专利名称：：一种同时分析微生物发酵液中甘油和二羟基丙酮的方法
技术领域：
：本发明属于化学分析领域，具体地说，涉及一种同时分析微生物发酵液中甘油和二羟基丙酮的方法。
背景技术：
：二羟基丙酮不仅被广泛的应用在化妆品工业，同时，也是精细化工中有用的合成模块。二羟基丙酮是甘油的氧化产物，在工业上主要由醋酸杆菌属和氧化葡萄糖酸杆菌属的微生物生产(Cassandra,D.M.，etal.CritRevinBiotechnol.2007,27:147-171)。但是，由于生物发酵液的成分复杂，甘油和二羟基丙酮又具有相似的化学结构和理化性质，不易同时检测，因此，如何准确定量检测甘油和二羟基丙酮的含量，从而优化和调控生物转化过程，是生物法生产二羟基丙酮研究中的一个重要方面。目前，同时检测甘油和二羟基丙酮含量的方法主要有以下几种薄层层析法(Yamada,S.，et.al.J.Ferment.Technol.1979，57:215-220)、分光光度计法(Karklinn,A.V.,et.al.PrikladnayaBiokhimiyaiMkrobiologiya.1998,24:816)、酶法(wo/92/20818)、高效液相色谱法(Chen，H.W"etal.Chromatographia.2007,65:629-632.ChenJ.，et.al.JournalofChromatographicScience.2008,912-916)、硅烷衍生化气相色谱法(张智宏，孙晓娟，二羟基丙酮的气相色谱分析，分析测试学报。1999,18:68-72)和在线裂解气相色谱法(Wang,L丄.，et.al.AnalChimActa.2005，557,262-266)。但是，上述方法存在有各自的不足，例如采用薄层层析法和分光光光度计法检测准确度不高；酶法检测不易实现；采用高效液相色谱法检测需要示差检测器和专门的糖柱，同时响应信号较弱；采用硅垸衍生化气相色谱法检测需要在无水环境及高温下衍生；采用在线裂解气相色谱法检测需要专门的裂解器。因此，为了解决现有方法的不足，有必要提供一种简单准确又不需要特殊仪器的定量检测微生物发酵液中的甘油和二羟基丙酮的含量的方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种同时检测微生物发酵液中甘油和二羟基丙酮的含量的方法，从而可以在常温下简单的对微生物发酵液中的甘油和二羟基丙酮进行分析。本发明提供的方法，包括以下步骤A)乙酰化处理反应上清液；B)对乙酰化处理后的样品进行气相色谱检测。根据本发明的一个优选实施例，检测的发酵液为微生物转化甘油生成二羟基丙酮的发酵液，该微生物为氧化葡萄糖酸杆菌(Go;c;^am)DSM2003。根据本发明的一个优选实施例，乙酰化处理为使用l-甲基咪唑催化乙酰化，其过程如下向溶液中加入l-甲基咪唑和过量的乙酸酐，于室温反应l5min后，加入去离子水降解过剩的乙酸酐，然后加入内标，用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥后获得气相色谱检测液，其中，内标为正十六垸。根据本发明的一个优选实施例，气相色谱检测中使用的色谱柱为弱极性或非极性毛细管柱，具体为DB-5、HP-5或HP-1、DB-1。使用本发明提供的方法，可以在常温下直接对发酵液进行乙酰化处理，可避免二羟基丙酮在普通乙酰化所需高温下的分解。发酵液中甘油和二羟基丙酮的乙酰化反应快速，简单方便。同时，本方法所需样品量少，准确度高，精密度好，能够短时间内对成分复杂的微生物发酵液中的甘油和二羟基丙酮实现同时定量，解决了现有方法存在的问题，完全能够满足微生物发酵甘油生产二羟基丙酮的过程检测及调控。图1是实施例1中含有50g/l甘油和二羟基丙酮的标准溶液乙酰化产物的气相色谱图，其中，1是乙酰化的二羟基丙酮的检测峰；2是甘油三乙酰酯的检测峰；3是正十六垸的检测峰。图2是实施例3中发酵16h样品乙酰化产物的气相色谱图，其中，l是乙酰化的二羟基丙酮的检测峰；2是甘油三乙酰酯的检测峰；3是正十六垸的检测峰。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。在本发明的下述实施例中，使用的二羟基丙酮、1-甲基咪唑和正十六烷购自sigma-aldrich公司，甘油、乙酸酐和二氯甲烷购自上海国药集团化学试剂有限公司。