专利名称：一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法
技术领域：
一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法，涉及氯霉素检 测技术领域。
背景技术：
氯霉素(Chloramphenicol,简称CAP)是第一个全化学人工合成的抗生素， 由于其价廉及优良的抗菌性、稳定的药性，曾在一段时间内作为饲料添加剂和细 菌性疾病的治疗用药，使用范围较广。氯霉素是一种广谱抗生素，大剂量反复 使用会造成CAP在牛奶及奶制品等中残留。氯霉素对胃、肠、肝脏等有一定的 蓄积损害作用，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎，并易引起人体血中毒，导 致不可逆的再生障碍性贫血。因此各国对食品中氯霉素残留量都制定了严格的 限制标准。氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重 视。欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为"零容许量"，即不得 检出。我国政府规定禁止在渔牧养殖中使用氯霉素，并加强了对动物源性食品中 氯霉素残留的检测力度。目前我国采用的氯霉素药物残留的检测方法有微生物 法、毛细管区域电泳法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法 等，但是上述分析方法都有如下缺点 一连串物理或化学操作会破坏样品；样 品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐。气质联用或者液质联用是氯 霉素的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理和还原过程， 导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查的要求，而使其广泛 使用受到限制。免疫分析技术具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯 度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的检测。酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，简称为ELISA)和胶体金免疫层析法 (Colloidal Gold Irnmuno-Chromatography Assay,简称为GICA)由于其廉价、特异、 灵敏和快速等特点，被广泛地使用于兽药残留的快速筛查中。但ELISA试剂需 要专用的实验室和专业人员进行检验，操作复杂，时间较长；胶体金类试剂操 作简便、快速、适于现场检测，但灵敏度稍低，结果用肉眼直接观察，会产生 误差，亦不能记录。
纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒，外面包覆着聚乙烯类高分 子物质，并可带有羧基或氨基，用于和蛋白质分子交联。免疫磁珠在细胞和大 分子分离、纯化及诊断上都已得到应用。
纳米免疫磁珠检测试纸基本原理如下采用竞争法，即样品中的氯霉素CAP
4和固定在包被膜上的包被抗原CAP-OVA竞争磁珠标记的氯霉素多克隆抗体。
利用免疫磁珠标记一种抗体，在试纸的NC膜上包被相应的包被抗原和羊抗 兔二抗。当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细管 作用从下往上泳动，溶解磁标垫上干燥的磁标抗体，若待测样品中不存在待测 药物，则磁标抗体会直接泳动到检测线(T线)和硝酸纤维膜上的包被原 CAP-OVA发生免疫反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黑色的线条，然后其 它未结合的磁标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线(C线)上的羊抗 兔二抗发生第二次免疫反应，同样形成黑色线条，这样包被膜上就会有两条黑 色线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测药品，则磁标抗体首先会和 样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的磁标抗体有剩余时，才会在检 测线上与CAP-OVA发生免疫反应，形成黑色线条，其颜色强度弱于阴性时的线 条强度；而当磁标抗体全部和样品中的待测药品氯霉素CAP发生免疫结合时， 就不会再有抗体与检测线包被原结合，从而检测线就不会有黑色线条出现。控 制线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否 存在待测药物氯霉素CAP,控制线都应该显现。如果控制线不显色，则说明试 纸条失效。最后通过测定检测线上捕获磁珠的含量实现结果的判定。和胶体金 试纸类相比，免疫磁珠检测试纸最大的不同在于将标记胶体金改为标记磁珠， 检测结果时用Magnetic Assay Reader对检测线上的磁珠含量进行检测并把磁信 号转变为电信号，而不是依靠肉眼去总判定，这样可使得结果判定更为精确、 灵敏、客观和便于记录保存。利用纳米免疫磁珠研制氯霉素抗体检测快速诊断 试纸尚无报道。
