专利名称：分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇ecl标记物的制作方法
技术领域：
本发明属于精细化工领域，具体涉及一种分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌z
锇ECL标记物。
背景技术：
二联吡啶钌Ru(bpy)32+电化学发光(Electrochemiluminescence，简称ECL)具有原 位响应、检测灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，在药物分析、氨基酸分析、 DNA探针分析、酶生物传感器领域得到了广泛应用。特别是IGEN Inc.和Gahhersburg MD公司首先将Ru(bpy)^+应用于免疫分析、聚合酶链转录(PCR)产物的测定和基因序列 研究后，Ru(bpy)3"ECL在临床医学、电分析化学、生命科学等领域的应用得到了普遍 关注。(Massey R. J" Powell M. J., Mied R A.， et al. WO 87 06 706,1987)
Ru(bpy),与三丙胺(TPrA)共混合体系的ECL应用最为广泛，检测限目前己经达到fm 级，该混合体系中的分子间作用以及TPrA氧化的不可逆决定了检测中必须使用大大过量 (100 mM)的TPrA。而TPrA的自身氧化会产生ECL干扰光，这一背景干扰光的存在必然影响到 ECL检测的信噪比、灵敏度以及最低检测限等，从而在根本上制约该混合体系ECL检测应用 的进一步发展。随着科学技术的发展，在很多检测领域对ECL的灵敏度提出了更高的要 求。为此，国内外各硏究组开展了许多卓有成效的研究
(1) 通过改变共反应物结构优化电化学发光反应过程。三丙胺(TPrA)是近20年 来研究最充分，应用最广泛的Ru(bpy)3"ECL共反应试剂。而作为2007年新报道的共反 应试剂N, N-二丁基乙醇胺(DBAE)则表现出最为优秀的发光效果。应用金电极和钼电 极作为工作电极，1^0 7)32+-08八￡体系ECL分别比Ru(bpy)32、TPrA增强10倍及100倍。 但DBAE的发现还不能彻底改变在ECL检测中必须使用大量还原剂的现状。
(2) 组建双核及多核钌金属络合物体系，形成激发态的二价Ru是整个ECL过程的 基础，所以增加中心金属的数量势必会提高ECL的强度。双核及多核钌金属络合物体系成为相关研究的 一 个热点。
(3)应用分子内电子转移机理设计新型ECL标记物。将TPrA通过共价键引入联吡啶 配体中，依靠分子内电子转移作用实现ECL检测，在具体实施过程中可以观察到ECL 现象，但相比现有共混合体系的分子间ECL，发光强度相对较弱。
发明内容
本发明的目的是改进现有共混合体系中三联吡啶钌一共反应物分子间作用造成体系电子 传递效率低，必须使用大大过量胺类共反应物的缺点，提供一种能够在降低胺类共反应物用 量的同时，增强ECL强度的联吡啶钌/锇ECL标记物。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌 /锇ECL标记物具有下列结构通式-
M (L)2L'
通式中M为Ru或Os; L选自任意的2，2'-联吡啶及其衍生物或者1,10-邻菲
咯啉(二氮杂菲)及其衍生物，L'选自以下配体
式中B为-(CH2V，其中n为整数l-10或者在任意位置存在酰胺键基团的烷基 链-(CH2)n-，烷基链总碳数n为整数1-10; P为吩噻嗪(PTZ)或H。
分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇ECL标记物的合成方法如下
以4,4'-二甲基联吡啶为原料，经历单甲基锂化，联吡啶侧链的延长以及吩噻嗪 (PTZ)亲核取代反应等合成以不同链长碳链连接的ECL标记物Ru-PTZ;同时，以邻 苯二甲酰亚胺为原料采用Gabrial合成法合成丙基胺取代的吩噻嗪(PTZ);以2-乙酰 基吡啶为原料采用Krohnke吡啶合成法合成4-甲基联吡啶，之后经历甲基氧化，最后与丙基胺取代的吩噻嗪(PTZ)反应合成带有酰胺键的ECL标记物Ru-A-PTZ。
