专利名称：单胺氧化酶诊断试剂(盒)及单胺氧化酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定单胺氧
化酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
现有技术中，测定单胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有荧光法、免疫抑制法和化 学分光光度法。荧光法是以e-苯乙胺作为底物来检测单胺氧化酶，其依据是e-苯乙胺 在10 100mg时反应速度最大，高于苄胺和5-羟色胺的反应速度。免疫学方法则利用单 胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，测定反应后形成的单胺氧化酶同工酶，目前应用较 多的单克隆抗体有MA0-A3C9、MA0-A4F10、MA0-A7B10、MA0-A7E10和MA0-B1C2等。
相对而言，化学分光光度法应有更为普遍。可以用单胺氧化酶催化胺类释放 出的过氧化氢(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪 (MCDP)等发色剂进行测定，也可以应用苄胺(Benzylamine)、对苯甲胺-l3-偶氮萘酚、 丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪 胺(tyr咖ine，又称"3-对羟基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine)等作为反应底物来测定单胺氧化酶的活性。其中，应用苯甲胺类型 底物测得的单胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物测 得的活性约为3-对羟基苯乙胺作底物的30%。目前，单胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲 胺-e-偶氮萘酚作为底物。苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用下生成苄醛，然后在 强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生成醛苯腙，这在生化仪上测定较困难；对苯 甲胺-P _偶氮萘酚方法则需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不能应用全自动 生化仪分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出 一 种利用间接酶循环扩增法 (IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method) 及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm波长处吸光度的变化，得以测定单胺氧化酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出 用以实现该方法的单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光 分析仪或半、全自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度 高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明单胺氧化酶活性浓度测定方法如下 胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨+过氧化氢
氨+2水+6氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶
亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白
亚硝酸+3还原型辅酶亚硝酸还原酶氢氧化铵+3辅酶+水这种方法应用单胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1. 4. 3. 4 ;EC 1. 4. 3. 6)酶
(偶)联铁氧还蛋白亚硝酸还原酶(ferredoxin-nitrite reductase ;EC 1. 7. 7. 1)、亚硝酸 还原酶(nitrite reductase ;EC 1. 7. 1. 4)酶促反应连续监测法。单胺氧化酶及铁氧还蛋 白亚硝酸还原酶作为作用酶，功能为将胺类化合物酶解产生亚硝酸。亚硝酸还原酶作为循 环酶将亚硝酸再次变回氨(氢氧化铵)，使氨不断地被重复循环利用。亚硝酸还原酶作为 显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸 收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度 下降的速度，可以测算单胺氧化酶的活性浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单
剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明单胺氧化酶诊断/测定试剂较为理想 缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 还原型辅酶 0. 25mmol/L 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 10000U/L 亚硝酸还原酶 10000U/L 胺类化合物 3mmol/L 氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L 本发明测定单胺氧化酶活性的诊断试剂盒的成分当中，所述"胺类化合物"优选以
下物质之一 苄胺、对苯甲胺_ P _偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、P _苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺
或者这七种物质的衍生物，但选择范围不受这些列举所限制。 本发明的单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、胺类化合
物、氧化型铁氧还蛋白。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、氧化型铁氧还蛋白。
试剂2 缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶。 还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、胺类化合物、氧化型铁氧 还蛋白在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、氧化型铁氧还蛋白。
试剂2 缓冲液、稳定齐U、亚硝酸还原酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶。 还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、胺类化合物、氧化型铁氧 还蛋白在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定单胺氧化酶活性浓度的方法，其还原型辅 酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一 本实施例的单胺氧化酶诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
还原型辅酶 0. 25mmol/L 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 10000U/L
亚硝酸还原酶 10000U/L
胺类化合物 3mmol/L
氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K 值-4180。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。实施例二本实施例的单胺氧化酶诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100,1/L稳定剂50mmol/L还原型辅酶0. 25,1/L胺类化合物3mmol/L氧化型铁氧还蛋白5mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100,1/L稳定剂500,1/L铁氧还蛋白亚硝酸还原酶10000U/L
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亚硝酸还原酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，
测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为
2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，
理论K值-2170。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。
实施例三 本实施例的单胺氧化酶诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0. 25mmol/L 胺类化合物 3mmol/L
氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L
试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
亚硝酸还原酶 10000U/L
试剂3 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定单胺氧化酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间
10分钟，起始吸光度1. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品
与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时
间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-2170。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。
申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0. 0001 ;吸光度时间反应曲线应呈直 线下降；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达400U/L ;试剂测试的不准确度，其相对偏 差不超过±3% ;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2% ;试剂的灵敏度可 达0. OOIO士O. 0005 AA/min/U/L ;试剂在2-8。C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵 敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
一种利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶活性浓度测定方法，其方法如下胺类化合物+水+氧 单胺氧化酶 相应醛类产物+氨+过氧化氢氨+2水+6氧化型铁氧还蛋白 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白亚硝酸+3还原型辅酶 亚硝酸还原酶 氢氧化铵+3辅酶+水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出单胺氧化酶的活性浓度大小结果。
2. —种单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括本发明测定单胺氧化酶活性的诊断试剂盒的成分当中，所述"胺类化合物"优选以下物 质之一苄胺、对苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者 这七种物质的衍生物，但选择范围不受这些列举所限制。试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会 反应作用。其特征在于试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、胺类化合物、氧化型铁氧还蛋白组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、胺类化合物、氧化型铁氧还蛋白组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、 氧化型铁氧还蛋白组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原 酶组成。还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、胺类化合物、氧化型铁氧还 蛋白在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、胺类化合物、氧化型铁氧还蛋白组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、 氧化型铁氧还蛋白组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、亚硝酸还原酶组成；试剂3，由缓冲液、 稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶组成。还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还 原酶、胺类化合物、氧化型铁氧还蛋白在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，其特征在于还包括稳定剂亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白缓冲液 稳定剂 还原型辅酶铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 亚硝酸还原酶 胺类化合物 氧化型铁氧还蛋白l-4000mmol/L或0. 1 % _100%体积比。所述稳定剂为甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、胺类化合物、氧化型铁氧还蛋白、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。
文档编号G01N35/00GK101793719SQ20091002823
公开日2010年8月4日 申请日期2009年2月4日 优先权日2009年2月4日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司