发明内容
本发明的目的针对现有检测氯霉素CAP的技术的不足和缺陷，提供一种 基于纳米磁免疫技术的、灵敏度高、反应时间短、仪器设备便宜的可快速检测 氯霉素的检测方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测动物中氯霉素的兽药 残留。
本发明的技术方案 一种氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条，由衬板和在衬 板上依次衔接的样品垫、磁标结合垫、包被膜、吸水垫组成，磁标结合垫为吸 附氯霉素磁标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用氯霉素偶联的载体蛋白溶液
印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C 线；
所述的衬板为不吸水的硬质塑胶条或硬纸条；样品垫为玻璃纤维棉、尼龙 膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、或羧 化纤维素膜；吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；
所述的氯霉素磁标抗体为磁珠标记的氯霉素的多克隆抗体；所述的磁珠为表面修饰有羧基的Fe304磁珠；
所述的偶联氯霉素的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA。 所述氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条的制备方法
1) 氯霉素全抗原的合成及鉴定:在DMF溶液中采用混合酸酐法分别将BSA， OVA与氯霉素CAP进行偶联，得到氯霉素的全抗原CAP-BSA以及CAP-OVA， 并利用紫外扫描仪进行鉴定；
2) 多克隆抗体的制备与纯化以CAP-BSA作为免疫原，免疫新西兰兔， 按常规方法制备CAP多克隆抗体并以硫酸铵纯化；
3) 免疫磁珠的制备将CAP抗体与带羧基的纳米磁珠偶联，制备含CAP 抗体的免疫磁珠，即氯霉素磁标抗体；以玻璃纤维棉吸附氯霉素磁标抗体制备 磁标结合垫；
4) 包埋CAP-OVA及羊抗兔IgG至包被膜用喷膜仪分别将选定浓度的包 被原CAP-OVA喷载于包被膜的T线，以及羊抗兔IgG喷载于包被膜的C线上， 37°C烘箱干燥10min备用；
5) 检测试纸条的制作将样品垫、磁标CAP抗体的结合垫、包埋包被原 CAP-OVA和羊抗兔IgG的包被膜、吸水垫依次衔接在衬板上，组成氯霉素免疫 磁珠层析检测试纸条；
6) 样品检测将检测试纸条样品垫插入待测样品溶液，样品将通过层析作 用从试纸条上流过，10-20秒后取出试纸条，再于室温下反应15分钟后，将测 试板放入Enviso System的Magnetic Assay Reader进行检测，此检测仪将已经 转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号方式输出；绘制标准曲线后， 依据标准曲线求出待测样品的含量。
所述的免疫磁珠的制备将CAP多克隆抗体与纳米磁珠偶联，制备含CAP 抗体的免疫磁珠吸取适量磁珠至小试管中，离心使磁珠与贮存液分离，去除 贮存液并加入乙磺酸MES清洗缓冲液涡旋和超声清洗并离心，重复几次，最后 重悬磁珠，将一定体积的新鲜配置的水溶性碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚 胺NHS加入磁珠悬液中活化羧基，使磁珠表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为 1:4:3，涡旋混合后于室温低速搅拌孵育反应2小时，分别用MES清洗缓冲 液及硼酸清洗缓冲液清洗磁珠，随后将CAP抗体缓慢滴加入磁珠悬液中低速搅 拌孵育反应过夜，再逐滴加入质量浓度5y。BSA，使BSA的终浓度为1%，持续 搅拌5min，以饱和游离的磁珠；低速离心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸 清洗缓冲液清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃掉硼酸清洗 缓冲液，并用偶联缓冲液重悬浮，放4°C冰箱存放；用时则用定量加样装置将 已经标记有CAP抗体的磁珠加入磁标结合垫，并放入37°C烘箱干燥10min备 用组成检测试纸条。本发明的有益效果本发明是基于一种纳米磁免疫技术进行氯霉素的检测 方法、它具有灵敏度高、反应时间短、仪器设备便宜、方便易用等特点。
图1、磁珠的电镜图。
图2、免疫磁珠试剂条结构示意图。
图3、阳性样品的磁信号检测示意图。最高的尖峰代表检测信号，第二高的 尖峰代表空白对照信号。
