专利名称：一种检测脑钠肽的光学生物传感器及试剂制备方法
技术领域：
本发明涉及生物传感技术领域，是一种快速检测心衰标志物脑钠肽微量蛋白浓度
的光学生物传感器和所用试剂的制备方法，这种传感器可以快速检测总脑钠肽的浓度。
背景技术：
脑钠肽是心室分泌的激素样短肽，活性肽是脑钠肽-32，脑钠肽-32氨基端第7位 和第23位氨基酸残基(半胱氨酸)通过二硫键形成一个环型结构，此即为脑钠肽的功能 域。脑钠肽通过此构象与其相应的受体结合，在诸多病理生理过程中发挥作用，脑钠肽值与 美国纽约心脏学会(NYHA)对心功能不全(CHF)的分级标准密切相关，健康人分泌的脑钠肽 数量极少，心功能不全越严重脑钠肽值越高。因此脑钠肽的测定是心脏疾病的常规检测项 目之一。 目前，虽然脑钠肽含量在心衰诊断中有很高的价值，但脑钠肽水平的测定并没有 得到很好的普及，主要原因是检测方法的制约。脑钠肽检测的方法学研究一直是脑钠肽研 究的热点。检测脑钠肽的主要方法有免疫放射分析法(RIMA)，免疫荧光法等，RIMA法由于 半衰期短、检测时间长不适合于心脏病的急性诊断和小样本检测。Biosite公司推出的免疫 荧光法测定脑钠肽水平，达到了快速检测的目的，但需专门的荧光分析仪，成本很高，不适 合发展中国家。Bayer Diagnostics公司、Abbott公司也推出了脑钠肽测定试剂，但成本均 较高，每个测试费用均在25美元以上。研究表明降低检测成本，就会影响检测速度和灵敏 度。目前国内对脑钠肽的研究主要是利用进口试剂进行脑钠肽检测的临床应用，未见脑钠 肽光学生物传感技术及试剂的制备方法研究。因此，研发检测成本低、快速、高灵敏度的脑 钠肽光学生物传感器及试剂是近几年脑钠肽研究的热点。研制一种快速检测脑钠肽浓度的 光学生物传感器及试剂的制备方法，来降低脑钠肽检测成本，使脑钠肽检测易于在国内普 及，该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是公开一种检测脑钠肽的光学生物传感器及试剂制备方法，用于心 力衰竭的诊断、心力衰竭的康复判断、心力衰竭治疗的监控、评价左心室功能不良程度等。 本发明光学生物传感器，检测快速、灵敏度高、使用方便，并可以与便携式光子计数仪配套 使用，用于脑钠肽水平的检测。 为了达到上述目的，本发明的技术解决方案是 —种检测脑钠肽的光学生物传感器，包括基座、反应区、封装层；其中，基座上表面 纵向设有弧形凹槽，凹槽上表面具有毛细作用的横向微沟道，凹槽的两端为塑料封装层，凹 槽的顶部键合透光性极好的耐腐蚀绝缘封装层，凹槽的底部有一出样孔，出样孔贯通基座； 绝缘封装层上设有两个进样孔；凹槽、端部塑料封装层、顶部绝缘封装层围成的空间为传感 器的样品反应区；其样品反应区内，横向微沟道表面有一亲水纳米材料层；反应区外，在反 应区纵轴上，与两端塑料封装层相隔一间隙的各设置一微型电磁铁，两微型电磁铁的引出线并联； 使用时，反应区内加有反应试剂。 所述的光学生物传感器，其所述亲水纳米材料层为高分子纳米材料、硅烷、丙烯酸
非磁性材料中的一种，以获取低磁化强度和高比表面积的微沟道，该沟道不受磁场影响；端
部塑料封装层为聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)中的一种，两微型电磁铁通过两
端的塑料封装层对反应试剂中的磁纳米探针及其复合物进行磁化和富集。 所述的光学生物传感器，其所述微沟道长为0. 3 4. 0cm，宽为0. 1 20mm，深度
