专利名称：作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用尖晶石型纳米铁酸镍、壳聚糖和葡萄糖氧化酶混合分散液修饰作为 葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的制备方法及其应用，属电化学分析检测技术领域。
背景技术：
生物传感器将分析化学和生物学的技术及方法结合在一起，是一种利用生物的因子或生 物学原理来检测或计量化合物的装置。通常由分子识别部分(敏感元件)和转换部分(换能器) 组成。电化学生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型，由于它具有诸如以下的 优点而被广泛研究结构简单，不需要昂贵的检测仪器设备；操作简便，换能器将反应能转 换成电信号，易于检测和转换成数字信号与计算机联机，实现连续、实时、自动化检测分析； 方法简单，如测定过程无需对生物样品做任何分子标记、衍生等；灵敏度高；选择性好，复 杂的样品往往不需要经过分离或掩蔽处理就可以直接测定；快速实时，如检测一对生物分子 间相互作用通常用时不到1小时，而且在检测过程中，就可以观察到生物分子间相互作用的 结果；易于小型化、微型化，更适合临床和现场的检测分析。生物传感器的研究经历了三个 发展阶段即第一代生物传感器以氧为中继体的电催化，第二代生物传感器基于人造媒介体的 电催化和第三代生物传感器的直接电催化。利用人为加入电子媒介体来解决传递电子的问题 是第二代生物传感器的一大特点。这种电子媒介体是具有电催化作用的氧化还原体，起到了 酶与电极之间传递电子的作用。本发明便是利用在电解液中加入定量的羧酸二茂铁作为电子 媒介体。
尖晶石型纳米铁酸镍(NiFe204)是指和尖晶石MgO-Al203具有同样的晶体结构的铁酸镍， 晶体结构属于立方晶系。每个晶胞由八个分子组成，其中包括24个金属离子和32个氧离子。 氧离子组成面心立方晶格，二价阳离子和三价阳离子分别占据氧离子的两种间隙位置(正四 面体间隙和正八面体间隙)。纳米NiFe204除具有纳米粒子的表面效应，体积效应，量子尺寸 效应和宏观量子隧道效应等特性外，还具有超顺磁性且能促进电子的传递。纳米NiFe204还 具有生物共容性且无毒副作用可应用于葡萄糖传感器。
壳聚糖(Chitosan)是甲壳素部分脱乙酰而得到的一种直链大分子生物多糖，是一种天然 的可再生资源，壳聚糖以其价格低廉，生物相容性好，无毒性，生物可降解性，成膜性好等 优点在生化研究领域受到日益广泛的关注。辣根过氧化酶，葡萄糖氧化酶以及乙酞胆碱脂酶 等许多酶己成功地固定在壳聚糖膜中并应用于生物传感。然而因为酶的活性部位深深地位于 蛋白质的内部，如果没有电子媒介体，生物传感器中酶的电子传递效率很低，而在溶液中加
3入电子媒介体可以提高传感器的检测灵敏度。壳聚糖的电化学性质不活泼，导电性差，通过 向其中掺杂尖晶石型铁酸镍可改善其导电性。本发明在壳聚糖(Chitosan)复合膜中加入尖晶 石型纳米NiFe204，制得性能稳定、导电性好以及传递电子速度快的安培型生物传感器。
葡萄糖氧化酶因其价格相对低廉，稳定性好，催化效率高，对D(+)-葡萄糖有高度专一 的催化氧化作用，成为人们制备葡萄糖传感器的理想模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用壳聚糖、尖晶石型纳米铁酸镍、葡萄糖氧化酶共同修饰玻 碳电极作为葡萄糖传感器的方法，以及该作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的使用方法。
本发明一种作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的制备方法，其特征在于具有以下的过程 和步骤
a. 玻碳电极的预处理首先将玻碳电极用金相砂纸抛光，再依次用1.0 pm和0.3 pm和 0.05 nm的Al203悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1 : 1的HN03溶液、无水乙醇和二 次蒸馏水超声清洗干净，备用；
b. 玻碳电极修饰剂的配制将一定量的壳聚糖溶于醋酸溶液中，配制成质量溶度为0.5 % 的壳聚糖溶液；将一定量的尖晶石型纳米铁酸镍分散于上述壳聚糖溶液中，然后超声分散2 小时，形成含有尖晶石型纳米铁酸镍的分散液；然后再将一定量的葡萄糖氧化酶加入上述分 散液中，再超声分散3~10分钟，使分散均匀，得到玻碳电极修饰剂；所述修饰剂各使用物 质的重量配比为壳聚糖葡萄糖氧化酶尖晶石型纳米铁酸镍=1 : 0.4 : 0.34:
