游离三碘甲腺原氨酸检测微粒、其制备及应用的制作方法

专利名称：游离三碘甲腺原氨酸检测微粒、其制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及游离三碘甲腺原氨酸的诊断试剂，具体涉及基于光激化学发光原理的 游离三碘甲腺原氨酸检测微粒、其制备及应用。
背景技术：
甲状腺疾病是一组较常见的内分泌疾病，包括缺碘性甲状腺肿、其他原因引起的 甲状腺肿、甲亢、甲状腺瘤、甲状腺炎、甲状腺功能减退等。甲状腺病的发生率比较高。甲亢也就是甲状腺功能亢进症，它是一种临床上十分常见的内分泌疾病。是指由 各种原因导致甲状腺功能增强，甲状腺激素分泌过多或因甲腺原氨酸(T3、T4)在血液中水 平增高所导致的机体神经系统、循环系统、消化系统心血管系统等多系统的一系列高代谢 症候群以及高兴奋症状和眼部症状。甲状腺机能减退症系甲状腺激素TSH合成与分泌不足，或甲状腺激素生理效应不 好、生物效应不足而致的全身性疾病。临床上可分为呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能 减退始于胎儿或新生儿期，称为克汀病；始于性发育前儿童称幼年型甲减；始于成人称成 年型甲减。甲状腺瘤是临床常见病，其中绝大多数为良性病变，少数为癌、肉瘤、恶性淋巴瘤 等。该病女性发病率明显高于男性，男女发病比例约1 2 3。甲状腺炎是以炎症为主要表现的甲状腺疾病，包括感染性和非感染性。不少见临 床权威上所说的急性、亚急性以及慢性甲状腺炎，只表明青年疾病过程的长短，它们之间无 内在联系，也不互相转变，每种具有发表不同的病因、有着临床特点、病理过程及固有的结局。三碘甲腺原氨酸(T3)是从甲状腺分泌出来的激素，与甲状腺素共同在甲状腺球 蛋白分子中合成。血液中的T3绝大部分与TBG结合，约0. 4%的游离T3作用于靶细胞，维 持正常的生理功能。测定血清中游离三碘原氨酸(FT3)的水平可用于甲状腺疾病的辅助诊 断及相关病人治疗效果的监测。免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利 用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质， 激素等微量生物活性物质。我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代，现仍普遍使 用于县级以上医院)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用)；以化 学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用，产品步入成 长期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性 的需求的不断提高而决定的。化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内 发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助 其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直 接标记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗 时长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott， Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免 疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP，金钢脘 为基质采用酶促化学发光。Roche则采用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)， 发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三 丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光 子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常 保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当昂贵。此 外，发光基质的稳定性也是一大问题。光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因 反应在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背 景值，减少反应时间，并可实现自动化操作。

发明内容
本发明的目的是提供一种可用于定量检测血清中游离三碘甲腺原氨酸的检测微 粒，其制备、检测条件及应用。本发明的技术原理本发明的游离三碘甲腺原氨酸检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关， 光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术 主要整合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。本发明之所以能检测血清中的游离三碘甲腺原氨酸的水平，是由于在均相条件 下，将内部带有染料的感光微粒(纳米级)以及包被有二碘甲腺氨酸(T2)并且内部带有 发光化合物的发光微粒(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。T2的分子式为 C15H13I2N04，结构如下所示， 1分子T2可以和1分子T1 ( 一碘酪氨酸)缩合形成T3，两分子T2可缩合形成TI T3分子式为C15H12I3N04，结构如下所示 T3与T2的结构非常相似，因此T2能够和识别T3的抗体发生微弱的结合。当血清 中存在FT3时，这一结合即被破坏，被FT3和T3抗体的结合所取代。此时纳米感光微粒和包被有表面抗体的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉游离三 碘甲腺原氨酸(FT3)，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微 粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离 子被近距离的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数 微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光 子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的 浓度。