为0. 1 16mm ;微型电磁铁尺寸为6mmX6mmX6. 4mm。 所述的光学生物传感器，其所述反应试剂，包括脑钠肽磁纳米探针、偶联反应组合 试剂、缓冲液、封闭液、标记物标记的特异性抗体、底物显色液。 所述的光学生物传感器，其所述偶联反应组合试剂，包括l-乙基3-(3-二甲氨 基)碳二亚胺盐酸盐(EDC) ;N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS);戊二醛(glutardehyde)中的 一种或多种；其中，1-乙基3-(3_ 二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的浓度范围为1. 5 9. Omg/ml ;N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的浓度范围为3. 0 10. Omg/ml ;戊二醛的浓度范 围为5 30%。 所述的光学生物传感器，其所述缓冲液为甘氨酸_盐酸缓冲液(0. 05mol/L ;pH = 2. 2 5. 0)、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH = 2. 2 8. 0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓 冲液(0. 2mol/L;pH = 5. 8 8. 0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(1/15mol/L ;pH = 4. 92 8. 18)、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0. 05mol/L ;pH = 5. 8 8. 0) 、 Tris-HCl缓 冲液(0. 05mol/L ;pH = 7. 10 9. 00)、甘氨酸_氢氧化钠缓冲液(0. 05mol/L ;pH = 8. 6 10.6)、乙磺酸(MES)缓冲液中的任一种或几种。 所述的光学生物传感器，其所述封闭液为1 10%的脱脂奶粉，5 15%的赖氨 酸，或1 15%的牛血清白蛋白中的一种或它们的混合物。 所述的光学生物传感器，其所述标记物标记的特异性抗体为辣根过氧化酶标记的 脑钠肽抗体，碱性磷酸酶标记的脑钠肽抗体，荧光量子点标记的脑钠肽抗体，生物素标记的 脑钠肽抗体中的一种； 其中荧光量子点标记的脑钠肽抗体中使用的量子点是CdSe、 CdS、 ZnS、 InP、 InAs 及其核壳结构中的一种或几种。 所述的光学生物传感器，其所述底物显色液为1， 2 二氧环己烷衍生物(AMPPD)，或 底物液A、B套液中的一种；底物液A为鲁米诺与其增强剂体系，底物液B为双氧水缓冲液。
所述的光学生物传感器，其所述脑钠肽磁纳米探针的浓度范围0. 10 3. 00mg/ ml ;缓冲液浓度范围0. 03 3. 0mo1/1 ;封闭液浓度范围0. 03 2. 00mol/l ;标记物标记 的脑钠肽特异性抗体浓度范围0. 12 3. Omg/ml ;底物显色液浓度范围0. 8 3. 0mmo1/ L。 所述的光学生物传感器，其检测系统采用光子计数法检测，加入底物催化发光或 激发荧光量子点发光。 —种所述的光学生物传感器反应试剂的制备方法，其包括以下步骤 a)首先，在离心管中将1000 iil浓度为0. 5 3mg/ml的表面修饰有不同功能基
团的磁纳米粒子溶液、800ii1浓度为0. 1 0. 2mg/ml的脑钠肽抗体溶液或浓度为0. 1 0. 2mg/ml的生物素标记的脑钠肽抗体溶液混合均匀，在37t:下孵育10 60min，使其发生 縮合反应或通过生物素_亲和素作用发生反应，完成磁纳米粒子与脑钠肽抗体的偶联，经 过洗涤、沉淀、磁分离后得到具有高特异性的脑钠肽磁纳米探针。 b)将50iU脑钠肽磁纳米探针溶液活化后从进样孔2加入光学生物传感器； 80 ii 1脑钠肽待测样品从进样孔8加入光学生物传感器，通过控制电磁铁来实现磁纳米粒 子的运动，将两者混匀，然后从进样孔2加入20 ii 1标记物标记的脑钠肽特异性抗体溶液， 通过控制磁粒子的运动来混匀溶液，放在温度为35 37t:的恒温箱中放置20 30min。
