专利名称：一种新的检测血清样本中结核抗体的方法和产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的检测血清样本中结核抗体的定量检测方法和产品及其 制备方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(M i^wcM/o^s， TB)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。 可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估 计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发 生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种 疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了 群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注 意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因， 发病率又有上升趋势。重组结核分枝杆菌16KD蛋白和结核分枝杆菌38KD蛋白及LAM3种抗原 均为结核杆菌特异性较高的抗原，存在于结核杆菌复合群中，具有较强的免疫 原性，适用于血清学诊断，近年来,免疫诊断方法研究得4^多，如酶联免疫吸附 试验(ELISA)、斑点免疫渗滤试验(DIGFA)、免疫印迹试验(Western blot)和斑点 免疫层析试验(DICA)等，大都采用上述抗原之一。原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竟争法、间接法等。 间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相 应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记抗体-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。悬浮芯片(suspension array)^称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex 公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞 仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已 广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分 析等领域。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优 化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测人血 清中的结核抗体，其定量检测能力如何，尚缺乏4莫型和评价。发明内容本发明涉及一种新的检测血清中结核抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包括 编码微球，例如027号编码孩i球，微球包被结核分枝杆菌的诊断抗原如16KD、 38KD蛋白和LAM蛋白、生物素标记的检测抗体羊抗兔IgG、羊抗人IgG，链 亲和素-藻红蛋白(SA-PE)及相关緩冲溶液。本发明提供上述检测结核抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，其特征在于， 在相关緩沖溶液中，编码微球用结核分枝杆菌的16KD和38KD蛋白或/和LAM 蛋白抗原包被、用生物素标记的检测抗体为羊抗兔IgG或/和羊抗人IgG、用链 亲和素-藻红蛋白(SA-PE)作为信号^f佥测物，所述编码微球可选任意编号的编 码微球。本发明提供一种结核抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法，该方法采用间接 法检测抗体的免疫学检测原理，其特征在于，在检测过程中所有反应可在96孔 滤板上或在微量离心管中进行，其中包括下列步骤(1 )每孔或管中加入含有 已包被捕获抗原，即结核分枝杆菌的16KD和38KD蛋白抗原的编码微球的工作 溶液，用清洗液清洗；(2)加入待测血清样品，孵育后清洗；(3 )加入用生 物素化的检测抗体，孵育后清洗；(4)加入链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，掉 育后清洗，(5)加入检测緩冲液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取MFI数值(即平均荧光强度)并分析数据判定^r测结果阴性或阳性。本发明还提供一种检测血清样品中结核抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方 法，其特征在于，该方法包括下列步骤(1)加入的阳性检测样品或标准品经 4倍梯度倍比系列稀释，(2 )制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应标准曲线，(3)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(4)根据剂量-反应曲线可判定方 法的动态检测范围，未知浓度样品可根据剂量-反应方程判断检测样品的浓度。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不 同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特 的色彩编号，每颗微球大小约5.5fim,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、 酶分析、受体和配体识别分析等，并才艮据不同研究目的而标定特定抗体、核酸 探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，5利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通 过检测通道。