本发明的有益效果是将具有可逆氧化还原活性的电子供体吩噻嗪(PTZ)引 入到联吡啶钉/锇ECL标记物结构中，对联吡啶钌/锇配体结构进行修饰，利用分子 内和分子间的协同作用，降低胺类共反应物的用量，减少背景干扰，使ECL得到大 大增强。
图1是采用铂(Pt)为工作电极，实施例1制备的ECL标记物Ru-PTZ和参比化合 物三联吡啶钌Ru(bpy),分别在三丙胺(TPrA )作用下的电化学发光强度对比图。
图2是采用金(Au)为工作电极，实施例1制备的ECL标记物Ru-PTZ和参比化合 物三联吡啶钌Ru(bpy),+分别在三丙胺(TPrA)作用下的电化学发光强度对比图。
图3是采用铂(Pt)为工作电极，实施例2制备的ECL标记物Ru-A-PTZ和参比化 合物三联吡啶钌Ru(bpy)^分别在三丙胺(TPrA )作用下的电化学发光强度对比图。
图4是采用金(Au)为工作电极，实施例2制备的ECL标记物Ru-A-PTZ和参比化 合物三联吡啶钉Ru(bpy)^+分别在三丙胺(TPrA)作用下的电化学发光强度对比图。
图5是三丙胺(TPrA)的浓度对实施例1制备的ECL标记物Ru-PTZ和参比化合物 三联吡啶钌Ru(bpy)32+电化学发光强度的影响示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但并不影响本发明的保护范围。
实施例1
ECL标记物Ru-PTZ的合成
反应式如下所示<formula>formula see original document page 6</formula>(1)中间体l的合成
将25ml单口瓶、注射器(1 mlx2、 10mlxl)放入烘箱，彻底烘干水分后，将l ml除水THF 及0.82ml除水二异丙胺(5.88mmo1)通过注射器注入25 ml单口瓶，并用橡胶塞密封置于冰 水浴中。将连接于油泵的针头插入单口瓶抽真空，并置换N2，反复3次，之后用注射器抽取2.2 mol/L正丁基锂的正己垸溶液2.4ml (5.43mmo1)注入N2氛围的单口瓶中，搅拌备用。
将lg4， 4，-二甲基-2，2，-联吡啶(5.43mmo1) 、 40 ml除水THF加入100 ml单口瓶中，并 用橡胶塞密封置于冰水浴中，抽真空，置换N2，反复3次。用注射器将25 ml单口瓶中的溶液 全部抽出缓慢注入100ml三口瓶中，无色溶液变为棕褐色，冰水浴搅拌lh。
用注射器将1.6ml， 1，3-二溴丙烷(16.29 mmol)注入三口瓶中，撤去冰水浴，反应3 h 后溶液变为黄色，加入50ml磷酸缓冲液(PH = 7)，并用二氯甲烷(3x50 ml)萃取，无水 硫酸钠干燥有机相，旋转蒸千后硅胶柱色谱分离(二氯甲烷-乙酸乙酯，4: 1)得淡黄色透明 油状物0.97g，收率为85%。(2) 中间体2的合成
25 ml单口圆底烧瓶中加入吩噻嗪(PTZ) 0.5 g (2.5 mmol)，氢化钠0.06 g (2.5 mmol)， 溶解于10mLDMF， N2保护下室温反应1 h后加入1.5 g中间体1 (5 mmol)。加热回流12小 时后冷却至室温，减压蒸丁-溶剂，硅胶柱分离(石油醚/CH2C1^5: 1)，得到棕黄色油状物0.6 g。收率为80%。
(3) Ru(bpy)2Cl22H20的合成
将RuCl3'3H20 (3.9 g, 19.9 mmol)和2， 2'-联吡淀(4.68 g, 30 mmol)溶于50 mL除水DMF 中，氮气下加入无水LiCl(4.2g， 1 mmol)。在氮气下混合液避光回流反应8 h，冷却至室温， 加入250mL丙酮，得到的悬浊液在0~3 'C冰箱放置过夜(约16h)。过滤，得到的黑绿色固体 分别用25mL水洗涤3次，然后再分别用25mL乙醚洗涤3次，真空干燥，得亮黑色品状颗 粒产品5.46 g。收率为35%。
(4) ECL标记物Ru-PTZ的合成
在磁力搅拌下，向溶解有200 mg中间体2 (0.472 mmol)的40 mL乙醇和5 ml水的混合溶液 中，加入207 mg Ru(bpy)2Clr2H20 (0.4 mmol)，得到黑色混合液。将此混合液在氮气保护下， 避光加热回流反应24 h后，溶液变成红色。利用旋转蒸发器蒸干溶剂，把得到的红色油状物
