专利名称：一种细胞周期检查点调控蛋白用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种细胞周期检查点调控蛋白用作检 测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。
背景技术：
肝细胞癌是世界范围内第四位常见的恶性肿瘤，也是我国第二位常见恶性肿瘤， 每年大约有250，000名患者死于肝细胞癌。肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后 差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治疗时期。但由于西方发达国家肝癌的发病率较 低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上 升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危 害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，因此，加 大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝 癌基础研究中的前沿课题。到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已 确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌 的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因 治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高 表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。因此，研究和开发在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义，寻找 新的在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质也具有迫切需要性。Rad9A ^ S (Cell cycle checkpoint control protein RAD9A, hRAD9A, EC = 3. 1. 11. 2，DNArepair exonuclease Rad9A homolog A)的 NCBI 登录号为 NP_004575， Swissprot 登录号为 Q99638, IPI 号为 IPI00005277. 4 (human3. 28 version)。Rad9A 的一个 主要功能是提高细胞对DNA损伤的抗性并维持基因组的完整性。这与Rad9A参与以下生理 过程有关参与构成Rad9A-Radl-HuSl复合物，调控细胞周期检测点；参与修复DNA损伤， 主要是碱基切除修复(base excision repair)；参与维持端粒的稳定。Rad9A还参与细胞 凋亡DNA损伤促使Rad9A被caspase 3剪切，产生的N端片段从细胞核转移到细胞质，随后 与抗凋亡的Bcl-XL蛋白结合而抑制其功能，从而促进凋亡。另外，Rad9A还具有以下功能 反式激活目标基因、3’ _5’核酸外切酶活性、抑制雄性激素受体的反式激活活性以及参与核 糖核苷酸的合成等(http://www. uniprot. org/uniprot/Q99638)。在 Rad9A 蛋白的 387 位 的丝氨酸残基上发生磷酸化获得的蛋白即为Ph0Sph0-Rad9A-S387。另外，有少量研究显示，Rad9A蛋白与部分癌症相关，如Cheng等在48例乳腺癌 样本中发现有25例乳腺癌样本中Rad9A的mRNA水平显著上调，但没有1例乳腺癌样本 Φ Rad9A ^ mRNA /JC5FII^TiI (The cell cycle checkpoint gene Rad9A is a novel oncogene activatedby llql3 amplification and DNA methylation in breast cancer.Cancer Res 2005,65, (19)，8646-54)；随后，Kebebew 等证实在甲状腺癌中 Rad9A 的 mRNA 水平H著上升(Diagnosticand prognostic value of cell-cycle regulatory genes in malignant thyroid neoplasms. World JSurg 30(5) :767_74) ；Zhu 等发现前列腺癌细胞 系中Rad9A的表达水平较正常的前列腺细胞系显著升高(Rad9A has a functional role in human prostate carcinogenesis. Cancer Res 68(5) : 1267-74) ；Maniwa 等证实 Rad9A 的表达水平在部分非小细胞肺癌样本中显著升高，同时发现Rad9A存在过度磷酸化现象 (Accumulation of hRad9A protein in the nuclei of nonsmall eelllung carcinoma cells. Cancer 103(1) :126_32)。但是到目前为止，现有文献中未见有Rad9A，特别是Ph0Sph0-Rad9A-S387，与肝细 胞癌的相关性的报道。
发明内容
通过筛选在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申 请的发明人找到了一种在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白 质(在癌组织中表达上调)，经质谱鉴定为Ph0Sph0-Rad9A-S387。免疫印迹实验证实， Phospho-Rad9A-S387的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织 中表达上调)。利用人肝细胞癌细胞株H印G2和人正常肝细胞株L02进行的免疫荧光实验， 证明Ph0Sph0-Rad9A-S387在这两种细胞株间存在差异表达(在人肝细胞癌细胞株H印G2 中表达上调)。通过对62对人肝细胞癌的癌组织与癌旁组织进行的免疫组织化学实验进一 步证实了 Ph0Sph0-Rad9A-S387在人类肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在 癌组织中表达上调)。基于Ph0Sph0-Rad9A-S387与肝细胞癌的这种相关性，这种蛋白质可以作为一种 蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。因此，本发明的首要目的在于提供Ph0Sph0-Rad9A-S387的一种应用。本发明提供的Ph0Sph0-Rad9A-S387的应用为作为用作检测肝细胞癌的分子标记 物。本发明的另一个目的在于提供一种Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体的应用。本发明提供的Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体的应用，为用于制备检测肝细胞癌的 制剂和/或用于制备检测肝细胞癌的试剂盒。根据本发明，抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。本发明的又一个目的在于提供一种体外检测肝组织中Ph0Sph0-Rad9A-S387的表 达是否异常的方法。本发明提供的方法为检测待测肝组织中Ph0Sph0-Rad9A-S387的数量，并与正常 肝组织中的Ph0Sph0-Rad9A-S387的数量进行比较。鉴于到目前为止，还没有Ph0Sph0-Rad9A-S387的表达量与肝细胞癌早期诊断的相 关性报道。因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