检测通道中设有两道激光， 一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目； 一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时， 两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中 的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微 球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本 中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利 用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应 等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确 性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。本发明人经过大量和深入的研究，对结核抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点1、 抗原包被量的改进结核分枝杆菌的蛋白抗原的包被量是成功检测的关键，本发明对包被微球 的抗原包被量进行实质性优化使血清样本的检测效杲非常良好，并且包被悬浮 芯片所需的抗原包被量很低，本发明的抗原包被量为3-9吗/1.25x〗()S个微球， 即6-36ng/2500-5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为5pg / 测试。2、 生物素标记的改进通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在4全测过程中，过量 的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗体连接，清洗时被抽 滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际4全测过程中，偶 尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此建"^义生物素标记抗体后， 尽量去除多余的生物素。以标记2 mg/mL的IgG (分子量150,000 ) 1 mL溶液为 例，需加入10 mM生物素溶液约27 pL。3 、 检测的灵敏度及动态范围本发明的血清样品结核抗体的蛋白质悬浮芯片定量检测方法与经典的免疫 学ELISA检测方法相比，结果有着很好的吻合性(相关系数R、0.9983 )。同时， 悬浮芯片方法灵敏度为检测滴度2.879 x l(T6，其高于ELISA方法的检测滴度 10-4,灵敏度增高IOO倍以上；并且悬浮芯片方法动态检测范围为2x l0—7~2x IO-2，其高于ELISA方法动态检测范围(即10" l(r2) 2个数量级。4、 方法的特异性本发明通过选用结核分枝杆菌的16KD和38KD蛋白、LAM蛋白为包被抗 原，以兔抗结核抗体为待测抗体，以生物素化的羊抗兔为检测抗体。本研究试 -验证明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫菌Fl抗原 多克隆抗体、兔抗SARSIgG干扰抗体存在条件下，本方法具有良好的特异性。5、 样品的检测能力本发明评价了悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过对人血清的检测， 初步证实了该方法在检测人血清中结核抗体的实用性。
图1: 027号微球包被TB16KD和38KD蛋白检测结核抗体示意图； 图2:蛋白悬浮芯片方法检测兔抗结核抗体剂量-反应标准曲线图； 图3: ELISA方法检测结核病人血清标准曲线图； 图4:蛋白悬浮芯片与ELISA方法检测结核病人血清的相关性。
具体实施方式
本发明涉及的检测结核抗体的蛋白悬浮芯片制备方法、检测及定量方法通 过下面的具体实施方式
作进一步i^L明，但本发明不以任何方式受该实施例的限 定。一、材料1.蛋白悬浮芯片的相关緩沖液(1 ) PBS緩冲液(pH7.4) : NaCl 137mmol/L; KC1 2.7讓ol/L; Na2HP04 10mmol/L; KH2P04 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44g Na2HP04和0.24gKH2PO4。用HC1调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后 在15psi ( 1.05kg/cm2)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。(2)微球清洗液PBS (pH7.4) , 0.05% TWEEN-20。(3 )微球活化緩冲液100 mM NaH2P04: 3g NaH2P04, 5N NaOH 1.5 mL, 定容于250mL， pH6.2。(4 )微球包被緩冲液0.05 M MES, pH 5.0: 2.44 g MES， 5N NaOH 0.15 mL, 定容于250mL。(5 )微球保存液PBS-TBN: PBS， 0.1%BSA, 0.02% TWEEN, 0.05%叠氮 化物，pH7.4。(6) 微球封闭液PBS-BN: PBS， 1%BSA, 0.05。/。叠氮化物，pH7.4。(7) 检测緩冲液PBS, 1%BSA, pH7.4。(8) 抗体稀释液PBS， pH7.4。。(9) 微球稀释液PBS， 1%BSA, pH7.4。(10) 样品稀释液PVX: PBS, 0.5%PVA, 0.8%PVP;(11 )生物素化抗体稀释液PBS-TBN(PBS, 0.1%BSA, 0.02% TWEEN-20, 0.05%NaN3, pH7.4)。(12) SA-PE稀释液PBS (pH7.4) , 1%BSA。 2.抗原与抗体本发明所使用的抗原为结核6KD蛋白、38KD蛋白和LAM蛋白。 本发明所使用检测抗体为兔抗TB IgG检测抗体为生物素化羊抗兔IgG和生 物素化羊抗人IgG，所述的羊抗兔IgG和羊抗人IgG。 