c)通过磁分离，用PBS洗涤去掉多余的未参与反应的标记物标记的脑钠肽特异性 抗体溶液，洗涤液从出样孔10流出； d)向光学生物传感器内加入底物，通过酶催化底物发光或激发荧光量子点发光， 通过对光强的测定，达到对待测脑钠肽样品定量检测的目的。 所述的反应试剂的制备方法，其所述a)步中的脑钠肽磁纳米探针，其直径为30 500nm，其中制备脑钠肽磁纳米探针的磁纳米粒子表面修饰的活性基团有羟基、羧基、氨基、 巯基、亲和素中的任一种。 所述的反应试剂的制备方法，其所述b)步中的脑钠肽磁纳米探针与标记物标记
的脑钠肽特异性抗体，能识别脑钠肽抗原的不同表位，并能同时与脑钠肽抗原结合来进行
脑钠肽含量检测。 本发明的优点在于 本发明的光学生物传感器和反应试剂的制备方法与已经商业化的系列便携式光 子计数仪是兼容的，因此可以使检测简单快捷；由于该传感器的生产工艺采用先进的MEMS 工艺，既保证了检测的可靠性和灵敏度，又降低了检测成本；该传感器采用微沟道设计，使 进样更快，所需待测样品溶液少(20iU)。采用本发明的脑钠肽光学生物传感器测定脑钠肽 的灵敏度达到pg/mL。本发明提供的测定方法从检测脑钠肽样品开始，只需要20 30min， 可以得到检测结果；本发明的光学生物传感器操作步骤少，操作方便、简单，易于推广。
图1是本发明一种基于磁纳米探针的脑钠肽光学生物传感器立体示意图；
图2是本发明一种基于磁纳米探针的脑钠肽光学生物传感器三视图；其中图 2(a)是主视图；图2(b)是侧视图；图2(C)是俯视图；
图3是本发明中磁纳米探针制备示意图； 图4是本发明中待测抗原_荧光量子点标记抗体的磁纳米探针复合物制备示意 图。
具体实施例方式
见图1、图2，是本发明一种基于磁纳米探针的脑钠肽光学生物传感器，其中，微型 电磁铁1、7，进样孔2、8，绝缘封装层3，硅质基座4，塑料封装层5，微型电磁铁引线6，亲水 纳米材料层9，出样孔10。图2a为光学生物传感器主视图；图2b为光学生物传感器侧视 图；图2c为光学生物传感器俯视图。 本发明的一种基于磁纳米探针的脑钠肽光学生物传感器，包括基座4、反应区、封
6装层；其中，基座4上表面纵向设有弧形凹槽，凹槽上表面具有毛细作用的横向微沟道，微 沟道长为0. 3 4. 0cm，宽为0. 1 20mm，深度为0. 1 16mm。凹槽的两端为塑料封装层 5，端部塑料封装层5为聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)中的一种。凹槽的顶部键 合透光性极好的耐腐蚀绝缘封装层3，凹槽的底部有一出样孔10，出样孔10贯通基座4 ;绝 缘封装层3上设有两个进样孔2、8 ;凹槽、端部塑料封装层5、顶部绝缘封装层3围成的空间 为传感器的样品反应区；其样品反应区内，横向微沟道表面有一亲水纳米材料层9，亲水纳 米材料层9为高分子纳米材料、硅烷、丙烯酸非磁性材料中的一种；反应区外，在反应区纵 轴上，与两端塑料封装层5相隔一间隙的各设置一微型电磁铁1、7，两微型电磁铁1、7的引 出线6并联； 使用时，反应区内加有反应试剂。 本发明光学生物传感器，在反应区的横向毛细沟道内表面组装一层亲水纳米材料 的方法是通过在横向沟道内表面均匀滴加不同浓度的亲水性大分子高分子羧甲基纤维素 钠，37t:温度条件下干燥，获得凸凹相间的亲水纳米表面层。该方法进一步加强了沟道表面 的亲水性，增大了沟道的有效表面积，不仅有利于反应试剂的混合，而且可以有效保持钠尿 肽(B-typenatriuretic p印tide， BNP)光学生物试剂的生物活性。 本发明的脑钠肽光学生物传感器相应的反应试剂包括偶联缓冲液、清洗缓冲液、 封闭液、标记物标记的脑钠肽抗体和底物发光液。
反应试剂的制作是 首先将表面修饰有不同功能基团的磁性纳米粒子、脑钠肽抗体或生物素标记的脑
