取物指纹图谱一十批分析结果(参照文件名为龙血竭提取物对照图谱.Sep)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本发明的有益效果1、本发明提供了对龙血竭药材提取物中总酚、7，4'-二羟基黄酮和龙血素B三种成分含量测定的方法，这些方法在原有的质量标准中都没有，对这三种成分的含量进行检测，可以更加真实地反应龙血竭药材提取物的质量；2、本发明还提供了一种龙血竭药材提取物的的指纹图谱检测方法，这种指纹图谱的检测方法可以全面地反应龙血竭药材提取物的质量，对控制龙血竭药材提取物的质量大有帮助；3、本发明的提供的方法具有良好准确性、稳定性和重复性，可以应用于大工业生产中，是非常好的质量控制方法。附图1:总酚含量测定中的7，4'-二羟基黄酮标准曲线附图2:7，4'_二羟基黄酮含量测定中的7，4'-二羟基黄酮标准曲线附图3:龙血素B含量测定中龙血素B标准曲线附图4:龙血竭提取物标准指纹图谱具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。实施例1:总酚的含量测定方法a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含25g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液1ml，0.9%三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在765nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取批号为030901的龙血竭药材提取物10mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺lg，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用15%的乙醇40ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果龙血竭药材提取物按干燥品计算，含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)计，占60.5%。实施例2:总酚的含量测定方法a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每lml中含32iig的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取批号为030907的龙血竭药材提取物12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20%的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果龙血竭药材提取物按干燥品计算，含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)计，占64.5%。实施例3:总酚的含量测定方法a.对照品溶液的制备取7，4'_二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含35g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液1ml，0.9%三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在790nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取批号为030909的龙血竭药材提取物15mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺3g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置7(TC水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用25%的乙醇60ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇110ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果龙血竭药材提取物按干燥品计算，含总酚以7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)计，占62.5%。实施例4:7，4'-二羟基黄酮的的含量测定照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸溶液的比例为25:80为流动相，流速0.8ml/min，检测波长为320nm，理论塔板数按7，4'_二羟基黄酮峰计，应不低于3000;b.对照品溶液的制备精密称取60C减压干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每lml含5iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030901的龙血竭药材提取物0.08g，精密加入甲醇25ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min使溶解，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，精密吸取该溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，于左边距lcm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距lcm处点5y1对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为5:1.2为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45iim的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；24e.测定结果本品含7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)为0.60%。实施例5:7，4'-二羟基黄酮的的含量测定照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸溶液的比例为24:76为流动相，流速lml/min，检测波长为330nm，理论塔板数按7，4'-二羟基黄酮峰计，应不低于3000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每lml含5iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030907的龙血竭药材提取物0.llg，精密加入甲醇25ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min使溶解，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，精密吸取该溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，于左边距lcm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距lcm处点5y1对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为10:l为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45iim的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品含7，4'_二羟基黄酮(C15H1Q04)为0.65%。实施例6:7，4'-二羟基黄酮的的含量测定照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸溶液的比例为30:78为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为340nm，理论塔板数按7，4'_二羟基黄酮峰计，应不低于3000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每lml含5iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030909的龙血竭药材提取物0.15g，精密加入甲醇25ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min使溶解，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，精密吸取该溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，于左边距lcm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距lcm处点5y1对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为15:l为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45iim的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品含7，4'-二羟基黄酮(C15H1004)为0.63%。实施例7:龙血素B的的含量测定照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为30:70为流动相，流速0.8ml/min，检测波长为270nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每lml含20iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030901的龙血竭药材提取物0.08g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果龙血竭药材提取物含龙血素B(C18H2。05)为0.55%。实施例8:龙血素B的的含量测定照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为40:60为流动相，流速1.Oml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每lml含20iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030907的龙血竭药材提取物0.lg，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果龙血竭药材提取物含龙血素B(C18H2。05)为0.65%。实施例9:龙血素B的的含量测定照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为50:55为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为280nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每lml含20iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030909的龙血竭药材提取物O.15g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ii1，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果龙血竭药材提取物含龙血素B(C18H2。05)为0.59%。实施例10:指纹图谱的测定参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性Agilent1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.5ml/min，检测波长为270nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030901的龙血竭药材提取物，研细，取约O.4g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各101，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.45，2号峰0.52，3号峰O.60，4号峰0.65，5号峰0.75，6号峰0.82，7号峰0.97，S号峰l.OO，S号峰l.15;其中S号峰为龙血素B的色谱峰；并且，供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.85。实施例11:指纹图谱的测定参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性Agilent1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030907的龙血竭药材提取物，研细，取约O.5g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10ill，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.50，2号峰0.54，3号峰O.65，4号峰0.68，5号峰0.80，6号峰0.84，7号峰0.97，S号峰l.OO，S号峰l.18;其中S号峰为龙血素B的色谱峰；并且，供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.90。27实施例12:指纹图谱的测定参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行a.