c. 修饰玻碳电极的制备取一定量的上述修饰剂滴加于清洗干净的玻碳电极表面，在4 'C下干燥24小时，使电极表面形成均匀的壳聚糖/葡萄糖氧化酶/铁酸镍的复合膜，即制得修 饰玻碳电极。
一种作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的用途及使用方法，其用途是所述修饰玻碳电极 可直接用于葡萄糖浓度的电化学测定；使用方法即测定方法如下将尖晶石型铁酸镍修饰玻 碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极、铂片电极作为辅助电极，组成三电极系 统；电化学测定时，将所述修饰电极放置在以恒定速率搅拌的、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液 中；在-0.4 0.9V电位窗口中循环伏安法扫描至图形稳定；然后再在缓冲溶液中加入少量羧 酸二茂铁；在工作电极上施加一定的阴极电位，记录下电流一时间曲线，当背景电流达到稳 态后，用微量进样器加葡萄糖溶液样品，并记录电流响应；在不同葡萄糖溶液浓度下测得传
感器对葡萄糖的电流响应值，并在浓度0.5 ~ 7.0 mM/L范围内，得到电流与葡萄糖浓度的线 性关系曲线，其线性相关系数r- 0.994，利用该线性关系曲线及相应的线性方程，可用它测定葡萄糖溶液试样的浓度。
本发明的修饰电极相当于一种新型的电化学葡萄糖传感器，能直接用于葡萄糖的快速电 化学测定，利用尖晶石型纳米铁酸镍粒子所得到的酶修饰电极具有催化性能高、稳定性好、 成本低等的优点，并且对葡萄糖的检测效率高，准确度高。
图1为本发明中壳聚糖、尖晶石型纳米铁酸镍和葡萄糖氧化酶复合膜修饰电极的扫描电 镜(SEM)表征图。
图2为本发明中所述修饰电极在最优化条件下对葡萄糖一定浓度的响应的时间——电流 曲线图。
具体实施例方式
现将本发明的具体实施例叙述于后。 实施例l
本实施例中的制备过程和步骤如下
(1) 玻碳电极的预处理首先将玻碳电极用金相砂纸抛光，再依次用1.0pm和0.3 pm 和0.05 nm的八1203悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1 : 1的HN03溶液、无水乙醇 和二次蒸馏水超声清洗干净，备用；
(2) 玻碳电极修饰剂的配制将一定量的壳聚糖溶于醋酸溶液中，配制成质量溶度为
0.5%的壳聚糖溶液；将一定量的尖晶石型纳米铁酸镍分散于上述壳聚糖溶液中，然后超声分 散2小时，形成含有尖晶石型纳米铁酸镍的分散液；然后再将一定量的葡萄糖氧化酶加入于 上述分散液中，再超声分散3 10分钟，使分散均匀，得到玻碳电极修饰剂；所述修饰剂各 使用物质的重量配比为壳聚糖葡萄糖氧化酶尖晶石型纳米铁酸镍=1 : 0.4 : 0.34;
(3) 修饰玻碳电极的制备取一定量的上述修饰剂滴加于清洗干净的玻碳电极表面，在 4'C下干燥24小时，使电极表面形成均匀的壳聚糖/葡萄糖氧化酶/铁酸镍的复合膜，即制得
修饰玻碳电极。
修饰玻碳电极作为葡萄糖传感器对葡萄糖溶液浓度的电化学测定测定方法的过程如下
将尖晶石型铁酸镍修饰玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极、铂片电极
作为辅助电极，组成三电极系统；电化学测定时，将所述修饰电极放置在以恒定速率搅拌的、 pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中；在-0.4 0.9V电位窗口中循环伏安法扫描至图形稳定；然后再 在缓冲溶液中加入少量羧酸二茂铁；在工作电极上施加一定的阳极电位，记录下电流一时间 曲线，当背景电流达到稳态后，用微量进样器加葡萄糖溶液样品，并记录电流响应；在不同
5葡萄糖溶液浓度下测得传感器对葡萄糖的电流响应值，并在浓度0.5 ~ 7.0 mM/L范围内，得 到电流与葡萄糖浓度的线性关系曲线；其线性方程为/0iA) = 3.442 C(mM) + 0.429，其线 性相关系数^ = 0.994，利用该线性关系曲线及相应的线性方程，可用它测定葡萄糖溶液试样 的浓度。
作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的表征
通过扫描电镜(SCE)可以观察尖晶石型NiFe204/壳聚糖(Chitosan) /葡萄糖氧化酶(Gox) 复合膜的表面形态，如图1所示。从图中可以看出，尖晶石型NiFe204在壳聚糖和葡萄糖氧 化酶形成的膜中成岛状分布，这种特定的结构有助于酶和基底之间的电子传递，从而导致传 感器产生好的电流响应。