钠肽抗体混合制备成溶液，37t:孵育一定时间使其发生偶联反应或通过生物素_亲和素相
互作用，完成磁纳米粒子与脑钠肽抗体的偶联，组成具有高特异性的脑钠肽磁纳米探针。
将脑钠肽磁纳米探针溶液、待测脑钠肽样品溶液与标记物标记的脑钠肽特异性抗 体，通过电磁铁控制磁粒子的运动使溶液混合均匀，置于37t:孵育20min。通过洗涤、磁分 离去掉多余的未参与反应的标记物标记的脑钠肽特异性抗体，加入底物催化发光或激发荧 光量子点发光，能产生与被分析物脑钠肽的浓度对应的光强，从而达到对待测脑钠肽定量 检测的目的。 本发明的上述各目的、方法、特点和优点，通过下面结合附图和实施例可以得到更
加详细的说明。
实施例1 图1、图2 (a) 、 (b) 、 (c)是本发明设计的基于磁纳米探针的脑钠肽光学生物传感器 示意图。首先，采用微机电系统(MEMS)工艺在硅质基座上刻蚀出一个长为20mm，宽为5mm， 深度为4mm的微沟道，沟道的顶部键合透光性极好的玻璃(盖片)3，玻璃(盖片)3上有进 样孔2与进样孔8，硅质基座4的底部有一与微沟道相通的出样孔10。在反应区的沟道内 表面组装一层高分子羧甲基纤维素(CMC)纳米材料层9，置于37t:的干燥箱中干燥30min， 取出备用。 然后添加反应试剂，从进样孔2滴加50 ii 1脑钠肽磁纳米探针溶液，从进样孔8滴 加20 iU脑钠肽待测样品溶液，接通电磁铁7，该探针在电磁铁7和毛细沟道的共同作用下， 向右移动与待测脑钠肽样品溶液混合。然后从进样孔8加入60 ii 1辣根过氧化酶标记脑钠 肽抗体溶液，通过控制左右两电磁铁1、7并在毛细沟道的共同作用下，来实现磁纳米探针的移动，从而达到混匀反应物的目的。形成磁纳米探针_待测物_酶标抗体的磁纳米探针 复合物后，在磁场作用下，用200 ii 1 PBS缓冲液(含0. 5% Tween-20 ;0. 1 0. 5% BSA)清 洗3次，清洗液从底部出样孔10流出。然后加入50 化学发光液A(鲁米诺与增强剂体 系)和50ia化学发光底物液B(双氧水缓冲液)，混匀，置于暗处室温放置5min。用实验
室自制光子计数仪测其发光强度，从而测出待测样品溶液的浓度。
实施例2 1)脑钠肽特异性探针的制备 取200 ill氨基末端磁纳米粒子置于2ml离心管中，加入600 ii 10. 03mol/L吡啶溶 液，振荡混匀。用磁力架磁性分离除去上清液，重复上述操作两次。然后在离心管中加入 200 ill的10%戊二醛，置于37t:恒温摇床中220rpm振荡反应30min，使之混合均匀。磁 性分离，除去未反应的戊二醛，最后用200 ii 1 Tris-HCl缓冲液(0. 05mol/L ;pH = 7. 10 9. 00)清洗三次。 将脑钠肽抗体溶于PBS缓冲液中，配置浓度为0. 22 2. Omg/mL的抗体溶液。取 脑钠肽抗体溶液400iU加入到200 iil上述处理过的磁纳米粒子中，在37t:恒温摇床中 180rpm振荡反应6小时。置于磁力架，进行磁性分离，加入1000 iU甘氨酸_氢氧化钠缓 冲液(0. 05mol/L ;pH = 8. 6 10. 6)，将反应物置于37。C恒温摇床中200rpm振荡反应1小 时，终止偶联反应，制备得到脑钠肽特异性探针。将该磁纳米探针溶于200 ii 1 PBS缓冲液 中。 2)被分析物脑钠肽抗原浓度的测定 将磁纳米探针50 ii 1、待测样品溶液20 ii 1、辣根过氧化酶标记脑钠肽抗体溶液 80 iU按照实施例1的步骤加入到脑钠肽光学生物传感器中，通过电磁铁控制磁粒子运动 将反应试剂混匀，将该传感器置于37t:恒温箱中孵育30min，形成磁纳米探针_待测物_酶 标抗体的磁纳米探针复合物。用200ii1 PBS缓冲液(含O. 5%Tween-20 ;0. l 0.5% BSA) 清洗3次，用电磁铁7将探针复合物吸到传感器右端，洗脱液从左端出样孔10流出，关闭出 样孔。 向上述磁纳米探针_待测抗原_酶标抗体的磁纳米探针复合物中加入50 ii 1化学 发光液A(鲁米诺与增强剂体系)和50iU化学发光底物液B(双氧水缓冲液)混匀后，置 于暗处，室温放置5min。用实验室自制光子计数仪测其发光强度。