色谱条件与系统适应性Agilent1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.8ml/min，检测波长为290nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取批号为030909的龙血竭药材提取物，研细，取约O.6g，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20ill，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.50，2号峰0.54，3号峰O.65，4号峰0.70，5号峰0.81，6号峰0.85，7号峰0.98，S号峰l.OO，S号峰l.18;其中S号峰为龙血素B的色谱峰；并且，供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.88。28权利要求一种龙血竭药材提取物的质量控制方法，其特征在于采用以下方法中的任意一种或几种(1)采用紫外-可见分光光度法检测，龙血竭药材提取物含总酚以7，4′-二羟基黄酮计，不得少于55.0％；(2)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材提取物含7，4′-二羟基黄酮不得少于0.50％；(3)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材提取物含龙血素B不得少于0.50％；(4)采用高效液相色谱指纹图谱检测，其标准指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.40～0.60，2号峰0.42～0.65，3号峰0.52～0.78，4号峰0.56～0.79，5号峰0.65～0.95，6号峰0.70～0.98，7号峰0.82～1.15，S号峰1.00，8号峰1.01～1.35；其中S号峰为龙血素B的色谱峰。2.如权利要求1所述总酚的含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液；b.标准曲线的制备量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸定容；照紫外_可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；C.供试品溶液制备与测定法取龙血竭药材提取物，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。3.如权利要求2所述总酚的含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1!111中含2040iig的溶液，即得;b.标准曲线的制备量取对照品溶液Oml，1.Oml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取龙血竭药材提取物，研细，约取515mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺13g，置蒸发皿中，加入上述溶液10ml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用1030%的乙醇4060ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液lml，三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。4.如权利要求3所述含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4'-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每lml中含32g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液O，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6%的铁氰化钾溶液lml，0.9%三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.测定法取龙血竭药材提取物12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70°C水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20%的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至lOOml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6X的铁氰化钾溶液lml，0.9X三氯化铁溶液lml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外_可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果龙血竭药材提取物按干燥品计算，含总酚以7，4'-二羟基黄酮计，不得少于55.0%。5.如权利要求1所述7，4'-二羟基黄酮的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1%冰醋酸溶液为流动相；b.对照品溶液制备称取7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；C.供试品溶液制备取龙血竭药材提取物，研细，称定，置量瓶中，加甲醇稀释，吸取该甲醇溶液，在硅胶G薄层板上，点供试样品溶液和对照品溶液，以氯仿_甲醇溶液为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置量瓶中，加入甲醇，称定重量，超声提取，放冷，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。6.如权利要求5所述7，4'_二羟基黄酮的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸溶液的比例为2030:7585为流动相，流速0.51.5ml/min，检测波长为310350nm;b.对照品溶液制备称取干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成lml含5iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液制备取龙血竭药材提取物0.050.15g，加入甲醇25ml，称定重量，超声提取使溶解，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，点供试样品溶液和对照品溶液，以氯仿_甲醇的比例为515:0.51.5为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下检视，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，加入甲醇10ml，称定重量，超声提取，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1030ii1，注入液相色谱仪，测定，即得。7.如权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为24:76为流动相，流速lml/min，检测波长为330nm，理论塔板数按7，4'-二羟基黄酮峰计，应不低于3000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的7，4'-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每lml含5iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物O.11g，精密加入甲醇25ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min使溶解，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，精密吸取该溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，于左边距lcm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距lcm处点5ia对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为10:l为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑，按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5min，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45ym的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20iU，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品含7，4'_二羟基黄酮不得少于0.50%。8.如权利要求1所述龙血素B的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1%冰醋酸水溶液为流动相；b.对照品溶液的制备称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液；C.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。9.如权利要求8所述龙血素B的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为3050:5070为流动相，流速0.51.5ml/min，检测波长为250300nm;b.对照品溶液的制备称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成lml含20iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，取约0.050.15g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各520iU，注入液相色谱仪，测定，即得。10.如权利要求9所述的含量测定方法，其特征在于照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例为40:60为流动相，流速1.Oml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000;b.对照品溶液的制备精密称取6(TC减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每lml含20iig的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物O.lg，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各lOiU，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果龙血竭药材提取物含龙血素B不得少于0.50X。11.如权利要求1所述指纹图谱测定方法，其特征在于高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液；C.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得。12.如权利要求11所述指纹图谱测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在20%，流动相B保持在80%;流速为0.41.Oml/min，检测波长为250300nm;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成lml含50iig的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，取约0.30.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各520iU，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。13.如权利要求12所述的指纹图谱的应用，其特征为参照中国药典2005版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70%线性下降至20%，流动相B从30%线性上升至80%，5060min时，流动相A保持在[20%，流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于[6000;b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；C.供试品溶液的制备取龙血竭药材提取物，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入[50%甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45ym的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各lOiU，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。全文摘要本发明提供了一种龙血竭药材提取物的质量控制方法，该方法可以采用以下四种质量控制方法的任意一种或几种(1)对总酚进行含量测定；(2)对7，4′-二羟基黄酮进行含量测定；(3)对龙血素B进行含量测定；(4)高效液相色谱指纹图谱检测。本发明提供的质量控制方法，准确，精密，稳定性好，能够有效地控制龙血竭药材提取物的质量。文档编号G01N30/86GK101780191SQ20091000964公开日2010年7月21日申请日期2009年1月20日优先权日2009年1月20日发明者刘涛,吴云,孙永城,屠鹏飞,徐玉玲,毕宇安,王振中,章晨峰,萧伟,邹艳萍申请人:江苏康缘药业股份有限公司