溶于乙醇屮。利用硅胶柱色谱进行分离提纯，展开剂CH3CN: H20: KN03饱和水溶液=10: 1: 1 (V/V/V)，收集红色组分，蒸干展开剂后将其溶于适量的乙腈溶剂中，过滤除去不溶
的硝酸钾，再将乙腈蒸干，溶于极少量甲醇，然后将其加入饱和的NH4PF6水溶液以置换N03— 对离子，将析出的沉淀过滤、充分水洗，干燥后得红色固体粉末状产品686mg。收率为76%。 ,H-NMR(《ppm, CD3COCD3): 1.84-1.89 (m， 4H， C2H2，C3H2)， 2.58 (s， 3H， bpy-CH3)， 2.88 (t， 7=7.01^， 2H， NCH2)， 4.00 (t， J-5.8Hz， 2H, bpy-CH2), 6.93 (t， J:7.4Hz， 2H， PTZ-H)， 7.00 (d， J=8.0Hz， 2H， PTZ-H)， 7.08-7.17 (m， 4H， PTZ-H)， 7.32-7.34 (d， J^5.8 Hz， 1H， bpy'-H)， 7.38-7.40 (d, J-5.8Hz, 1H， bpy'-H), 7.52-7.58 (m， 4H， bpy-H ,bpy'-H)， 7.78-8.00 (d, J=5.8Hz， 1H， bpy'-H)， 7.82-7.84 (d， J二5.8Hz， 1H， bpy'-H)， 7.96-8.04 (m， 4H， bpy-H，bpy'-H)， 8.17-8.20 (m， 4H， bpy-H, bpy'-H)， 8.64(s， 2H， bpy'-H)， 8.79-8.80 (m， 4H' bpy-H, bpy'-H)。 H腿S calculated for C47H41N7RuS [M-2PF6—产837.2188, found 837.2180。
(5) ECL标记物Ru-PTZ电化学发光的测试方法采用循环伏安电化学方法测试ECL标记物Ru-PTZ和参比化合物三联吡啶钉 Ru(bpy)3"分别在三丙胺(TPrA)作用下的电化学发光强度，ECL标记物Ru-PTZ和参比 化合物三联吡啶钉Ru(bpy)^+的浓度均为1 |aM，共反应试剂二丙胺(TPrA)的浓度范 围为5mM，测试电极为铂(Pt)电极，测试结果见图1;其他条件不变，测试电极改 为金(Au)电极，测试结果见图2。 .
实施例2
<formula>formula see original document page 8</formula>(1)中间体3的合成:
在装有直形冷凝管的200ml单口圆底烧瓶中，加入80ml无水乙醇，搅拌，分次加入邻 苯二甲酰亚胺10 g (68 mmol)，加热1 h。加入8°/。氢氧化钾(3.8 g， 68 mmol)的甲醇溶液60 ml 后，立刻有乳白色絮状沉淀，继续搅拌3h。冷却后过滤，干燥，得到白色片状品体12.7g， 收率为92%。
(2)中间体4的合成
在50ml单口圆底烧瓶中加入5g(25mmol)吩噻嗉(PTZ)， 0.6 g (25 mmol)氢化钠，溶 解于20mLDMF， N2保护下室温反应1 h后加入1,3 二溴丙烷(15 g, 75 mmol)，加热回流12 h 后冷却至室温，减压蒸干溶剂，硅胶柱分离(石油醚:CH2Cl2-2(H)，得到淡黄色油状物3.6g。 收率为45%。(3) 中间体5的合成
将3.5 g (18.9 mmol)中间体3禾口 3 g (9.4 mmol)中间体4混合，加入中间体4质量 3%的聚乙二醇1000为相转移催化剂，丙酮为溶剂，加热回流3h，冷却后过滤，蒸出溶剂后 减压蒸馏出过量的1，2-一溴乙烷及聚乙二醇。剩余物加少量水，二氯甲烷萃取用来除掉没有 反应完的钾盐。合并有机相，蒸掉CH2Cl2，无水乙醇重结晶。得到2.7 g淡黄色中间体5。 收率为75%。
(4) 中问体6的合成