实施例3 1)脑钠肽特异性探针的制备 如图3，用移液器移取200iU(相当于lmg)表面标记亲和素的磁纳米粒子，置于 2ml离心管中，加入1000 ii 1 Tris-HCl缓冲液(内含lmmol/LEDTA、lmol/L NaCl， pH = 7. 4)，轻摇混匀磁粒，磁性分离，清洗2次。用100 iU PBS缓冲液将上述磁粒子溶解。
将100 ii 1生物素标记脑钠肽抗体溶于800 ii 1Tris-HCl缓冲液中，此时抗体浓度 为0. 1875mg/mL。将上述抗体溶液加入经过活化的磁粒中，置37°C 、 150rpm摇床中振荡反 应30min，磁性分离，除去上清液。在经过偶联反应的离心管中加入PBS缓冲液(含0. 05% Tween-20及0. 1 % BSA) lml，轻摇混匀，磁性分离，操作2次。 在上述离心管中加入lml封闭液(0. 5%鸡卵清蛋白，pH = 7.4PBS缓冲液)，在 恒温摇床中37 °C 、 180rpm振荡反应30min，磁性分离。在离心管中加入PBS (含0. 05 %Tween-20及0. 1% BSA)缓冲液lml，轻摇混匀，磁性分离。抽除上清液，重复清洗3次。加 入PBS缓冲液配制成浓度为2. 5mg/mL磁纳米探针溶液。
2)被分析物脑钠肽抗原浓度的测定 取上述制备的脑钠肽磁纳米探针50 1、待测样品溶液20 1、碱性磷酸酶标记抗 体溶液80iU混匀，按照实施例1的步骤加入到脑钠肽光学生物传感器中，通过电磁铁将反 应试剂混匀，将该传感器置于37t:恒温箱中孵育30min，形成磁纳米探针_待测物_酶标抗 体的磁纳米探针复合物。用200 ill PBS缓冲液(含0. 5% Tween-20 ;0. 1 0. 5% BSA)清 洗3次，用电磁铁7将探针复合物吸到传感器右端，洗脱液从左端出样孔10流出，关闭出样 孔。 向上述形成的磁纳米探针-待测抗原-酶标抗体的磁纳米探针复合物中加入 50 1底物发光液1， 2 二氧环己烷衍生物(AMPPD)，混匀，置于暗处室温放置15min。用实验
室自制光学传感器测其发光强度。
实施例4 1)荧光量子点标记脑钠肽抗体制备 取表面修饰羧基的水溶性荧光量子点(QDs)，用PBS缓冲液(pH = 7. 4)将其稀释 到lnmol/L，将EDC的PBS溶液加入到该QDs中，然后加入5. Omg/ml脑钠肽的PBS溶液， 20。C反应2小时，再加入200 ii 1 Tris-HCl缓冲液(内含lmmol/L EDTA、lmol/L NaCl， pH =7. 4)，轻摇混匀磁粒，终止反应，透析30min，制备出荧光量子点标记的脑钠肽抗体。
2)羧基修饰磁纳米粒子制备脑钠肽磁纳米探针 取200 ii 1，浓度为10mg/ml的表面修饰羧基的磁纳米粒子，加2mlPBS缓冲液进行 洗涤，磁性分离，除去上清液，重复操作2次，加入lmlPBS缓冲液将该羧基修饰磁纳米粒子 溶解备用。 在上述溶液中加入400 ii 1，浓度为0. 2mol/L的MES缓冲液，再加入600 ii 1，浓度 为5. Omg/mL的EDC溶液，将上述溶液混匀，在恒温摇床中37°C 、 180rpm振荡反应30min。
在上述溶液中加入脑钠肽抗体溶液300 ii 1，在恒温摇床中37°C 、220rpm振荡反应 8小时。通过磁性分离去掉上层清液，再加入甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0. 05mol/L ;pH = 9)进行封闭。用PBS缓冲液对该偶联复合物进行洗涤后，加入PBS缓冲液将该复合物配制 成浓度为1. 3mg/ml的磁纳米探针溶液。
