专利名称：新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫应用领域，涉及养殖场、防疫检疫部门以及医疗机构等单位诊断
或检测新城疫病毒的技术。具体的讲，本发明是新城疫病毒的快速检测方法，以及一种新城 疫病毒的免疫荧光试纸条。
背景技术：
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或 禽肺脑炎病毒。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，不仅会引起 鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，严重时还可使鸡群全群毁灭。 一旦爆发，会给我国养禽业生 产带来巨大的经济损失。 目前，针对新城疫的监测和检测仍停留在原有的经典方法上，主要包括血凝抑制 试验(HI)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，琼脂糖扩散实验(AGID)，免疫荧光技术(IFT)，基因 扩增方法(PCR)等，这些方法有的耗费时间长，有的条件要求高，有的受外界因素影响较大 而削弱了其实用价值，在临床检测方面受到了很大的限制，不宜在基层推广。可见研究快速 检测新城疫病毒的诊断试剂以便对疫情进行现场及时监控，已经是目前畜牧生产中急需解 决的问题。 免疫层析是出现于八十年代初期的一种独特的免疫分析方法，免疫层析技术由 于广泛使用胶体金作为指示剂，所以又被称为胶体金检测法。目前该方法广泛应用于 样品初筛，但缺点是检测灵敏度较低，难以进行定量检测，而且检测结果不易记录和保 存。在免疫层析技术中，还有采用其他标记物作为指示剂的报道。Br皿ing等(J.Clin. Microbiol. 1999,81(1-2) :143-154)描述了一种以蓝色乳胶颗粒作为标记物的免疫层析 试纸条快速检测牛瘟病毒的方法。Ahn等(Clinica Chimica Acta, 2003， 332 :51-59)报道 了使用荧光染料荧光素作为指示剂用于免疫层析，可以获得较高的灵敏度，而且可以实现 定量检测。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高，
操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的专门用于新城疫病毒的快速检测免疫荧光试
纸条及其制备方法，填补目前尚未有新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条的空白。 —种用于新城疫病毒的快速检测荧光标记试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维
素膜、吸水垫和PVC背衬，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸
水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间
有搭接；所述结合垫上包被有新城疫单克隆抗体_荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上分别
包被有新城疫单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。 本发明的快速检测免疫荧光试纸条的制备及检测方法，包括以下步骤 (1)利用新城疫单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得新城疫单克隆抗体A和B ;
(2)选择尺寸为20-50nm荧光纳米颗粒作为标记物； (3)将步骤(1)制备的新城疫单克隆抗体A加入步骤(2)制备的荧光纳米颗粒中，得到新城疫单克隆抗体A-荧光标记物； (4)将步骤(3)制备的新城疫单克隆抗体A-荧光标记物包被在结合垫上；
(5)将步骤(1)纯化后的新城疫单克隆抗体B包被在硝酸纤维素膜上构成检测线；并将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线； (6)在PVC背衬上按顺序依次粘附所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，得到所述用于新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条； (7)将待检测的样品加载样品垫上过滤后，样品中的NDV与结合垫中的荧光标记抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的新城疫单克隆抗体B结合形成可见的结合线，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合，形成第二条； (8)观察结果阳性则出现两条结合线；阴性则仅出现一条质控线；试剂条无效则不出现线条。 本发明的制备方法，所述步骤(2)中荧光纳米颗粒采用反相微乳法制备，制备的荧光纳米颗粒尺寸大小为20-50nm。 本发明中的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公司。 与现有技术相比，本发明具有下列优点 1.本发明的新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(20分钟)等优点。 2.本发明的检测试纸条只需要简单仪器、设备，可现场操作，检测成本低。
3.本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。 4.本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在4-8t:下可保存六个月。
图1是本发明新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条的结构示意图包括样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)和PVC背衬(l)，其特征在于在PVC背衬上(1)依次连续粘附有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，所述结合垫(3)与所述硝酸纤维素膜(4)之间有搭接，所述硝酸纤维素膜(4)与所述吸水垫(5)之间有搭接，再由切条机切割成为适当宽度的试纸条。 图2是本发明新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条检测结果示意图。该试纸条的检测结果需使用凝胶成像系统，专用的荧光测量仪，或其他仪器进行辅助观察并记录结果。阳性结果呈现两条线，即质控线(6)和检测线(7)，而阴性结果只呈现一条质控线。