图4、氯霉素5 200ppb时磁信号强度的标准曲线图。
具体实施例方式
要制成氯霉素的免疫磁珠检测试纸条，首先需要制备偶联氯霉素载体蛋白，
用于制备相应的检测线(T线)和抗体；而且需要制备氯霉素磁标抗原，用于制 备相应的磁标抗原纤维棉；另外需要制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线(C 线)。
1) 氯霉素的全抗原的合成及鉴定先将氯霉素溶解在N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)溶液中，采用混合酸酐法合成抗原，并使用牛血清白蛋白BSA作为免
疫抗原偶联载体，卵清蛋白OVA作为包被抗原偶联载体，分别得到氯霉素的全 抗原CAP-BSA和CAP-OVA，并利用紫外扫描仪进行鉴定；
2) 多克隆抗体的制备与纯化以CAP-BSA作为免疫原，采用新西兰大白 兔作为被免疫的动物，首次免疫时将免疫源与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳 化剂，在大白兔背部皮下多点注射，免疫剂量为lmg/只，间隔2-4周后，用相 同剂量免疫源加等量弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂，加强免疫，免疫期间监 测抗体效价及特异性，最后一次免疫不加佐剂。最后一次免疫7天后心脏放血， 经硫酸按分级沉淀得纯化的CAP多克隆抗体。并以硫酸铵沉淀法纯化抗体；得 到兔抗CAP-BSA的IgG。
3) 免疫磁珠的制备将CAP多克隆抗体与纳米磁珠偶联，制备含CAP抗体 的免疫磁珠；具体方法是吸取适量磁珠至小试管中，离心使磁珠与贮存液分 离，去除贮存液并加入乙磺酸(MES)清洗缓冲液涡旋和超声清洗并离心，重 复几次，最后重悬磁珠，将一定体积的新鲜配置的水溶性碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS )加入磁珠溶液中活化羧基，使磁珠表面羧基与EDC和NHS 的摩尔比为1:4:3,涡旋混合后于室温震荡孵育反应2小时，分别用MES清洗 缓冲液及硼酸清洗缓冲液清洗磁珠，随后将CAP抗体缓慢滴加入至磁珠悬液中 低速搅拌孵育反应过夜，再逐滴加入5n/。BSA，使BSA的终浓度为1。/。，持续搅拌 5min，以饱和游离的磁珠。低速离心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸清洗 缓冲液清洗磁珠，即高速离心，保留底部可流动的暗黑色沉淀而去除含有未结 合的蛋白质的上清液，重复几次，最好将磁珠转移至新管，弃掉硼酸清洗缓冲
7液，并用偶联缓冲液重悬浮，放4°0冰箱存放。用时则用定量加样装置将已经标 记有CAP抗体的磁珠加入磁标结合垫，并放入37T烘箱干燥10min备用以组成检 测试纸条。
4) 包被CAP-OVA抗原和羊抗兔二抗至硝酸纤维素膜(NC膜)用喷膜仪将 一定浓度的CAP-OVA和羊抗兔二抗分别喷载于硝酸纤维素膜(NC膜)的检测线
(T线)和控制线(C线)上，37。C烘箱干燥10min备用。
5) 检测试纸条的制作分别将磁标CAP多克隆抗体的偶联垫、包埋抗原和 二抗的硝酸纤维素膜(NC膜)、样品垫、吸水垫、覆盖膜、测试板外卡组成检测 试纸条(与金标试纸条相似)。
6) 样品检测将氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条的样品端插入待测样品液 中，插入深度不超过标记线，样品将通过毛细管层析作用从试纸条上流过，10~20 秒后取出试纸条，在室温下反应15分钟以后，将测试板放入EiwisoTM System的 Magnetic Assay Reader进行检测，并且此检测仪器可以将己经转化成磁场信号的 生物学反应信号进一步以电信号的方式输出；绘制标准曲线后，依据标准曲线 求出待测样品内氯霉素含量的具体值。得到该方法的检测限为6ppb左右。
实施例l:
水产品中氯霉素CAP的检测称取5g经粉碎后的样品至50mL离心管中，加 入15mL的80。/。乙腈水溶液涡旋振荡然后再超声提取，最后加入lg氯化钠溶解， 并用3000rpm离心10min，提取上层有机相清液，然后用氮气吹干。最后再用缓 冲液溶解吹干后的残留物，得到待测样品溶液。最终用氯霉素免疫磁珠层析检 测试纸条检测样品液，插入深度不超过标记线，样品将通过毛细管层析作用从 试纸条上流过，10 20秒后取出试纸条，在室温下反应15分钟以后，将检测试纸 条放入EnvisoTM System的Magnetic Assay Reader进行检测磁场信号。根据事先用 氯霉素标准品测出的标准曲线求出待测水产品样品内氯霉素的含量为9ppb。
权利要求