将1.5 g中间体5溶解于20 ml乙醇屮，加入10 ml水合肼，加热回流5 h。蒸干溶剂后， 加入2 M盐酸溶液60 ml，再加入12 M盐酸3 ml。将悬浮液在50 'C下搅拌2 h，再在室温下 搅拌24h，过滤，浓缩。将浓縮物溶解在5ml水中。加入15°/。的氢氧化钠溶液，用二氯甲烷 萃取3次，每次用量30ml。合并有机相，蒸千溶剂得淡黄色油状物0.84 g，收率为85%。
(5) 中间体7的合成
将碘(40.8 g， 0.148 mol)溶解在吡啶(120 ml)中，2—乙酰基吡啶(16.56 ml, 0.148 mol) 溶于吡啶(40ml)中逐滴加入。溶液回流2.5h，然后静置12h。收集黑色沉淀，将黑色沉淀 溶解在乙醇(500 ml)中，加入活性炭5-8 g ，加热回流10min。将活性炭趁热过滤，滤液冷 却析出得到产品，收率为85%。
(6) 中间体8的合成
将中间体7(15g，46mmol)和乙酸铵(15 g, 195 mmol)溶于150ml甲醇中，加入巴豆醛 (3.8 ml, 46 mmol)，溶液加热至65 °C过夜反应，反应后蒸干溶液，得到黑色油状物用IK己 垸(6x50ml)萃取，所得有机相用饱和食盐水洗涤，并用硫酸镁干燥，产品应用柱层析分离 (A1203:正己烷-丙酮=9 ' 1)。用石油醚在低温下重结晶，得到3.1 g呈白色粉末产品中间体8， 收率为40%。
(7) 中间体9的合成
磁力搅拌下，将2.0 g ( 11.7 mmol)中间体8加入到30 mL浓硫酸中，待其完全溶解后， 将反应液冷却到0 。C，在1 h内向该反应液中分批加入6.5 g ( 65.1 mmol) Cr03颗粒。然后将 此蓝绿色溶液升温至75 。C，恒温4h后，冷却至室温，继续搅拌10h。将反应液倾倒在冰水 浴中'过滤，充分水洗后将滤饼悬浮在水屮，强烈搅拌下加入KOH颗粒至pH-9-10。过滤除掉其中的蓝绿色不溶物，将滤液用盐酸酸化至pH:l-2后析出乳白色沉淀。过滤，水洗， 乙醇洗，乙醚洗，干燥后得到产品2.1g，收率为90%。 (8 ) ECL标记物Ru-A-PTZ的合成
在磁力搅拌下，向溶解有200 mg中间体9 (1 mmol)的40 mL乙醇和5 ml水的混合溶液 中，加入51S mg Ru(bpy)2Cl2.2H20 (lmmol),得到黑色混合液。将此混合液在氮气保护下， 避光加热回流反应24h后，溶液变成红色。利用旋转蒸发器蒸干溶剂，把得到的红色油状物 溶于乙醇中。利用硅胶柱色谱进行分离提纯，展开剂CH3CN: H20: KN03饱和水溶液=4: 1: 1 (V/V/V)，收集红色组分，蒸干展开剂后将其溶于适量的乙腈溶剂中，过滤除去不溶 的硝酸钾，再将乙腈蒸干，溶于极少量甲醇，然后将其加入饱和的NH4PF6水溶液以置换N(V 对离子，将析出的沉淀过滤、充分水洗，干燥后得红色固体粉末状产品542 mg，收率为60%。
在N2保护下，将上步所得化合物(452 mg， 0.5 mmol)与SOCl2(4 mL， 20 mmol)混合后回流6 h。常压蒸馏除掉过量的SOCl2，冷却至室温，将得到的固体溶解在除水的MeCN(10mL)溶剂 中，然后将此溶液滴加到溶有中间体6 (256 mg, 1.0 mmol)和三乙胺(0.6 mL, 4.3 mmol)的 MeCN(20mL)溶液中，滴加完毕后搅拌反应l h,再加热至回流继续反应4 h。将反应液冷却 至室温后，向其中加入20 mL水，用CHCb萃取3次，每次用量为20 mL,再用O.l N的盐酸水 溶液洗涤有机相2次，每次用量20ml，分出有机相，用无水硫酸镁干燥后，旋转蒸发除掉溶剂。 用硅胶柱色谱进行分离提纯，展开剂CH3CN: H20: KN03饱和水溶液=10: 1: 1 (V/V/V)， 收集红色组分，蒸干展开剂后将其溶于适量的乙腈溶剂中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将乙 腈蒸干，溶于极少量甲醇，然后将其加入饱和的NH4PF6水溶液以置换N(V对离子，将析出的 沉淀过滤、充分水洗，干燥后得红色固体粉末状产品Ru-A-PTZ240mg，收率为42%。 