二、待测样品的制备1、 目标分析物样品的制备目标分析物为兔抗结核IgG，干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目 标检测物外的其它抗体或其它蛋白质，包括鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG 、 兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。将上迷待 分析样品均溶于样品稀释液中，-41:保存。兔抗结核IgG的储备液浓度为0. 009mg/mL 。比较实验中，相同样品用于ELISA和悬浮芯片的才全测。将待分析的兔抗结核IgG用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度样 品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感 度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。2、 人血清样本的处理将人血清样本用样品稀释1: 10稀释，例如/ok清样本5pL加样品稀释液 50pL混匀后，作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。实施例l、检测结核抗体的蛋白质悬浮芯片的制备1、 捕获抗原包被编码微球本发明采用的027号编码微球购自美国BIO-RAD公司，编码樣O求用于标记 可以捕获禽流感抗体的结核16KD蛋白和38KD蛋白抗原，即利用结核16KD蛋 白和38KD蛋白包丰皮拔i球。A、编码贫b求的活化8取100|iL ( 1.25xl()6个)编码樣史球到1,5mL离心管中，14000 x g离心，小 心吸出并弃去上清液。加入100pL的微球清洗緩冲液悬浮，震荡并超声后14000 xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入lOO(iL的微球活化緩冲液，接着先加入 10nL新鲜配置的EDC ( 50mg/mL),再加入10fiL新鲜配置的50mg/mL的 Sulfo-NHS,高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20分钟。加入150^iL的 PBS (pH7.4),震荡后，14000xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入lOOpL 的PBS (pH7.4)悬浮编码微球。B、 用抗原包被编码微球取捕获抗原结核16KD蛋白和38KD蛋白抗原4-50pg加入到活化后的编码 微球中，用PBS緩沖液定容至500|iL，室温震摇2小时。14000 x g离心，小心 吸出并弃去上清液。用500^L的PBS緩冲液洗一次，14000 xg离心，小心吸 出并弃去上清液。加入250pL的封闭緩冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟， 14000 x g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500|iL的微球保存液洗涤编码微 球，16000 xg离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150(iL的微球保存液悬浮 编码微球，于4 °C避光保存备用。C、 包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm; 1/400mm、在普通显微镜 下计数。根据公式(每个大格数xlO、稀释倍数x体积(mL))计算微球数量。 2、检测抗体标记生物素A、 生物素的标记分别配制好浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计 算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或水上2小 时)，过柱脱盐后分装，-2(TC冻存备用。B、 抗体的用量以标记2 mg/mL的IgG (分子量150,000) 1 mL溶液为例，需加入10 mM生物 素溶液约27 pl。实施例2、悬浮芯片制备法条件的优化 1、微球包被抗原包被量的选择分另'Jk乂 lpg、 3pg、 6pg、 9pg、 12fig、 15(ig、 20jig ^!量包净皮lOOiiL纟扁;马为 027号的微球。经检测效果比较，以6pg/1.25x106个微球即12-24ng/2500"5000 个微球/测试包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。如图1所示，包被结核16KD蛋白和38KD蛋白抗原的027号微球均落在其正确检测区域内， 并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000),说明优化的悬浮芯片检测系统 可成功用于结核抗体的检测。 2、生物素化抗体的优化本发明分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧 基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体， 经质控过程检测效果比较，本实验中Sulfo-NHS-生物素标记检测抗体检测效果 较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述 的方法。本发明人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的抗体羊抗兔以1: 1000 稀释作为检测抗体进行检测兔血清中的结核抗体，检测结果显示生物素化斗全测 抗体Bio-羊抗兔抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果；2mg/mL生物素化 的抗体羊抗人以1: 2500稀释作为检测人血清中结核抗体的检测抗体，检测结 果显示生物素化检测抗体Bio-羊抗人抗体可获得高检测值和低背景值的检测效 果。实施例3、悬浮芯片样品制备、检测及结果判定1、 待测样品制备用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白悬浮芯片检测。