而当样本不含游离三碘甲腺原氨酸(FT3)时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活 性氧离子也无法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级 红光产生。具体原理参见图1及图2。基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测游离三碘甲腺原氨酸(FT3) 的检测微粒，为二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒。本发明第二方面提供了一种游离三碘甲腺原氨酸(FT3)的检测试剂盒，包括上述 二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒。试剂盒中，还可包括生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸 抗体(T3Ab)和亲和素包被的感光微粒。在试剂盒中，上述二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒、生物素标记的抗三碘甲腺 原氨酸抗体(T3Ab)和亲和素包被的感光微粒分别独立包装，且均为混悬液。上述含有二碘 甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体(T3Ab)或亲和素包 被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体 系、Tris缓冲体系。二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒的溶剂优选pH8. 0的成分为HEPES、 NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES缓冲液，生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体(T3Ab)的溶 剂优选PH8. 0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris缓冲液，亲和素包被的感光微 粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA_Na_2H20的HEPES缓冲液，上述各种溶剂中还可添加起 封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂 防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选100U/ml庆大霉素和质量 百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。在用于定量检测游离三碘甲腺原氨酸(FT3)时，上述试剂盒中还可包括含有多种 已知三碘甲腺原氨酸浓度的溶液。上述不同三碘甲腺原氨酸浓度的溶液分别独立包装。上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合 物可以是Dioxene (二氧杂环己烯)或thioxene (二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合 物可以是Eu (TTA) 3/TOPO或Eu (TTA) 3/Phen等，该微粒可由市场上购得。
研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径(微粒的平均直径) 太大(>400nm)会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小(< lOOnm)，会使制备过程中 的清洗工作比较困难，对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在100-400nm之 间，较好为150-300nm之间，优选250nm。发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基 和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不 相同。鉴于获得更好的二碘甲腺氨酸(T2)的连接效率，试剂稳定性和连接重复性，经试 验优选醛基表面官能团的微粒，并应用了 NaBH3CN的还原胺化反应作为抗体的连接方法。发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光量 一般会在150，000——350，000光子数/100 u g发光微粒范围内，优选中等强度偏上的水平 (彡250，000光子数/lOOug)发光微粒。上述二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒中，发光微粒与二碘甲腺氨酸(T2)的质 量比例较佳为10 (0.01-0. 05)，优选10 0.02。上述生物素标记的抗体(T3Ab)中，生物素与抗体的分子比例较佳为(10-50) 1， 优选30 1。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激发下，可以 产生单线态氧离子，当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与 发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生 520-620nm波长光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。上述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例无特殊限制，较佳 为 1 (3-10)，优选 1 5。市售感光微粒均适用于本发明，微粒粒径较佳为180-260nm，优选220nm。