'H-NMR ( ^ppm, CD3COCD3): 2.1-2.17 (m, 2H， C2H2)， 3.59 (t， /= 6.4 Hz， 2H， NCH2)， 4.09 (t, J =6.4 Hz, 2H, CONH-H), 6.88-6.93 (m, 2H, PTZ-H), 7.01-7.06 (m, 4H，PTZ-H), 7.16-7.20 (m, 2H， PTZ-H), 7.54-7.63 (m， 5H， bpy-H, bpy'-H)， 7.75-7.77 (m， 1H， bpy'陽H)， 8.04-8.10 (m, 5H， bpy-H，bpy'-H)， 8.15-8.17 (m, 1H， bpy'-H)， 8.19-8.26 (m， 5H， bpy-H, bpy'-H)， 8.81-8.86 (m， 5H' bpy-H， bpy'-H)， 8.96-8.97 (m， 1H， bpy'-H)。 HRMS calculated for C46H38N8ORuS [M-2PF(T产852.1933, found 852.1922。
(9) ECL标记物Ru-A-PTZ电化学发光的测试方法采用循环伏安电化学方法测试ECL标记物Ru-A-PTZ和参比化合物三联吡啶钌 Ru(bpy)^+分别在三丙胺(TPrA)作用下的电化学发光强度，ECL标记物Ru-A-PTZ和参 比化合物二联吡啶钌Ru(bpy) +的浓度分别为1 |xM，共反应试剂三丙胺(TPrA)的浓 度范围为5mM，测试电极为铂(Pt)电极，测试结果见图3;其他条件不变，测试电 极改为金(Au)电极，测试结果见图4。
权利要求
1、分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇ECL标记物，其特征在于，该联吡啶钌/锇ECL标记物具有下列结构通式M(L)2L′通式中M为Ru或Os；L选自任意的2，2′-联吡啶及其衍生物或者1，10-邻菲咯啉(二氮杂菲)及其衍生物，L′选自以下配体式中B为-(CH2)n-，其中n为整数1-10或者在任意位置存在酰胺键基团的烷基链-(CH2)n-，烷基链总碳数n为整数1-10；P为吩噻嗪(PTZ)或H。
2 、根据权利要求1所述的分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡疲钌/锇ECL标记物，其特征在于，合成方法如下以4， 4' -二甲基联吡啶为原料，经历单甲基锂化，联吡啶侧链的延长以及吩噻嗪(PTZ )亲核取代反应等合成以不同链长碳链连接的ECL标记物Ru-PTZ;同时，以邻苯二甲酰亚胺为原料采用Gabrial合成法合成丙基胺取代的吩噻嗪(PTZ);以2-乙酰基吡啶为原料采用Krohnke吡啶合成法合成4-甲基联吡啶，之后经历甲基氧化，最后与丙基胺取代的盼噻嗪(PTZ)反应合成带有酰胺键的ECL标记物Ru-A-PTZ。
全文摘要
本发明属于精细化工领域，具体涉及一种分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇ECL标记物。分子内带有吩噻嗪供电基团的联吡啶钌/锇ECL标记物具有下列结构通式M(L)<sub>2</sub>L′通式中M为Ru或Os；L选自任意的2，2′-联吡啶及其衍生物或者1，10-邻菲咯啉(二氮杂菲)及其衍生物，L′选自以上配体，式中B为-(CH<sub>2</sub>)<sub>n</sub>-，其中n为整数1-10或者在任意位置存在酰胺键基团的烷基链-(CH<sub>2</sub>)<sub>n</sub>-，烷基链总碳数n为整数1-10；P为吩噻嗪(PTZ)或H。本发明将具有可逆氧化还原活性的电子供体吩噻嗪(PTZ)引入到联吡啶钌/锇ECL标记物结构中，对联吡啶钌/锇配体结构进行修饰，利用分子内和分子间的协同作用，降低胺类共反应物的用量，减少背景干扰，使ECL得到大大增强。
文档编号G01N21/76GK101531683SQ200910011139
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者刘凤玉, 孙世国, 彭孝军, 洋 杨, 樊江莉 申请人:大连理工大学