本发明的下述实施例中，l-甲基咪唑催化的乙酰化过程如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本发明的下述实施例中，气相色谱检测所用气相色谱仪为安捷伦6890，FID检测器，使用的毛细管色谱柱为DB-5柱，色谱检测的条件具体如下程序升温起始温度140。C，保留2min，20°C/min升至220°C，保留2min，进样口温度22(TC，检测室温度250。C，进样量0.2ul。虽然本发明中所用的色谱柱为弱极性毛细管柱DB-5，但是，其它弱极性毛细管柱，如HP-5等，或非极性毛细管柱，如HP-1、DB-1等，也可以用作检测的色谱柱。发明人通过方法线性，加标回收率，样品精密度的测定验证了本方法的准确性，结果显示，本发明提供的方法可以在常温下直接对发酵液进行乙酰化处理，不受杂质影响，简单快速，易于操作。同时，本方法所需样品量少，准确度高，精密度好，能够在短时间内实现发酵液中甘油和二羟基丙酮的定量，解决了现有方法存在的问题，完全能够满足微生物法转化甘油生产二羟基丙酮的过程检测及调控，具体过程如实施例所示。实施例1、方法验证1.1、线性分析分别配制浓度为1、10、25、50、100g/l的甘油和二羟基丙酮的标准溶液，并配制10g/l的正十六烷溶液作为内标，用内标法进行定量，以校正操作及仪器误差。然后，取不同浓度的标准溶液各10ul，分别加入10ull-甲基咪唑和0.5ml乙酸酐，并于室温下反应15min后，加入100ul去离子水降解过剩的乙酸酐，再加入10ul正十六垸内标溶液，然后用100ul二氯甲垸萃取反应液，萃取的有机相用无水硫酸钠干燥，将干燥后的萃取液直接进行气相色谱分析，获得不同浓度的标准溶液的色谱图，其中，50g/l的标准溶液的色谱图如图1所示，其余各浓度的标准溶液的色谱图呈现与图1相似的峰形和出峰时间。根据图1的结果，甘油和二羟基丙酮乙酰化产物在气相色谱上可以得到很好的分离。标准曲线的制作用不同浓度的甘油或二羟基丙酮衍生物峰面积与内标峰面积之比做纵坐标，相应的浓度做横坐标，分别绘制标准曲线并进行线性回归，得到甘油和二羟基丙酮的浓度计算公式为-甘油浓度计算公式Y=-0.0072+0.076X(R2=0.9998);禾口二羟基丙酮浓度计算公式Y=-0.0210+0.032X(R2=0.9997)。1.2、准确度分析准确度分析采用样品加标回收率的方法确定(Wang,L丄.，etal.AnalChimActa.2005,557,262-266)，结果如表l所示，其中，回收率计算公式为户气C2-C,)/C3X100O/o;其中，C3=m3/(vi+v3)其中尸为加标回收率；C,为加标前浓度，即样品测定值；Q为加标后浓度，C3为加标浓度，m3为加标体积所含标准物质的量，"为加标前体积，V3为加标体积。表l、甘油和二羟基丙酮回收率测定(n=5)物质加标前浓度(g/1)加标量(g/1)加标后浓度(g/1)(mean±SD)回收率(%)甘油52.5626.7478.63±0.1597.413.465.53±0.296.8二羟基丙酮25.6812.5037.73±0.1896.56.2531.65±0.1695.5表l的结果显示，甘油的平均回收率为97.1%，二羟基丙酮的平均回收率为96%。根据表l的结果，使用上述方法检测溶液中的甘油和二羟基丙酮含量的准确度较高。1.3、精密度(重现性)分析取16h微生物发酵液(该发酵液参考实施例2中的方法获得)，然后按步骤l.l中的方法进行处理，处理后的样品重复检测5次，并计算检测结果的平均值和相对标准偏差(RSD)，结果如表2所示。6表2、样品精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2的结果显示，甘油和二羟基丙酮的连续五次进样的检测结果的相对标准偏差分别为0.37%禾口0.49%。根据表2的结果，甘油和二羟基丙酮重复检测5次的RSD都小于1。/。，因此，本方法有着良好的重现性。综上所述，应用本发明所述的方法，乙酰化可在室温下快速完成反应，操作简便；所需样品量少方法准确度高，精密度好，能够快速实现发酵液中甘油和二羟基丙酮的定量。