二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒采用NaBH3CN的还原胺化反应法制备，反应步 骤如下1)混合将发光微粒与二碘甲腺氨酸混合于缓冲液中；2)反应加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应；3)往步骤2)获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混勻并反应；4)清洗产物，获得二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。其中，混合步骤中，发光微粒与二碘甲腺氨酸(T2)的质量比例为10 (0. 1-0. 4)， 优选10 0.2。反应缓冲液可为MES缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲液，浓度优选0.05M， 反应步骤中，反应溶液中发光微粒的浓度可为10-40mg/ml，优选20mg/ml。改进的，二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒可采用下述方法制得1)混合将发光微粒与二碘甲腺氨酸(T2)混合于缓冲液中。较佳的，缓冲液为MES 缓冲液，发光微粒与二碘甲腺氨酸(T2)的质量比例为10 0.01 0.05，优选10 0.02。2)反应加入缓冲液配制的EDAC(1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐 酸盐)溶液混合并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，混合溶液中，发光微粒与EDAC优选 的质量比为25 1混合。反应条件为37°C旋转反应。一般约48小时反应充分。3)往步骤2获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混勻并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液；BSA溶液与步骤2获得的反应液体积比较佳为5 8。反应条件为37°C 旋转反应。一般约16小时反应充分。4)清洗产物，获得二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步骤采用反应缓冲液透析，每次4-5小时，更换缓冲液4次。透析清 洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此 反复3-5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很 容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。上述改进的制备方法与NaBH3CN的还原胺化反应法的主要差别在于主要反应试剂 NaBH3CN替换成了 EDAC，该试剂的替换，不仅使得反应时间与NaBH3CN的还原胺化反应法相 比缩短了 10个多小时，而且发光微粒与二碘甲腺氨酸的交联效率获得了提高，节省了二碘 甲腺氨酸用量，此外，试验表明，该方法制得的检测微粒与NaBH3CN的还原胺化反应法制得 的检测微粒相比，在相同条件下反应信号更强，灵敏度更高，检测范围也更广。亲和索包被的感光微粒可采用NaBH3CN的还原胺化反应法制备。本发明第三方面，公开了上述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，游 离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒利用光激化学发光原理，采用双抗体夹心法，可定量检测 血清中的游离三碘甲腺原氨酸。游离三碘甲腺原氨酸(FT3)的检测试剂盒的使用方法包括下列步骤将样品与试剂盒中用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒、生物素标记的抗三 碘甲腺原氨酸抗体(T3Ab)和亲和素包被的感光微粒混合反应，而后用激发光照射反应孔， 测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。具体包括下列步骤1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒和生 物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体(T3Ab)，获得初始反应溶液，混合反应；2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。上述激发光光源波长范围为600-700nm，优选640-680nm ；反应孔发光的发射光光 源波长范围为600-680nm，优选610_620nm ；发射光延迟时间范围为lOOms-lOOOms ；激发光 光源的功率范围为5-lOOmw，优选40-60w。上述游离三碘甲腺原氨酸(FT3)的检测试剂盒在应用在定量检测游离三碘甲腺 原氨酸(FT3)时，需根据标准曲线计算待测样品中FT3含量。上述步骤1)的反应条件为37°C温育10-30分钟，优选20分钟，步骤2的反应条件 也为37°C温育10-30分钟，优选15分钟。上述初始反应溶液中，二碘甲腺氨酸(T2)包被的发光微粒的浓度无特殊限制，可 以为 25-200 u g/ml，优选 50 u g/ml。初始反应溶液中，生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体的浓度无特殊限制，可以 为 0. 05-0. 2 u g/ml，较佳为 0. 05 u g/ml。在最终反应溶液中，亲和素包被的感光微粒的浓度一般控制在10-100 ii g/ml，可以为 30-60 u g/m，优选 40 u g/ml。上述方法中，初始反应溶液的体积无特殊限制，可以为30-75iU，优选75iU ；最 终反应溶液的体积也无特殊限制，可以为100-250 iU，优选250 ill。上述样品包括血清、血浆、全血或定标品。当本发明的检测微粒及检测试剂盒用于定量检测游离三碘甲腺原氨酸(FT3)时， 还需根据标准曲线计算待测样品中游离三碘甲腺原氨酸的含量。本发明是采用光激化学发光检测技术，配合光激化学发光分析系统测定人血清样 品中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)的定量体外诊断试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合 用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。本发明的游离三碘甲腺原氨酸 (FT3)光激化学发光检测试剂盒灵敏度高、精密性好、检测范围宽、而且操作简便、快速、成 本低、稳定性好、无环境污染和放射危害，在临床上具有广泛的应用前景。