图IA为Ph0Sph0-Rad9A-S387的免疫印迹实验结果，其中，泳道1_6为肝细胞癌组织的检测结果，泳道1’ -6’为与泳道1-6对应的癌旁组织的检测结果。图IB为Rad9A的免疫印迹实验结果，其中，泳道1_6为肝细胞癌组织的检测结果， 泳道1’ -6’为与泳道1-6对应的癌旁组织的检测结果。图2A为对图IA的免疫印迹结果进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图， 其中，HCC为肝细胞癌患者的癌组织，non-HCC为癌旁组织。图2B为对图IB的免疫印迹结果进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图， 其中，HCC为肝细胞癌患者的癌组织，non-HCC为癌旁组织。图3为Phospho-Rad9A-S387的免疫荧光实验结果，其中，Al为!fepG2细胞中 Phospho-Rad9A-S387的分布情况，A2为H印G2的细胞核，A3为Al和A2的叠加图，Bl为L02 细胞中Phospho-Rad9A-S387的分布情况，B2为L02的细胞核，B3为Bl和B2的叠加图。图4为Ph0Sph0-Rad9A-S387的免疫组织化学实验结果，其中，A为肝细胞癌组织， B为癌旁组织，物镜放大倍数为20倍。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在本发明的下述实施例中，尿素、3-[(3_胆酰胺丙基)_ 二乙铵]-1-丙磺酸 (CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙 酰胺(IAA)购自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-13C6,98% )购自剑桥同位素实验室；透 析胎牛血清购自Gibco公司；D9785细胞培养粉末、β -巯基乙醇、L-GlruL-Lys和L-Met购 自 Sigma 公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencing grade)购自 Promega 公司；SCX 柱禾Π SAX 柱以及PH缓冲液试剂盒购自Column Technology公司；!fepG2细胞株和L02细胞株购自中 国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞研究所的细胞库。在本发明的下述实施例中，使用的溶液/培养基配方如下不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基5%透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺酰氟 (PMSF)，ImM EDTA,苯甲异恶唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素 100mg/mL,两性霉素 B 0. 25mg/mL,制霉菌素 50U/mL。裂解液8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris 和 65mmol/L DTT。裂解缓冲液8mol/L尿素，40mmol/L Tris, 65mmol/L DTT。TBST =Tris 2. 42g/L，氯化钠 8g/L, Tween_201ml/L，用 HCl 调节 pH 到 7. 6。本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation, NESP)制备了肝细胞癌的癌组织与癌旁组织的蛋白质样品，并以13C标记的!fepG2和L02细 胞的蛋白质样品等比例混合物作为内标，采用CDIT技术结合以溶液内酶解结合阴阳多维 液相色谱串联质谱的蛋白质组学标记定量技术对其中的蛋白质进行鉴定并比较其表达量， 结果发现Rad9A在肝细胞癌组织中上调表达。免疫印迹实验、免疫荧光实验和免疫组织化 学实验证明Ph0Sph0-Rad9A-S387的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达。实施例1、肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备从东方肝胆外科医院获取5例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，该5例患者，均 由2名病理科医生确诊，患有肝细胞癌，5例患者的病理资料如表1所示。表1、5例肝细胞癌患者的病理资料
权利要求
一种细胞周期检查点调控蛋白的应用，所述细胞周期检查点调控蛋白为Phospho Rad9A S387，其特征在于，所述应用为用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记 是检测这种蛋白质在肝细胞组织中的表达量。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测这种蛋白质在肝细胞组织中的表 达量是检测这种蛋白质在肝细胞组织中是否均存在上调表达。
4.一种抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测 肝细胞癌的制剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体包括单 克隆抗体和多克隆抗体。
6.一种抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测 肝细胞癌的试剂盒。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体包括单 克隆抗体和多克隆抗体。
8.一种体外检测肝组织中Ph0Sph0-Rad9A-S387的表达是否异常的方法，其特征在 于，所述方法为检测待测肝组织中Ph0Sph0-Rad9A-S387的数量，并与正常肝组织中的 Phospho-Rad9A-S387的数量进行比较。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测为使用抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的 抗体进行检测。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗体包括单 克隆抗体和多克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了一种细胞周期检查点调控蛋白的应用。本发明提供的细胞周期检查点调控蛋白为Phospho-Rad9A-S387，其应用为Phospho-Rad9A-S387作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌的癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达，因此，可根据其在肝细胞中的表达量检测患者是否患有肝细胞癌。
文档编号G01N33/68GK101995472SQ20091005678
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者徐孟杰, 曾嵘, 李辰, 武祎, 阮宏强 申请人:中国科学院上海生命科学研究院