3)被分析物脑钠肽抗原浓度的测定 如图4，取上述制备好的脑钠肽磁纳米探针50ia、待测样品溶液20iil、荧光量 子点标记抗体溶液80iU按照实施例1的步骤加入到脑钠肽光学生物传感器中，通过电磁 铁将反应试剂混匀，将该传感器置于37t:恒温箱中孵育30min，形成磁纳米探针-待测抗 原-荧光量子点标记抗体的磁纳米探针复合物。用200 ii 1 PBS缓冲液(含O. 5% Tween-20 ; 0. 1 0.5%BSA)清洗3次，用电磁铁7将探针复合物吸到传感器右端，洗脱液从出样孔10 流出，关闭出样孔。加入PBS缓冲液，形成磁纳米探针_待测物_荧光量子点标记抗体的磁 纳米探针复合物的PBS缓冲液。在激发光照射下，用实验室自制光学传感器测其发射光强， 从而实现对脑钠肽样品溶液浓度的定量检测。
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权利要求
一种检测脑钠肽的光学生物传感器，包括基座、反应区、封装层；其中，基座上表面设有纵向弧形凹槽，凹槽上表面是具有毛细作用的横向微沟道，凹槽的两端为塑料封装层，凹槽的顶部键合透光性极好的耐腐蚀绝缘封装层，凹槽的底部有一出样孔，出样孔贯通基座；绝缘封装层上设有两个进样孔；凹槽、端部塑料封装层、顶部绝缘封装层围成的空间为传感器的样品反应区；其特征在于样品反应区内，横向微沟道表面有一亲水纳米材料层；反应区外，在反应区纵轴上，与两端塑料封装层相隔一间隙各设置一微型电磁铁，两微型电磁铁的引出线并联；使用时，反应区内加有反应试剂。
2. 如权利要求1所述的光学生物传感器，其特征在于所述亲水纳米材料层为高分子 纳米材料、硅烷、丙烯酸非磁性材料中的一种，以获取低磁化强度和高比表面积的微沟道， 该沟道不受磁场影响；端部塑料封装层为聚乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯中的一种，两微型电磁 铁通过两端的塑料封装层对反应试剂中的磁纳米探针进行磁化和富集。
3. 如权利要求1所述的光学生物传感器，其特征在于所述微沟道长为0. 3 4. 0cm， 宽为0. 1 20mm，深度为0. 1 16mm ;微型电磁铁尺寸为6mmX6mmX6. 4mm。
4. 如权利要求1所述的光学生物传感器，其特征在于所述反应试剂，包括脑钠肽磁纳 米探针、偶联反应组合试剂、缓冲液、封闭液、标记物标记的特异性抗体、底物显色液。
5. 如权利要求4所述的光学生物传感器，其特征在于所述偶联反应组合试剂，包括 1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐；N-羟基硫代琥珀酰亚胺；戊二醛中的一种或多 种；其中，l-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐的浓度范围为1.5 9. Omg/ml ;N-羟 基硫代琥珀酰亚胺的浓度范围为3. 0 10. Omg/ml ;戊二醛的浓度范围为5 30%。
6. 如权利要求4所述的光学生物传感器，其特征在于所述缓冲液为甘氨酸-盐酸缓 冲液、磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠_磷酸二 氢钾缓冲液、磷酸二氢钾_氢氧化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸_氢氧化钠缓冲液、 乙磺酸缓冲液中的任_种或几种。
7. 如权利要求4所述的光学生物传感器，其特征在于所述封闭液为1 10%的脱脂 奶粉，5 15%的赖氨酸，或1 15%的牛血清白蛋白中的一种或它们的混合物。