图1 光激化学发光免疫技术原理图微粒结合形成二聚体，产生光子信号图2 光激化学发光免疫技术原理图未结合微粒，无光子信号产生图3 单线态氧随微粒间距离衰减，在大概600nm的距离，基本没有单线氧的存在， 因此也不发光FG BEAD 发光微粒，内含发光分子；GG BEAD 感光微粒，内含感光分子；Singlet Oxygen 单线态氧,活性氧离子；A/B 两者可直接或间接特异结合的活性分子。如在双抗夹心检测中，A，B为针对 靶分子C不同的表位的单克隆抗体。图4 比较试验测试结果示意图
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而 非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均 为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆试验手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实验中仪器原料来源及试剂配方
原料及试剂厂家
Biotin-X-X-NHSSigmaTLC 彡 95%
BSAEqui tech/protease free
T2Sigma
GlySigma彡95%
HEPES华美
TrisSigma
NaBH3CNAcros
AvidinPierce
抗-FT3单克隆抗体
感光微粒 发光微粒
仪器型号
光激化学发光分析仪 HT 紫外分光光度计 752P 高速冷冻离心机 CR21G 分析天平 分析天平 PHif 粒径仪 酶标仪
超声波清洗器漩涡混合器磁力搅拌器
ALC-2100. 2 AG285 DELTA320 Model 370 MultiSKAN MK3 KQ5200E QL-901
(79-1)2003-03
Bioventix 美国PentaTek公司 美国PentaTek公司 厂家
上海博阳医疗仪器公司 上海光谱公司 HITACHI ACCULAB METTLER METTLER Nicomp labsystem 昆山超声仪器公司 其林贝尔 国华实施例1T2包被的发光微粒的制备抗体与发光微粒制备方法1)发光微粒混悬液处理吸取一定量的羧基发光微粒于高速冷冻离心机中离心， 弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节发光微 粒浓度至100mg/ml。2)抗体处理T2于0. 05M pH6. 0的MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)透析，透 析完成后测定浓度，并调节浓度至2mg/ml。3) MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(MES缓冲液)和2mg/ml的T2 (MES缓 冲液)以1 10 1的体积比进行混合，混勻，得到反应液。4)用MES缓冲液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照与发光微粒100mg/100uL EDAC 的比加入，迅速混勻，37°C旋转反应48小时。5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5 8，迅速混 匀，37。C旋转反应16小时。6)用MES缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固 含量，调节浓度至10mg/ml。将上述方法与采用NaBH3CN的还原胺化反应法制得的检测微粒进行比较。NaBH3CN还原胺化反应法的制备方法1)发光微粒混悬液处理发光微粒12. 5mg,加MES缓冲液至2. 5g，离心半小时；弃 上清，向沉淀加入0.2ml MES缓冲液，超声15次；重复两次。取样测定粒径，待用。2) T2的处理及混合T2用0. 2N NaOH配制成lmg/ml的溶液。按照10mg发光微 粒0. 2mgT2加入T2溶液，补加0. 05M MES缓冲液至发光微粒固含量为25mg/ml，振荡混勻 得到反应液。3)反应NaB H3CN用0. 05M MES缓冲液配制成25mg/ml的溶液。按照3 250的 体积比将配制的NaBH3CN溶液立即加入到反应液中，37°C振荡反应68-70小时。
4)封闭甘氨酸Gly，用0. 05M MES缓冲液配制成75mg/ml的甘氨酸溶液；称取 NaBH3CN，用0. 05M MES缓冲液配制成25mg/ml的溶液；将二溶液加入反应液中，其中反应 液Gly溶液NaBH3CN溶液得体积比为10 2 1 ;37°C振荡反应2小时。再加入200mg/ ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5 8，37V旋转反应16小时。5)清洗将反应液用MES缓冲液平衡约2. 5g，离心半小时；弃上清，向沉淀加入 0. 2ml MES缓冲液，超声15次；重复四次。6)将清洗完毕的溶液吸出转移至干净容器中，取样测定固含量和粒径。用pH8. 00 发光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。两者制备结果的比较1.节省了制备时间 2.提高了抗体交联效率，节省了抗体用量 3.增强了反应信号
体反应4.提高了灵敏度 5.扩大了检测范围 参照上述的制备方法制备T2包被的发光微粒，并通过各项性能测试比较从以下 几方面进行了具体工艺条件的选择研究。本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下1.光信号检测方法在反应孔中分别加入25 u 1样品，再依次加入25 u 1发光试剂(50ug/ml)和25 yl 生物素化抗体试剂(0. 05ug/ml)。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动 按以下步骤操作振动，37°C温育20分钟，再自动加入175 yl亲和素包被的感光微粒试剂 (40ug/ml)后37°C温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。检测FT3浓度分别为1. 61pg/ml和7. 82pg/ml的质控品光信号，每个浓度做10孔 重复测定，代入公式，计算CV值。低浓度的精密性测定表示为QC L，高浓度的精密性测定表 示为QC H。