2、 样品的检测及结果判定检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下1) 每孔加入50pL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵4由滤；2) 加入50 pL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；3) 加入50 适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温 避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4) 加入50|iL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分^t洗液洗涤并真空泵 抽滤；5) 加入125pL的检测緩冲液，经蜗旋重悬混匀；6) 用悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。3、 检测结杲判定根据试验研究结果与相关研究报道，本发明定义蛋白质悬浮芯片方法检测结核抗体的最低检出限(LOD值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测 物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI 均值加3倍标准差(SD ),即Cutoff值为=MFI (空白对照)+3倍标准差。 若检测结果高于LOD对应焚光强度值则判定为结核抗体检测结果阳性；若检测 结果低于LOD对应焚光强度值则判定为结核抗体检测结果阴性。 实施例4、悬浮芯片对结核16KD蛋白和38KD蛋白抗原特异性检测应用悬浮芯片检测方法分别对兔抗结核IgG 、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等进行 检测，根据实施例3中检测结果判定标准，仅兔抗结核IgG为阳性，其余干扰 抗体或蛋白均为阴性。说明本发明所建立的结核抗体的悬浮芯片检测方法与其 它测试抗体均不发生交叉反应或非特异反应。实施例5、悬浮芯片定量检测模型的建立1 、兔抗结核IgG标准曲线样品制备用样品稀释液将兔抗结核IgG标准品由2.41 l昭/mL以4倍倍比梯度稀释至 9.2pg/mL成系列浓度样品。2 、剂量-反应标准曲线的绘制按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统 检测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表抗体的浓度 (ng/mL) ， Y轴代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的 检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定，图2中兔抗TB血清的浓度 (ng/mL)分别为Sl:0.01 , S2: 0.04, S3: 0.15, S4: 0.59, S5: 2.36, S6: 9.42, S7: 37.68, S8: 150.69， S9: 602.75, S10: 2411.0。悬浮芯片系统根据检测结果拟合兔抗结核IgG剂量-反应标准曲线方程 FI = 2.34965 + (18524-2.34965) / [1 + (Conc / M1.022)"細73〗0777312 3、悬浮芯片检测兔抗结核IgG的灵敏度和动态范围根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即蛋白悬浮芯片方 法检测兔抗结核IgG的灵敏度为14.06pg/mL ( Cutoff - 9.4319 ,MFI(空白对 照)=6.25，标准差=1.0606)。本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓 度。根据标准曲线随着兔抗结核IgG浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增,当兔抗结核IgG浓度超过241 lng/mL时，抗原抗体的免疫反应达到饱和状态， MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再 检测。因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即悬浮芯片定量片全测 兔抗结核IgG的动态范围为2.36 ~ 241 lng/mL。实施例6、蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法检测结核抗体的比较1、 生物素-亲和素ELISA (BAS-ELISA)检测方法作为对比，生物素-亲和素ELISA采用包括下列步^l: 1)向普通ELISA樣么 孔板每孔加入50pL用PBS緩冲液稀释的结核16KD蛋白和38KD蛋白5-50ng, 4"C静止过夜；2) 加入封闭液，在37。C封闭2小时；3) 洗液洗3次，拍干；4) 加入检测样品，每孔50pL,室温放置40分钟；洗液洗3次，拍干；5) 加入适量生物素化纟企测抗体，每孔50^L,室温方t置30分钟；洗液洗3次， 拍干；6) 加入适量SA/HRP (辣根酶标记链霉亲和素)，50|117孔，室温放置3分 钟；洗液洗3次，拍干；7) 加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50nL/孔，室温 放置IO分钟；8) 用2M H2S04终止反应；9) 应用酶标仪测读A450nmlt值。2、 样品的悬浮芯片检测方法采用间接法测抗体的免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板 上进4亍。1 )每孔加入50pL含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤2次；2) 加入50 |xL检测样品，混匀后室溫避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽 滤3次；3) 加入50 适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温 避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤3次；124) 加入50pL的SA-PE，混勻后室温避光震摇IO分钟。用清洗液洗涤并真 空泵抽滤3次；5) 加入125(iL的检测緩冲液，经蜗3走重悬混匀；6) 用Bio-Plex悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。 