电化学测定
在最佳测试条件下，晶石型NiFe2(V壳聚糖(Chitosan) /葡萄糖氧化酶(Gox)复合膜修 饰电极对葡萄糖的计时电流响应如图2所示。由图可见，达到95。/。稳态电流的时间为4s，响 应时间非常短，这主要是因为制得的壳聚糖生物复合膜具有良好的生物相容性、多孔性以及 较强的导电性。随着葡萄糖浓度的增加，传感器对葡萄糖的电流响应逐渐增大，在0.5 7.0mM 范围内，电流与葡萄糖浓度成线性关系。
本发明方法制备的电极，重现性和稳定性良好。循环伏安扫描30圈后几乎没有什么变化。 电极不用时在4 'C的冰箱中存放30日后，电流响应保持在90%以上。且不受镍铁等金属离 子，果糖木糖等其它糖类的干扰，专一性好。其测限为0.02mM (信噪比为3)。
权利要求
1、一种作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的制备方法，其特征在于具有以下的过程和步骤a.玻碳电极的预处理首先将玻璃态碳电极即玻碳电极用金相砂纸抛光，再依次用1.0μm和0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浮液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用1∶1的HNO3溶液、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗干净，备用；b.玻碳电极修饰剂的配制将一定量的壳聚糖溶于醋酸溶液中，配制成质量溶度为0.5％的壳聚糖溶液；将一定量的尖晶石型纳米铁酸镍分散于上述壳聚糖溶液中，然后超声分散2小时，形成含有尖晶石型纳米铁酸镍的分散液；然后再将一定量的葡萄糖氧化酶加入于上述分散液中，再超声分散3～10分钟，使分散均匀，得到玻碳电极修饰剂；所述修饰剂各使用物质的重量配比为壳聚糖葡萄糖氧化酶尖晶石型纳米铁酸镍＝1∶0.4∶0.34；c.修饰玻碳电极的制备取一定量的上述修饰剂滴加于清洗干净的玻碳电极表面，在4℃下干燥24小时，使电极表面形成均匀的壳聚糖/葡萄糖氧化酶/铁酸镍的复合膜，即制得修饰玻碳电极。
2、 一种作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的用途及使用方法，其用途是所述修饰玻碳电极 可直接用于葡萄糖浓度的电化学测定；使用方法即测定方法如下将尖晶石型铁酸镍修饰玻 碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极、铂片电极作为辅助电极，组成三电极系 统；电化学测定时，将所述修饰电极放置在以恒定速率搅拌的、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液 中；在-0.4 0.9V电位窗口中循环伏安法扫描至图形稳定；然后再在缓冲溶液中加入少量羧 酸二茂铁；在工作电极上施加一定的阳极电位，记录下电流一时间曲线，当背景电流达到稳 态后，用微量进样器加葡萄糖溶液样品，并记录电流响应；在不同葡萄糖溶液浓度下测得传 感器对葡萄糖的电流响应值，并在浓度0.5 ~ 7.0 mM/L范围内，得到电流与葡萄糖浓度的线 性关系曲线，其线性相关系数r- 0.994，利用该线性关系曲线及相应的线性方程，可用它测 定葡萄糖溶液试样的浓度。
全文摘要
本发明涉及一种利用尖晶石型纳米铁酸镍、壳聚糖和葡萄糖氧化酶混合分散液修饰玻碳电极作为葡萄糖传感器的制备方法及其应用，属电化学分析检测技术领域。本发明主要是用尖晶石型纳米铁酸镍加入到固定葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液中，以促进电子的传递，并用于葡萄糖的电化学测定。本发明中作为葡萄糖传感器的修饰玻碳电极的制备方法如下首先将尖晶石型铁酸镍分散于一定浓度的壳聚糖溶液中，超声分散均匀，随后加入一定量的葡萄糖氧化酶，继续超声至分散均匀，即制得铁酸镍/壳聚糖/葡萄糖氧化酶修饰剂。将该修饰剂滴加于清洗干净的玻碳电极表面，在4℃下干燥24小时，使电极表面形成一层均匀的复合膜，既制得修饰玻碳电极，也即可作为一种葡萄糖传感器，直接用于葡萄糖的快速电化学测定。
文档编号G01N27/49GK101581691SQ20091005386
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者丁亚平, 徐彦红, 丽 李, 李秋霞, 霞 王, 罗立强 申请人:上海大学