2.灵敏度检测方法检测10孔标准品Opg/ml，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE-2SD 反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，不高于lpg/ml。3.工艺条件选择1)防腐剂的考察出于对试剂防腐以及长期储存的考虑，我们选择万分之五Proclin 300作为防腐 剂进行考察。检测未添加防腐剂及添加万分之五Proclin 300作为防腐剂的FT3测定值 (0. lpg/ml的血清(极低值血清)、正常人血清、FT3测定值彡3pg/ml的血清、PBS缓冲液。 每种条件检测两孔，取RLU检测均值。结果见下表 根据以上结果可以发现以万分之五Proclin 300作为防腐剂对试验结果没有明 显影响，故选用万分之五Proclin 300作为防腐剂。2)标准品稀释液的选择为了得到长期稳定且较易获取的标准品稀释液来取代不含FT3的血清，使用20份 FT3测定值< lpg/ml的临床血清作为参照来考察备选标准品稀释液，备选标准品稀释液分 别有双蒸水、0. 01M的pH 7. 4的PBS、添加BSA的0. 01M pH 7. 4PBS、新生牛血清，20份 FT3测定值< 0. lpg/ml的临床血清每份测单孔，计算该20孔的RLU检测均值；备选标准品 稀释液每种检测两孔，取RLU检测均值。检测结果如下 根据以上结果可以发现添加BSA的0. 01M pH 7. 4PBS的光信号水平与FT3参 照血清相当，因此选用添加BSA的0. 01M pH 7. 4PBS作为标准品稀释液。3)发光微粒与T2的反应比例发光微粒T2分别按 10mg/0. 01mgU0mg/0. 02mgU0mg/0. 05mg 的比例包被，比较
选取最佳的包被反应比例。检测三种不同反应比例制备好的T2包被发光微粒，检测其灵敏度、精密性等。检 测结果如下表发光微粒与T2反应比例的比较 抗体加入量与发光微粒上包被的抗体量基本呈正比关系，但抗体继续增加时包被 上的抗体达到饱和。综合考虑QC结果及成本问题，选择10mg re-bead与0. 02mg T2反应 条件。4)发光试剂缓冲液根据相应的文献资料，并结合本发明的特点，选择pH8. 0的成分为HEPES、NaCl和 EDTA-Na-2H20的HEPES缓冲液，并在其中添加起封闭和蛋白保护作用的BSA以及防止微粒
聚集稳定试剂的Tween20后作为发光试剂的缓冲液。5)清洗方式的选择透析法清洗步骤100倍体积透析，每次4-5小时，更换缓冲液2次。透析清洗操 作时间较长，且清洗不彻底。离心法清洗步骤12000rpm离心30分钟，清洗3次，沉淀以超声法重悬。这种方 法清洗所用时间较短，效果好。综合考虑选用离心法清洗。最终选择250nm的粒径，发光量为彡250，000光子数/lOOug的发光微粒，BSA 的0. 01M pH 7. 4PBS作为稀释液，万分之五Proclin 300作为防腐剂，20mg/ml的发光微粒 反应浓度，10 0. 02的re-bead与T2的比例，离心法清洗作为最优制备条件。 实施例2生物素标记抗体的制备制备方法1)抗体处理用移液枪吸取一定量的抗_FT3(标记)，装入截流分子量14000D 的透析袋中。置于100倍体积的0. 1M NaHC03溶液于层析冷柜2 8°C进行透析，更换 0. lMNaHC03溶液两次，每次透析4 5小时；将透析好的抗-FT3 (标记)吸出转移至干净 离心管中，2 8°C，10000g，离心lOmin ；转移上清至另一干净离心管，取样测定抗体浓度， 并将其浓度调节至lmg/ml。2)标记取处理好的lmg/ml抗-FT3 (标记)与配制好的16. 17mg/ml Biotin(DMSO)溶液，二者按照10000 54的体积比进行混合，迅速混勻。2 8°C静置反应 12 16小时。3)透析将反应好的生物素标记抗体装入截流分子量14000D的透析袋中，置于大 于100倍体积的生物素标记缓冲液于2 8°C进行透析。更换缓冲液2次，每次透析4 5 小时。4)将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度。用生 物素标记缓冲液将生物素标记抗体浓度调节至0. lmg/ml。本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下1、将抗体与Biotin按照不同比例进行反应并进行检测将Biotin-X-X-NHS 抗体按照20 1、30 1、40 1的不同比例进行标记，比较 选取最佳的标记比例。检测三种不同标记比例制备好的生物素标记抗T3，检测其灵敏度、精 密性。检测结果如下表 根据以上实验结果可知，生物素抗T3标记比例为30 1时，其灵敏度较好，成本也较低。故选择30 1的比例作为生物素抗T3的标记比例。实施例3亲和素包被的感光微粒的制备感光微粒采用粒径为220 士40nm的感光微粒(美国PentaTek公司)制备方法a、感光微粒混悬液处理吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去 上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调 节感光微粒浓度至100mg/ml。b、亲和素溶液配制称量一定量Avidin，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。c、混合将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以 2:5: 1的体积比进行混合，迅速混勻，得到反应液。d、反应MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液1 25的体积比 加入，迅速混勻。37°C旋转反应48小时。e、封闭MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与 反应液2 1 10的体积比加入上述溶液中，混勻，37°C旋转反应2小时。再加入200mg/ ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5 8，迅速混勻，37°C旋转反应16小 时。f、清洗向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入 新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液 进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。