3、两种检测方法的灵敏度和动态范围及相关性的比较制备的相同 一组结核病人血清样品用样品稀释液10倍比稀释同时应用悬浮 芯片和ELISA方法进行检测。绘制ELISA方法检测兔抗结核血清的标准曲线(图 中横坐标为样品浓度，纵坐标为吸光度值，坐标轴取对数-对数关系)，并与悬 浮芯片方法结果进行比较。根据两种方法标准曲线悬浮芯片方法如图2所示，灵敏度为2.879x10-6 (血清滴度)，线性检测范围2xlO_7~2xl(T2; ELISA方法如图3所示，灵敏度 为10—4 (血清滴度)，线性检测范围1(r4 10^可以得出结论检测相同结核病 人血清样品，蛋白悬浮芯片方法比ELISA方法具有更高的检测灵萄文度，即高100 倍；并且具有更宽的动态检测范围，即高2个数量级。另外，将两种方法检测结果在10—4~10-2范围内进行比较，如图5所示可以 判定蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法有良好的相关性，相关系数为0.9983。实施例7、 Ajk清样品的检测1、 人血清样品的准备将人血清用样品稀释液1: 10稀释(人血清样本5pL加样品稀释液50pL 混匀)后用于蛋白悬浮芯片检测。2、 人血清样品的检测1) 每孔加入50jiL含相应编码微;求的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2) 加入50 待检测人血清样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液 洗涤并抽滤；3) 加入50 适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人抗体，混匀 后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4) 加入50pL的SA-PE，混匀后室温避光震摇IO分钟。洗液洗涤并真空泵 抽滤；5) 加入125pL的检测ll冲液，经蜗i走重悬混匀；6)用悬浮芯片系统读取MFI数值，根据标准曲线，确定待检测人血清中 SARS抗体的浓度。经过多次重复试验，生物素化羊抗人IgG稀释比例选用1: 2500稀释，SA-PE 稀释比例选用1: 300稀释，经过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值 与其标准差的3倍之和为作为判断阴阳性的界值，即Cutoff值为1322.94,换算 为浓度值是6.6ng/mL,检测得到的MFI值如果大于1322.94,即血清中的结核 抗体浓度超过6.6ng/mL可视为结核抗体阳性可能被结核杆菌感染，如果MFI值 小于1322.94，即血清中的结核抗体浓度低于6.6ng/mL可判断为结核抗体阴性， 未感染结核杆菌。
权利要求
1、一种采用蛋白悬浮芯片检测血清样品中结核抗体的间接免疫学定量检测方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤(1)包被微球的捕获抗原为结核分枝杆菌的16KD和38KD蛋白和/或LAM蛋白；(2)向孔入加入含已包被捕获抗原编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待测血清样品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；(5)加入链亲和素-藻红蛋白，孵育后清洗；(6)加入检测缓冲液后混匀；(7)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(MFI)数值并分析数据判定检测结果。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用生物素标记的羊抗人IgG 作为才企测抗体，并且其与结核分枝杆菌的16KD、 38KD蛋白和/或LAM 蛋白组合组成间接法检测体系。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕获抗原 结核16KD蛋白和38KD蛋白抗原用量为3-9pg /1.25x106个编码微球或 6 36ng/2500"5000个孩"求/测试。
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体 羊抗人IgG的生物素为氣基活性的生物素。
5、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗 体Bio-羊抗人lgG以1: 2500稀释作为检测抗体进行检测。
6、 一种定量检测血清样品中结核抗体的蛋白悬浮芯片方法，其特征在于， 该方法包括下列步骤-.(1)加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释，所述梯度倍比稀释为4倍；(2)将系列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应焚光值(MFI); (3 )制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应曲线； (4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；(5 )未知浓度样品可才艮据剂量-反应曲线和方程判断未知样本中结核抗体 的浓度。其中加入的阳性检测样品为兔抗结核抗体。
7、 一种检测血清样品中结核抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包括编码微 球，作为包被微球抗原的结核16KD蛋白、38KD蛋白和/或LAM蛋白， 生物素标记的二抗作为检测抗体，链亲和素-藻红蛋白和适宜的緩冲溶液。
全文摘要
本发明涉及本发明涉及一种新的检测血清样本中结核抗体的定量检测方法和产品。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了以结核抗体为代表的病原菌抗体蛋白质悬浮芯片检测的开放性检测模式化平台。
文档编号G01N21/64GK101533021SQ20091008300
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者孙肖红, 宇 杨, 杨永莉, 静 王, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院