8. 如权利要求4所述的光学生物传感器，其特征在于所述标记物标记的特异性抗体 为辣根过氧化酶标记的脑钠肽抗体，碱性磷酸酶标记的脑钠肽抗体，荧光量子点标记的脑 钠肽抗体，生物素标记的脑钠肽抗体中的一种；其中荧光量子点标记的脑钠肽抗体中使用的荧光量子点是CdSe、 CdS、 ZnS、 InP、 InAs 及其核壳结构中的一种或几种。
9. 如权利要求4所述的光学生物传感器，其特征在于所述底物显色液为1，2 二氧环 己烷衍生物，或底物液A、B套液中的一种；套液中，底物液A为鲁米诺与其增强剂体系，底物 液B为双氧水缓冲液。
10. 如权利要求4所述的光学生物传感器，其特征在于所述脑钠肽磁纳米探针的浓 度范围0. 10 3. 00mg/ml ;缓冲液浓度范围0. 03 3. Omo1/1 ;封闭液浓度范围0. 03 2. OOmol/1 ;标记物标记的脑钠肽特异性抗体浓度范围0. 12 3. Omg/ml ;底物显色液浓度 范围0. 8 3. Ommol/L。
11. 如权利要求1所述的光学生物传感器，其特征在于检测系统采用光子计数法检测，加入底物催化发光或激发荧光量子点发光。
12. —种如权利要求1所述的光学生物传感器反应试剂的制备方法，其特征在于包括 以下步骤a) 首先，在离心管中将1000iU、浓度为0. 5 3mg/ml的表面修饰有不同功能基团的 磁纳米粒子溶液、800 ii 1浓度为0. 1 0. 2mg/ml的脑钠肽抗体溶液或浓度为0. 1 0. 2mg/ ml的牛物素标记的脑钠肽抗体溶液混合均匀，在37"C下孵育10 60min,使其发牛缩合反 应或通过生物素_亲和素作用发生反应，完成磁纳米粒子与脑钠肽抗体的偶联，经过洗涤、 沉淀、磁分离后得到具有高特异性的脑钠肽磁纳米探针；b) 对50 iil脑钠肽磁纳米探针溶液活化后从进样孔2加入光学生物传感器；80 ill脑 钠肽待测样品从进样孔8加入光学生物传感器，通过控制电磁铁来实现磁纳米粒子的运 动，将两者混匀，然后从进样孔2加入20 iU标记物标记的脑钠肽特异性抗体溶液，通过磁 粒子的运动来混匀溶液，放在温度为35 37t:的恒温箱中放置20 30min。c) 通过磁分离，用PBS洗涤去掉多余的未参与反应的标记物标记的脑钠肽特异性抗体 溶液，洗涤液从出样孔10流出；d) 向光学生物传感器内加入底物，通过酶催化底物发光或激发荧光量子点发光，通过 对光强的测定，达到对待测脑钠肽样品定量检测的目的。
13. 如权利要求12所述的试剂的制备方法，其特征在于所述a)步中的脑钠肽磁纳米 探针，其直径为30 500nm，其中制备脑钠肽磁纳米探针的磁纳米粒子表面修饰的活性基 团有羟基、羧基、氨基、巯基、亲和素中的任一种。
14. 如权利要求12所述的试剂的制备方法，其特征在于所述b)步中的脑钠肽磁纳米 探针与标记物标记的脑钠肽特异性抗体，能识别脑钠肽抗原的不同表位，并能同时与脑钠 肽抗原结合来进行脑钠肽含量检测。
全文摘要
本发明一种检测脑钠肽的光学生物传感器及试剂制备方法，涉及生物传感技术，该传感器反应区为充有磁纳米探针溶液的毛细沟道，沟道内表面组装一层亲水纳米材料，沟道上表面为带有进样孔的透光绝缘封装层，沟道侧面封装塑料，在侧封塑料的两端安装有可控电磁铁。其试剂制备方法，是先制备磁纳米探针，然后将磁纳米探针、待测脑钠肽样品、标记物标记的特异性脑钠肽抗体通过电磁铁和毛细沟道的共同作用充分反应，形成磁纳米探针-待测脑钠肽抗原-标记抗体的复合物。加入底物催化发光或激发荧光量子点发光。通过传感器检测系统，快速检测出脑钠肽浓度。本发明传感器可快速检测样品中脑钠肽浓度，具有特异性高、灵敏度高、节省大量生物试剂等特点。
文档编号G01N33/543GK101793899SQ200910077950
公开日2010年8月4日 申请日期2009年2月4日 优先权日2009年2月4日
发明者刘儒平, 刘军涛, 刘春秀, 王蜜霞, 罗金平, 蔡新霞 申请人:中国科学院电子学研究所