实施例4定标品的制备定标品使用卫生部临检中心出品的三碘甲腺原氨酸定量参考品，以PBS为稀释 液，按照浓度 Opg/ml，lpg/ml，3pg/ml，6pg/ml，18pg/ml, 50pg/ml 配制 6 个定标品。实施例5游离三碘甲腺原氨酸定量检测首先向反应孔中分别加入样品，再依次加入发光试剂(抗体包被的发光微粒)和 生物素标记抗体。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作 振动，37°C温育。再自动加入亲和素包被的感光微粒后37°C再次温育。温育结束后仪器自 动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。按上述方法检测各个定标品的发光光子量，将测得的光信号值与相应的定标品浓 度采用cubic spline(三次样条)拟和作图即得，标准曲线呈线性。在定量测定中，根据标准曲线，按样本实测光信号值计算每一个样本的FT3含量， 单位是pg/ml。检测条件的优化试验1、温育时间的确定试验材料采用抗体包被的50 U g/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和 0. 05 u g/ml的生物素标记抗体试剂，及40 u g/ml的亲和素包被的感光微粒试剂。检验样本灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。初始反应条件加样量为样品25 iU，发光微粒试剂25 iU，生物素标记抗体试剂 25 iil，亲和素包被的感光微粒试剂为175iU，两步温育。1. 1第一步温育时间的确定
第一步温育时间分别为10min、15min、20min、30min，第二步温育时间为20min对
检验样本进行检测，分别考察灵敏度、特异性、准确性、精密度等指标。结果见下表 对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，第一步温育时间为20min 结果已经趋于稳定，延长第一步温育时间已经没有实际意义，所以我们将第一步温育时间 确定为20min。1. 2第二步温育时间的确定第一步温育时间为20min，第二步温育时间分别为lOmin、15min、20min、30min对
检验样本进行检测，分别考察灵敏度、特异性、准确性、精密度等指标。结果见下表 对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，第二步温育时间为15min 结果已经趋于稳定，延长第二步温育时间已经没有实际意义，所以我们将第二步温育时间 确定为15min。2、加样模式的考察试验材料采用抗体包被的50i!g/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗体试 剂)0. 05 y g/ml的生物素标记抗体试剂，及40 u g/ml的亲和素包被的感光微粒试剂。检验样本灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。初始反应条件依次添加样品、发光微粒试剂、生物素标记抗体试剂、亲和素包被 的感光微粒，两步温育，其中第一温育时间为20min，第二温育时间为15min。设计了三种加样模式进行考察。模式1 10 ill样品+10 U 1发光抗体试剂+10 U 1生物素化抗体试剂+70 U 1亲和素包被的感光微粒试剂；模式2 :15 ill样品+15 u 1发光抗体试剂+15 u 1生物素化抗体试剂+105 u 1亲和 素包被的感光微粒试剂；模式3 :25 ill样品+25 u 1发光抗体试剂+25 u 1生物素化抗体试剂+175 u 1亲和 素包被的感光微粒试剂。按照以上三种加样模式对企业内控品进行检测，分别考察灵敏度、精密度指标。结 果见下表 对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，并考虑到手工加样样品量 过小会造成不便于操作的影响以及更容易产生误差，所以我们选择模式3为我们的加样模 式3、发光抗体和生物素化抗体浓度的筛选试验材料采用抗体包被的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和生物素标记 抗体试剂，及亲和素包被的感光微粒试剂检验样本灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。初始反应条件依次添加25 ill样品、25 ill发光微粒试剂、25 u 1生物素标记抗体 试剂、175iU亲和素包被的感光微粒，两步温育，其中第一温育时间为20min，第二温育时 间为15min。分别配制浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的发光试剂以及浓度为 0. 05ug/ml、0. lug/ml,0. 15ug/ml、0. 2ug/ml的生物素化抗体交叉配对进行检测，结果分别 如下 100ug/ml 发光试剂 200ug/ml 发光试剂 对上述结果进行分析比较，结合RLU值、灵敏度等指标发现发光试剂的浓度50ug/ ml，生物素化抗体的浓度0. 05ug/ml结果最为理想。4、亲和素包被的感光微粒的浓度的筛选发光抗体浓度选用50iig/ml，生物素化抗体的浓度选用0. 05 y g/ml，亲和素包 被的感光微粒浓度分别配制为30ii g/ml，40ii g/ml，60ii g/ml，在初始反应条件下，结果如 下 根据灵敏度比较，Qc L和Qc H的测定浓度，亲和素包被的感光微粒浓度在40 y g/ ml时结果最为理想。实施例6评价试验试剂采用发光抗体试剂(50 u g/ml)、生物素标记抗体试剂(0. 05 u g/ml)及亲和 素包被的感光微粒试剂(40 u g/ml)。检测方法在反应孔中分别加入25 u 1样品，再依次加入25 u 1发光试剂和25 u 1 生物素化抗体试剂。然后放入仪器，由仪器自动按以下步骤操作振动，37°C温育20分钟，再自动加入亲和素包被的感光微粒试剂175 yl后37°C温育15分钟。仪器自动产生激光照 射微孔计算每孔发光光子量，根据标准曲线可以推算样品FT3浓度，单位是pg/ml，最后打 印试验报告。1、检测范围本试剂盒线性检测范围为l_50pg/ml，对其用双对数模型拟合，剂量-反应曲线相 关系数(r)的绝对值不低于0.9900。如要准确的测定样品中FT3浓度值，样品中FT3浓度 值应不超出l_50pg/ml标准品曲线的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过标准品曲线 外延得出的计算结果。