具体实施例方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体阐述。
快速检测新城疫病毒的方法，包括如下步骤 (1)本发明利用抗原抗体反应的特异性和荧光免疫层析简单快速原理，建立了新
4城疫病毒单克隆抗体A和B，用反相微乳法制备尺寸为50nm的荧光纳米颗粒作为标记物。
(2)荧光纳米颗粒与抗体的标记取亲和纯化的新城疫单克隆抗体A 200ii L(O. 5mg/mL)，用0. 025M碳酸盐缓冲溶液(pH 9. 5)4。C透析6h ;然后加入lOOy L悬浮 于碳酸盐缓冲溶液中的荧光纳米颗粒(8mg/mL) ， 4"C过夜；加入NaBH3CN，终浓度为5mM，反 应2h ;再加等体积的封闭液(10mM Tris 7. 8，含2% BSA、4X蔗糖)最后用10mM Tris 7.8 洗涤标记好的抗体3遍，然后用100iiL 10mM Tris 7. 8 (含0. 9% NaC1、0. 2% BSA、0. 1 % NaN3)悬浮，4t:保存。 (3)将荧光纳米颗粒标记好的新城疫抗体A稀释100倍均匀滴加在玻璃纤维素膜 上，每试纸条加入4 i！ L， 37t:温箱中烘烤lh。 (4)硝酸纤维素膜上用三维点膜仪分别喷上浓度为0. 5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体作 为质控线，浓度为0. 4mg/mL的新城疫单克隆抗体B为检测线。 (5)按照(4)加工好的硝酸纤维素膜、按照(3)加工好的玻璃纤维素膜和吸水纸的 先后顺序，将各部分粘贴在支撑板上制造成新城疫病毒的快速检测荧光标记试纸条。
(6)将待检测的样品加载样品垫上过滤后，样品中的NDV与结合垫中的荧光标记 抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的新城疫单克隆抗体B结合形成可见的结合线(检测 线，简称T线)，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合，形成第二条结合线 (质控线，简称C线)。 (7)观察结果阳性则出现两条结合线；阴性则仅出现一条C线；试剂条无效则不 出现线条。 以上实施方式仅用于帮助本领域技术人员更加全面的理解本发明，但并不对本发 明做任何限制。凡依照本发明的内容所做出的任何本领域等同的替换均属于本发明保护的 范围之内。
权利要求
一种用于新城疫病毒的快速检测荧光标记试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间有搭接；所述结合垫上包被有新城疫单克隆抗体-荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有新城疫单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。
2. 权利要求1所述的新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条的制备及检测方法，其特 征在于其步骤为1) 利用新城疫单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用 Protein G柱进行纯化，获得新城疫单克隆抗体A和B ;2) 制备尺寸为50nm荧光纳米颗粒作为标记物；3) 将步骤1)制备的新城疫单克隆抗体A加入步骤2)制备的荧光纳米颗粒中，得到新 城疫单克隆抗体A-荧光标记物；4) 将步骤3)制备的新城疫单克隆抗体A-荧光标记物包被在结合垫上；5) 将步骤1)纯化后的新城疫单克隆抗体B包被在硝酸纤维素膜上构成检测线；并将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；6) 在PVC背衬上按顺序依次粘附所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，得到所 述用于新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条；7) 将待检测的样品加载样品垫上过滤后，样品中的NDV与结合垫中的荧光标记抗体结 合，通过层析作用先与NC膜上的新城疫单克隆抗体B结合形成可见的结合线，未结合完的 荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合，形成第二条；8) 观察结果阳性则出现两条结合线；阴性则仅出现一条质控线；试剂条无效则不出 现线条。
3. 如权利要求2所述的用尺寸为50nm荧光纳米颗粒作为标记物，其特征在于荧光纳 米颗粒是指尺寸为50nm左右的，适合生物标记的荧光纳米颗粒。
4. 如权利要求1所述的使用新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条，其特征在于所 述形成的检测带和控制带检测是指使用凝胶成像系统，专用的荧光测量仪，或其他仪器进 行辅助观察并记录结果。
5. 权利要求1中所述的试纸条在检测新城疫病毒中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测新城疫病毒的荧光标记试纸条，属于动物疫病诊断检测方法技术领域。这种荧光标记试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间有搭接；所述结合垫上包被有新城疫单克隆抗体A-荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有新城疫单克隆抗体B构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。本发明的试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(20分钟)，检测成本低，操作简便，不需由专业人员操作等优点。
文档编号G01N33/569GK101701959SQ20091007909
公开日2010年5月5日 申请日期2009年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者张帆, 李锦丰, 邹明强 申请人:中国检验检疫科学研究院