实施例2、生物发酵液样品制备及预处理用氧化葡萄糖酸杆菌属(G/wco"o6a"e。的氧化葡萄糖酸杆菌(Go砂cfera)DSM2003发酵甘油生产二羟基丙酮，其中，DSM2003株种子培养基8.0%山梨醇，2.0%酵母粉，0.1%K2HP04，0.05%MgS04.7H20。DSM2003株发酵培养基8.0%甘油，2.0%酵母粉，0.1%K2HP04，0.05%MgS04-7H20。将氧化葡萄糖酸杆菌DSM2003株接入种子培养基，在3(TC下，200rpm震荡培养24h，获得种子培养液，然后以10%接种量接入2L发酵培养基，在3.7L发酵罐(KLF2000，Switzerland)中发酵生产二羟基丙酮。在发酵过程中间隔取样，将所取微生物发酵液于10000rpm离心5min，去除菌体沉淀，上清液作为乙酰化反应中的样品。实施例3、发酵液上清衍生化处理及色谱检测分别取步骤2中获得的离心上清液10^1，按照步骤1.1中所描述的方法对发酵液进行衍生，并将乙酰化产物进行气相色谱分析检测，其中，发酵16h样品的检测结果如图2所示，其余样品的色谱图与图2相似。图2的结果显示，本发明所述的方法在实际的应用中并未受微生物发酵液中其它杂质的影响，因此，使用上述方法检测微生物发酵液中的甘油和二羟基丙酮的含量是可行的，可实现对微生物发酵过程的调控。综上所述，本发明可以在常温下直接对微生物发酵液进行乙酰化处理，简单方便，易于操作。同时，本方法准确度高，精密度好，能够在短时间内实现发酵液中甘油和二羟基丙酮的同时定量，完全能够满足微生物法转化甘油生产二羟基丙酮的过程检测及调控。权利要求1、一种同时分析微生物发酵液中甘油和二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤A)乙酰化处理微生物发酵液上清；B)对乙酰化处理后的样品进行气相色谱检测。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述发酵液为微生物转化甘油生成二羟基丙酮的发酵液。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述微生物为氧化葡萄糖酸杆菌属微生物。4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌属微生物为氧化葡萄糖酸杆菌(Gojcyifom)DSM2003。5、.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酰化处理为使用l-甲基咪唑催化乙酰化。6、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述乙酰化处理为'向溶液中加入l-甲基咪唑和过量的乙酸酐，于室温反应l5min后，加入去离子水降解过剩的乙酸酐，然后加入内标，用二氯甲烷萃取反应液，有机相千燥危获得气相色谱检测液。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述内标为正十六垸。8、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述气相色谱检测中使用的色谱柱为弱极性或非极性毛细管柱。9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为DB-5、HP-5或HP-1、DB-1。全文摘要本发明的目的在于提供一种同时分析微生物发酵液中甘油和二羟基丙酮的方法。本发明提供的方法包括以下步骤A)乙酰化处理微生物发酵液上清；B)对乙酰化处理后的样品进行气相色谱检测。使用本发明提供的方法，可以在常温下直接对发酵液进行乙酰化处理，可避免二羟基丙酮在普通乙酰化所需高温下的分解。发酵液中甘油和二羟基丙酮的乙酰化反应快速，简单方便。同时，本方法所需样品量少，准确度高，精密度好，能够短时间内对成分复杂的微生物发酵液中的甘油和二羟基丙酮实现同时定量，解决了现有方法存在的问题，完全能够满足微生物发酵甘油生产二羟基丙酮的过程检测及调控。文档编号G01N30/00GK101566606SQ20091005244公开日2009年10月28日申请日期2009年6月3日优先权日2009年6月3日发明者建吴,林金萍,魏东芝申请人:华东理工大学