经本试剂盒对大量的临床样本的检验结果可知道，大部分样本结果 小于50pg/ml，因此，本试剂盒设定的检测范围为l-50pg/ml完全可满足临床应用要求。2、灵敏度的检测检测10孔标准品Opg/ml，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE-2SD 反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，经检测两个批号的试剂，其分 析灵敏度分别为0. 62pg/ml、0. 54pg/ml，均不高于lpg/ml。3、精密性检测分别采用2个批号的FT3试剂盒对质控品QC H、QC L进行1次检测，每次复测10 孔，每份样品共检测20次。得到如下结果 由上述结果可知，本产品其批内精密性、批间精密性小于10%。4、线性的检测对除0值外其他5点标准品用双对数或其他数学模型拟合，剂量_反应曲线相关 系数(r)的绝对值应不低于0. 9900。经检测两个批号的试剂盒，其线性r值分别为0. 9952、 0.9944。5、干扰性试验在已知浓度的临床标本1#、2#、3#中加入250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、 10mg/dL胆红素，以本试剂盒进行检测，结果如下表试剂盒1(单位pg/ml) 试剂盒2(单位pg/ml) 由上述结果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL胆红素对本试剂盒无明显干拢， 但250mg/dL血红蛋白对本产品检测结果有影响，因此尽量避免样本严重溶血。实施例7比较试验试剂采用发光抗体试剂(50 u g/ml)、生物素标记抗体试剂(0. 05 u g/ml)及亲和 素包被的感光微粒试剂(40 u g/ml)。以西门子公司FT3试剂盒为参照进行了质量水平比较，所用标本为实施例5中的 灵敏度参考品，结果如图4所示。由图4所示的结果可知，本试剂盒检测结果与西门子结果相关性r = 0.9341，且该 试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，适合于向临床推广实施例8试剂盒的组配将实施例1-3中按照各种方法制备的的三种试剂分别独立包装，组配后获得基本试剂盒。可用于定量检测样品中FT3的浓度。
权利要求
一种用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，为二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。
2.如权利要求1所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其特征在于，所述发 光微粒的粒径范围为100-400nm。
3.如权利要求1所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其特征在于，所述发 光微粒的表面官能团选自羧基或醛基。
4.如权利要求1所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其特征在于，所述发 光微粒的发光量为150，000-350, 000光子数/100 μ g发光微粒。
5.如权利要求1-4中任一权利要求所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其 特征在于，所述检测微粒经如下工艺制得1)混合将发光微粒与二碘甲腺氨酸混合于缓冲液中；2)反应加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应；3)往步骤2)获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混勻并反应；4)清洗产物，获得二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。
6.如权利要求5所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其特征在于，所述缓 冲液为MES缓冲液。
7.如权利要求5所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其特征在于，所述步 骤1)中，发光微粒与二碘甲腺氨酸的质量比例为10 (0.01-0.05)。
8.如权利要求7所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其特征在于，所述步 骤1)中，发光微粒与二碘甲腺氨酸的质量比例为10 0.02。
9.如权利要求5所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，其特征在于，所述步 骤4)的清洗的方式为离心法清洗。
10.一种游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，包括权利要求1-9中任一权利要求所述 用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒。
11.如权利要求10所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 还包括生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体和亲和素包被的感光微粒中的一种或两种。
12.如权利要求11所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素 标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体中，生物素与抗体的分子比例为(10-50) 1。
13.如权利要求11所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素 包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1 (3-10)。
14.如权利要求11所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检 测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体以及亲和素包被 的感光微粒分别独立包装，且均为混悬液。