1、一种氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条，其特征是由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、磁标结合垫、包被膜、吸水垫组成，磁标结合垫为吸附氯霉素磁标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用氯霉素偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线；所述的衬板为不吸水的硬质塑胶条或硬纸条；样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、或羧化纤维素膜；吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述的氯霉素磁标抗体为磁珠标记的氯霉素的多克隆抗体；所述的磁珠为表面修饰有羧基的Fe3O4磁珠；所述的偶联氯霉素的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA。
2、 权利要求1所述氯霉素免疫磁珠层析检测试纸条的制备方法，其特征是1) 氯霉素全抗原的合成及鉴定:在DMF溶液中采用混合酸酐法分别将BSA, OVA与氯霉素CAP进行偶联，得到氯霉素的全抗原CAP-BSA以及CAP-OVA， 并利用紫外扫描仪进行鉴定；2) 多克隆抗体的制备与纯化以CAP-BSA作为免疫原，免疫新西兰兔， 按常规方法制备CAP多克隆抗体并以硫酸铵纯化；3) 免疫磁珠的制备将CAP抗体与带羧基的纳米磁珠偶联，制备含CAP 抗体的免疫磁珠，即氯霉素磁标抗体；以玻璃纤维棉吸附氯霉素磁标抗体制备 磁标结合垫；4) 包埋CAP-OVA及羊抗兔IgG至包被膜用喷膜仪分别将选定浓度的包 被原CAP-OVA喷载于包被膜的T线，以及羊抗兔IgG喷载于包被膜的C线上， 37°C烘箱干燥10min备用；5) 检测试纸条的制作将样品垫、磁标CAP抗体的结合垫、包埋包被原 CAP-OVA和羊抗兔IgG的包被膜、吸水垫依次衔接在衬板上，组成氯霉素免疫 磁珠层析检测试纸条；6) 样品检测将检测试纸条样品垫插入待测样品溶液，样品将通过层析作 用从试纸条上流过，10 20秒后取出试纸条，再于室温下反应15分钟后，将测 试板放入Enviso System的Magnetic Assay Reader进行检测，此检测仪将已经 转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号方式输出；绘制标准曲线后， 依据标准曲线求出待测样品的含量。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的免疫磁珠的制备 将CAP多克隆抗体与纳米磁珠偶联，制备含CAP抗体的免疫磁珠吸取适量磁珠 至小试管中，离心使磁珠与贮存液分离，去除贮存液并加入乙磺酸MES清洗缓冲液涡旋和超声清洗并离心，重复几次，最后重悬磁珠，将一定体积的新鲜配置的水溶性碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS加入磁珠悬液中活化羧 基，使磁珠表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1:4:3，涡旋混合后于室温低 速搅拌孵育反应2小时，分别用MES清洗缓冲液及硼酸清洗缓冲液清洗磁珠，随 后将CAP抗体缓慢滴加入磁珠悬液中低速搅拌孵育反应过夜，再逐滴加入质量 浓度5。/。BSA，使BSA的终浓度为P/。，持续搅拌5min，以饱和游离的磁珠；低 速离心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸清洗缓冲液清洗磁珠去除未结合的 蛋白质，将磁珠转移至新管，弃掉硼酸清洗缓冲液，并用偶联缓冲液重悬浮， 放4。C冰箱存放；用时则用定量加样装置将已经标记有CAP抗体的磁珠加入磁标 结合垫，并放入37CC烘箱干燥10min备用组成检测试纸条。
全文摘要
一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法，涉及氯霉素检测技术领域。该试纸条由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、磁标结合垫、包被膜、吸水垫组成，磁标结合垫为吸附氯霉素磁标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用氯霉素偶联的载体蛋白溶液印制的隐形检测线T线、用羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照线C线。将试纸条样品垫插入待测样品溶液，10～20秒后取出，于室温下反应15分钟，将试纸条放入磁信号检测仪检测，此检测仪将已转化成磁场信号的生物学反应信号进一步以电信号输出；绘制标准曲线后，依据标准曲线求出待测样品中氯霉素含量。本发明是基于纳米磁免疫技术进行氯霉素的检测方法、具有灵敏度高、反应时间短、仪器设备便宜、方便易用等特点。
文档编号G01N33/552GK101551391SQ200910027458
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者刘丽强, 李灼坤, 胥传来, 伟 马 申请人:江南大学