15.如权利要求14所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液 的溶剂选自HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。
16.如权利要求15所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述用于 检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒混悬液的溶剂为PH8. 0的成分为HEPES、NaCl和 EDTA-Na-2H20 的 HEPES 缓冲液。
17.如权利要求15所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素 标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体混悬液的溶剂为PH8. 0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris缓冲液。
18.如权利要求15所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒混悬液的溶剂为成分为HEPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES缓冲液。
19.如权利要求14所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液中还包括蛋白保护剂、防止微粒聚集的稳定试剂或防腐剂中的一种或多种。
20.如权利要求10所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括多种浓度已知的三碘甲腺原氨酸溶液，不同浓度的三碘甲腺原氨酸溶液分别独立 包装。
21.如权利要求10-20中任一权利要求所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用 方法，包括下列步骤1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒和生物素 标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体，获得初始反应溶液，混合反应；2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。
22.如权利要求21所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 所述激发光光源波长范围为600-700nm。
23.如权利要求21所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 所述激发光光源的功率范围为5-lOOmw。
24.如权利要求21所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 所述步骤1)和2)的反应条件为37°C温育10-30分钟。
25.如权利要求24所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 所述步骤1)的反应条件为37°C温育20分钟，步骤2)的反应条件为37°C温育15分钟。
26.如权利要求21所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在 于，所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒为混悬液，用于检测游离三碘甲腺原氨 酸的检测微粒在混悬液中的浓度为25-200 μ g/ml ；所述生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸 抗体为混悬液，生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体在混悬液中的浓度为0. 05-0. 2 μ g/ ml ；所述亲和素包被的感光微粒为混悬液，亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为 10-100 μ g/ml。
27.如权利要求26所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 所述用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒在混悬液中的浓度为50μ g/ml ；所述生物 素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体在混悬液中的浓度为0. 05 μ g/ml ；所述亲和素包被的感 光微粒在混悬液中的浓度为40ug/ml。
28.如权利要求21所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 所述初始反应溶液的体积为30-75 μ 1 ；最终反应溶液的体积为100-250 μ 1。
29.如权利要28所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所 述初始反应溶液的体积为75ul ；最终反应溶液的体积为250ul。
30.如权利要求21所述游离三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 还包括根据标准曲线计算待测样品中游离三碘甲腺原氨酸的含量。
全文摘要
本发明涉及甲状腺疾病的辅助诊断试剂，公开了一种用于检测游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒，为二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。本发明还公开了上述游离三碘甲腺原氨酸的检测微粒的制备及应用。此外，本发明又进一步公开了一种测定样品中游离三碘甲腺原氨酸的体外诊断试剂盒，同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。
文档编号G01N33/542GK101864288SQ200910049309
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者张伟, 王海蛟, 赵卫国 申请人:博阳生物科技(上海)有限公司